Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Samenvatting

Ca2 ⁺ signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 ⁺ signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca ^{2 +-indicatoren} Aequorin of Case12.

Samenvatting

Ontwikkelings-en omgevingsfactoren veroorzaken Ca ^{2 +} schommelingen in plantencellen. Stimulus-specifieke ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +} patronen worden waargenomen door cellulaire Ca2 ^+-bindende eiwitten die Ca ^{2 +} signaleringscascades initiëren. We weten echter nog weinig over hoe stimulus specifieke Ca ^{2 +-signalen} worden gegenereerd. De specificiteit van een Ca2 ⁺ signaal kan worden toegeschreven aan de verfijnde regulering van de activiteit van Ca2 ⁺ kanalen en / of transporteurs in reactie op een bepaalde stimulus. Om deze cellulaire componenten te identificeren en begrijpen van hun functies, is het cruciaal om systemen die een gevoelige en robuuste opname van Ca ^{2 +-signalen} op zowel het weefsel en cellulaire niveau te gebruiken. Genetisch gecodeerd Ca ^{2 +-indicatoren} die gericht zijn op verschillende cellulaire compartimenten hebben een platform voor live cell confocale beeldvorming van cellulaire Ca2 ⁺ signalen voorzien. Hier beschrijven we instructies voor het gebruik van twee Ca ^{2 +} detectiesystemen: aequorin gebaseerd FAS (film lijm zaailingen) luminescentie Ca ^{2 +} imaging en case12 gebaseerd live cell confocale fluorescentie Ca ^{2 +} imaging. Luminescentie beeldvorming met behulp van de FAS-systeem biedt een eenvoudige, robuuste en gevoelige detectie van de ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +-signalen} op het weefsel niveau, terwijl de live cell confocale beeldvorming met behulp Case12 biedt gelijktijdige detectie van cytosol en nucleaire Ca ^{2 +-signalen} met een hoge resolutie.

Inleiding

De plant cel reageert op het milieu via signalering die cel acties coördineert. Een vroege signaaltransductie gebeurtenis in antwoord op omgevingsstimuli een voorbijgaande Ca2 ⁺ stijging. Het patroon, of de handtekening van een tijdelijke toename van vrije Ca ^{2 +-concentratie} wordt gekenmerkt door zijn amplitude, frequentie en duur. Verschillende ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +} handtekeningen regelen verschillende cellulaire activiteiten ^1. Specifieke stimuli, zoals hitte, kou, zout, droogte, licht, of plantenhormonen, kunnen fine-tunen van de ruimtelijke en temporele activiteit van gelokaliseerde Ca ^{2 +-kanalen} en / of vervoerders, wat resulteert in specifieke Ca ^{2 +} handtekeningen. Hoewel Ca ^{2 +} transporters zijn goed gekarakteriseerd, is er weinig bekend over de moleculaire identiteit en de hoedanigheid van de Ca ^{2 +-kanalen} in planten ^1. Genetische screens voor mutanten met veranderde Ca2 ⁺ respons op stimuli benadrukken kan een effectieve ca. zijnOACH voor het identificeren van de componenten die Ca ^{2 +} handtekeningen te componeren. Onlangs gebaseerd verscheidene aequorine ^Ca2 detectiesystemen ontwikkeld dat genetische screens vergemakkelijken Ca2 ⁺ signaleringscomponenten in reactie op pathogenen attack en abiotische stress ^2-4.

Aequorine werd eerst gebruikt voor het detecteren Ca2 ⁺ signalen in planten in de vroege jaren 1990 ^5. Sindsdien aequorine is gericht op verschillende cellulaire compartimenten, zoals het cytoplasma ^{5, 6} nucleus, chloroplasten ^7, tonoplast ^{8, 9} mitochondria en stroma ^10, alsmede verschillende celtypen in de root celspecifieke Ca ² monitoren ⁺ signalen ^11. Aequorin gebaseerd Ca ^{2 +} metingen onthullen de ruimtelijke en temporele Ca2 ⁺ respons van een populatie van cellen op stimuli benadrukken. In de meeste gevallen, de Ca2 ⁺ responsen van afzonderlijke cellen unsynchronized in de reagerende weefsel ^4. Daarom garandeert Aequorin Ca ^{2 +} opname niet noodzakelijk verslag van de Ca ^{2 +} signaal in individuele cellen. In de afgelopen jaren, genetisch gecodeerde fluorescent eiwit (FP) gebaseerde Ca2 ⁺ indicatoren, zoals geel kameleon (YC) ¹² en gevallen12 ¹³ zijn gebruikt om Ca ^{2 +} studeren signalerend met hoge subcellulaire resolutie. YCS zijn fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) gebaseerde Ca ^{2 +-indicatoren,} met GVB en YFP varianten toegevoegd door de Ca ^{2 +} -bindende eiwit calmoduline en-calmoduline bindingspeptide M13. Calmoduline ondergaat een vormverandering als het bindt aan Ca ^{2 +,} daardoor brengt GVB en YFP dichter bij elkaar, wat resulteert in een verhoogde energie-overdracht (verbeterde FRET). De FRET level tijd, ruwweg berekend als de verhouding van YFP de GVB signaalintensiteiten, weerspiegelt de intracellulaire Ca2 ⁺ dynamiek. Verschillende YC versies zijn gebruikt in planten. YC3.6 was targeted naar het cytosol ^14,15, kern ^16, mitochondria ¹⁷ en plasmamembraan ^18, en YC4.6 en D4ER waren gericht naar de ER ^15,19, en D3cpv was gericht op de peroxisomen ^20. Transgene planten die YCS laat de live-cell imaging van Ca ^{2 +} dynamiek binnen de verschillende cellulaire compartimenten van verschillende celtypen. CASEs (vermoedelijk Ca lcium se nsor) zijn enkel circulair gepermuteerde fluorescerende eiwitten (cpFPs) drager zijn van een calmoduline en-calmoduline bindingspeptide M13. Na binding aan Ca2 ⁺ CASEs conformationele veranderingen ondergaan, leidend tot een toename van fluorescentie-intensiteit. De correlatie tussen fluorescentie respons van de behuizing en Ca2 ⁺ concentratie maakt intracellulair Ca2 ⁺ dynamiek kwantitatief te meten. De Case12 variant heeft 12-voudige toename van fluorescentie in de Ca ^{2 +} -saturated vormen. N. benthiminana planten kortstondig expressing Case12 of Arabidopsis planten stabiel tot expressie Case 12 werden gebruikt om Ca ^{2 +} signalering studeren in de verdediging en abiotische stress ^4,21. Asynchrone ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +-oscillaties} in de cellen reageren op pathogeen aanval, of om uitdroging van stress zijn geopenbaard met Case12 gebaseerd Ca ^{2 +} imaging.

Hier, gedetailleerde instructies voor Aequorin gebaseerd luminescentie beeldvorming van weefsel-en stimuli specifieke Ca ^{2 +} dynamiek in Arabidopsis zaailingen, en voor confocale beeldvorming van cytosol en nucleaire Ca presenteren we ^{2 +} dynamiek in Arabidopsis wortel cellen die zaak 12 luminescentie beeldvorming van FAS uiten kan worden aangepast aan de stress geïnduceerde Ca2 ⁺ dynamiek analyseren intacte planten of weefsels hier niet beschreven, of aan gemutageniseerde Arabidopsis plantpopulaties screenen voor mutanten met veranderde stress veroorzaakte Ca ^{2 +-signalen.} De live cell Ca ^{2 +} imaging setup kan worden aangepast aan Ca analyseren2+ dynamiek binnen de verschillende subcelluar compartimenten of in verschillende celtypes met andere Ca ^{2 +-indicatoren.}

Protocol

1 Aequorin Based Ca ^{2 +} Imaging Met behulp van de FAS-systeem

1. Bereid zaailingen voor luminescentie beeldvorming. Steriliseren zaden van Arabidopsis planten die Aequorin met 10% bleekwater oplossing met 0,01% Triton-100. Zaai de steriele zaden op een vierkante plaat (10 x 10 cm vierkante Petrischaal met rooster) met volle sterkte MS (Murashige en Skoog basaal zoutmengsel), 1% sucrose en 1,2% agar. Plaats platen verticaal in een groeikamer na stratificatie bij 4 ° C gedurende 2 dagen (Figuur 1A).
2. Breng de zaailingen op een film. Een zelfklevende folie (Figuur 1B) bovenop 7-10 dagen oude zaailingen groeien op de plaat. Duw de film van de hand om ervoor te zorgen dat de zaailingen zich houden aan de film (figuur 1C). Schil de film voorzichtig zodat de zaailingen blijven gehandeld op grond van de film (figuur 1D en 1E)
3. Incubeer de zaailingen met cofactor. Leg het eendhered zaailingen op de vierkante plaat (10 x 10 cm) die 15 ml van 2 ug / ml h-CTZ (coelenterazine) in water. Incubeer de zaailingen bij kamertemperatuur gedurende 4 uur gedurende de nacht (Figuur 1F).
4. Bereid je voor op luminescentie beeldvorming. Neem de film uit de h-CTZ oplossing en snijd het in het midden, de vorming van twee stukken. Leg elk stuk van de film met zaailingen zijde naar boven in twee verschillende platen. Laat de platen in het donker gedurende 5 minuten.
5. Acquire luminescentie afbeeldingen. In het donker plaats de twee platen naast elkaar op het stadium van het luminescentiebeeldvorming (figuur 1G). Acquire beelden onmiddellijk na toevoeging van 20 ml van stimuli oplossing aan de platen tegelijk.
6. Analyseer luminescentie afbeeldingen. Kies dezelfde weergave bereik voor alle luminescentie afbeeldingen. Snijd de regio van belang (ROI) en het genereren van de beelden als JPEG-bestanden (Figuur 2A). Als alternatief, exporteren de beelden als SPE-bestanden en ze te importeren in deImageJ beeldanalyse software. Set metingen voor de berekening van de gemiddelde grijswaarde van ROI. Selecteer dezelfde grootte van ROI gebied en meet de gemiddelde grijze en presenteren van gegevens als staafdiagrammen (figuur 2B).

2 live cell confocale Imaging Ca ^{2 +}

1. Bereid zaailingen voor confocale beeldvorming. Steriliseren zaden van Arabidopsis planten die case12 met 10% bleekwater oplossing met 0,01% Triton. Zaai de steriele zaden op een plaat met full kracht MS-zouten, 1% sucrose en 1,2% agar. Plaats platen verticaal in een kweekkamer na stratificatie bij 4 ° C gedurende 2 dagen.
2. Setup Imaging Chambers
   1. Monteer een imaging kamer met een glijbaan en dekglaasje (kamer A). Leg een stuk water gedrenkt watten op het midden van de dia. Daarna brengt een of twee 5 dagen oude zaailingen van de plaat op de bovenkant van water gedrenkt watten. Plak kleine stukjes klei elke hoek van een dekglaasje, eend plaats dekglaasje bovenop zaailingen een spleet (ruimte) tussen het dekglaasje en schuif (figuur 3A, linkerpaneel) creëren. Sluit een uiteinde van polyethyleen buis (0,58 mm diameter) met een 1 ml spuit en plaats het andere uiteinde van buis direct naast de kamer. Houd de slang vast met tape (Figuur 3A, rechter paneel).
   2. Monteer een imaging kamer met behulp van een kamer van plexiglas (kamer B).
      1. Een dun laagje siliconenvet ongeveer twee polyethyleenbuizen (0,58 mm diameter) en druk op de gecoate buizen in de kanalen aan elke zijde van de kamer van plexiglas (Figuur 3B linkerpaneel). Een dun laagje siliconen vet op het oppervlak van de kamer die de buis groeven bevat en op een dekglaasje aan het vet een zijde van de kamer opening (uitgesneden) te verzegelen.
      2. De overdracht van een vijf dagen oude zaailing van de plaat in de kamer en leg een stukje watten gedrenkt met water op de top of de zaailing. Verspreid siliconenvet op het andere oppervlak van de kamer, en de druk op een andere dekglaasje op de top te dichten. Sluit het uiteinde van een van de buizen een 1 ml spuit. Laat het uiteinde van de andere buis open (figuur 3B rechter paneel).
   3. Bereid een imaging kamer met behulp van een chambered afdekglas (kamer C). Steriliseer de chambered deksel glas met 70% ethanol en laat het op de motorkap tot het droog is. Voeg 0,6 ml of 0,2 ml onverdund MS medium bevattende 1% sucrose en 0,5% Phytagel in elk putje van een 2-well ruimte of 8-well kamer (Figuur 3C rechter paneel), respectievelijk. Steriliseren zaden en zaaien direct in een chambered deksel glas met een dunne laag van heldere gel en laat ze verticaal groeien gedurende 5 dagen (Figuur 3C).
3. Verwerven van beelden met behulp van een confocale microscoop. Om stress stimuli, zoals zout, koud of peroxide toepassen injecteer langzaam ongeveer 200 ui 150 mM NaCl, ice-cold water of 1 mM H ₂ O _2-oplossing in de kamer (kamer A of B) vlak voor het ophalen van afbeeldingen of zacht voeg 500 ul of 100 ul stimulus oplossing voor het putje van een 2 of 8-well kamer, respectievelijk . Maak foto's onmiddellijk na het aanbrengen van de stimulus-oplossing met behulp van een omgekeerde Nikon A1R confocale laser scanning microscoop met een 20X water immersie objectief (numerieke apertuur 0.75). Verzamel een tijdreeks afbeeldingen 4 sec intervallen met excitatie en emissie golflengten van 488 nm en 500-550 nm, respectievelijk, en met een resolutie van 512 x 512.
4. Beeldanalyse
   Met Nikon Elements, ROI's werden getrokken rond elke cel (of het oppervlak) van belang. Totaal intensiteit in elk ROI gemeten tijd met het dialoogvenster tijdmeting box (ImageJ kunnen in plaats daarvan worden gebruikt). Totale intensiteit metingen werden uitgevoerd en verwerkt in Datagraph. Ca ^{2 +} spike amplitude werd gedefinieerd als de piek intensiteit min rusten intensiteit, duur als the tussen aanvang en de voltooiing van een piek, en zolang de tijdsinterval tussen aangrenzende piek pieken van twee pieken. t-test werd gebruikt om de gemiddelden te vergelijken.

Resultaten

Mannitol, NaCl en H ₂ O ₂ werden gebruikt als proxies voor uitdroging, zout en oxidatieve stress stimuli, respectievelijk. Om te controleren of de zware metaalionen CU2 ⁺ synergie met een van deze drie stressstimuli vergeleken we de Ca2 ⁺ voor iedere stimuli in de aanwezigheid of afwezigheid van Cu2 ^+. Zoals getoond in figuur 2, FAS luminescentiebeeldvorming gebleken dat Arabidoposis zaailingen anders reageerde op uitdroging, zout en oxidatieve stre...

Discussie

We hebben een FAS-systeem gedemonstreerd voor het opnemen van de ruimtelijke en temporele Ca2 ⁺ respons van Arabidopsis zaailingen. Deze FAS Ca2 ⁺ opnamesysteem een eenvoudige, gevoelige en robuuste benadering die kan worden aangepast voor het meten Ca2 ⁺ dynamica veroorzaakt door verschillende stimuli naast de abiotische stress stimuli die hier worden gepresenteerd. Met behulp van dit systeem kunnen we gemakkelijk weefsel-of stimuli-specifieke ruimtelijke en temporele Ca ^{2 +} ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 cm x 10 cm vierkante Petri-schaaltje	VWR	60872-310
Zelfklevende film	VWR	60941-062
Polyethyleen buisjes	PerkinElmer	9908265
1 ml spuit	VWR	53548-000
Siliconenvet	Beckman	335148
2-kamerige gekamerde dekglazen	Nalge Nunc international	155379
8-kamerige gekamerde dekglazen	Nalge Nunc international	155409
Luminescentie beeldvormingssysteem	Princeton Instruments	N/A
Omgekeerd confocale laser-scanning microscoop	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Beeldvormingssoftware	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is de nieuwste versie
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All-purpose bleekmiddel	Elke lokale winkel	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS zout	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG