Een werkwijze voor het screenen en Validatie van Resistente Mutaties Tegen kinaseremmers

Samenvatting

Opkomst van genetische resistentie tegen kinase remmer therapie vormt een serieuze uitdaging voor een effectieve behandeling van kanker. Identificatie en karakterisatie van resistente mutaties tegen een nieuw ontwikkelde geneesmiddel helpt bij een betere klinische behandeling en de volgende generatie geneesmiddelen. Hier beschrijven we ons protocol in vitro screening en validatie van resistente mutaties.

Samenvatting

De ontdekking van BCR / ABL als bestuurder oncogen bij chronische myeloïde leukemie (CML) resulteerde in de ontwikkeling van Imatinib, die in feite aangetoond dat het potentieel van de kinase gericht op kanker door het effectief behandelen van de CML patiënten. Deze waarneming revolutie geneesmiddelenontwikkeling de oncogene kinasen betrokken bij diverse andere maligniteiten, zoals EGFR, B-RAF, KIT en PDGFRs richten. Echter, een belangrijk nadeel van anti-kinase therapieën is het ontstaan ​​van resistentie mutaties waardoor de doelstelling om verminderde of verloren affiniteit voor het geneesmiddel. Inzicht in de mechanismen die in dienst zijn van resistente varianten niet alleen helpt bij het ontwikkelen van de volgende generatie-remmers, maar geeft ook een impuls aan klinische behandeling met behulp van gepersonaliseerde geneeskunde. We meldden een retrovirale vector screening strategie voor het spectrum van resistentie verstrekkend mutaties in BCR / ABL, die heeft bijgedragen in de volgende generatie BCR / ABL remmers te identificeren. Met behulp van Ruxolitinib en JAK2 als een drug target paar, hier beschrijven we in vitro screening methoden die de muis BAF3 cellen die de willekeurige mutatie bibliotheek van JAK2 kinase gebruikt.

Inleiding

Proteïne kinasen zijn belangrijke regulerende enzymen van intracellulaire signaaltransductie, die schijnbaar moduleren elke cellulaire functie. Een goede beheersing van kinase gemedieerde signalering is van cruciaal belang om de homeostase en ontwikkeling, die meestal berust op goede regulering van kinasen, fosfatasen en de afbraak ervan door UPS (ubiquitine proteasoom systeem). Gedereguleerd kinases zijn in het centrum stadium van vele vormen van kanker en betrokken bij tal van ziekten bij de mens ^1. Menselijk genoom codeert voor meer dan 500 eiwitkinasen die zijn verbonden, direct of indirect, -400 menselijke ziekten ^2. Deze waarnemingen worden ondersteund het concept voor therapeutische doelwitten van kinases door kleine molecule inhibitoren ^3-5.

Het aantonen van ABL kinaseremmers, zoals Imatinib, in de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML) verstrekte de proof of concept van deze benadering ^6,7. Deze observatie niet alleen een revolutie in de mieri-kinase behandeling ook afgedwongen het idee om de genetische laesies in andere neoplastische ziekten voor therapeutische doelwitten, die leiden tot de ontdekking van oncogene mutatie in het JAK2 van polycytemie vera (PV) en patiënten met myeloproliferatieve neoplasmen (MPN) identificeren. Deze ontdekking grote belangstelling bij de behandeling van MPNs door zich te richten JAK2 met kleine molecule kinase inhibitoren. Nu, een tiental van JAK2 remmers in klinische studies en een van hen is onlangs goedgekeurd voor de behandeling van myelofibrose. Hoewel specifieke targeting van oncogene kinasen door kleine molecule inhibitoren bij kanker brengen veelbelovende resultaten, lijdt ook van ontwikkeling van resistentie tegen de behandeling. In feite, tot nu toe, de patiënten behandeld met kinase-remmers, zoals imatinib, gefitinib, Erlotinib en Dasatinib ontwikkelde resistentie mutaties voornamelijk door de overname van mutaties in het kinase domein waartoe drug targets ^8-10. Resistentie als gevolg van genmutatie benadrukt de beperkingen of gerichte monotherapie tegen oncogene kinasen, en is de volgende uitdaging in de ontwikkeling van steeds succesvolle chemotherapie. Mechanistische en functionele gevolgen van resistentie tegen geneesmiddelen moeten een achtergrond voor de keuze en het ontwerp van een gratis verbindingen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen te verstrekken. Mutaties die via in vitro schermen, blijkt een hoge mate van correlatie met die gevonden bij patiënten. Daarom, in vitro screenen op mutaties die resistentie voor een bepaald geneesmiddel doelparen in klinische of preklinische ontwikkeling helpt verlenen identificeren de resistentiepatronen die waarschijnlijk klinische terugval veroorzaken. De identificatie van deze mutante vormen is niet alleen nuttig bij de controle patiënten voor drug respons en terugval, maar eveneens essentieel voor het ontwerpen van robuustere volgende generatie remmers. Bijvoorbeeld, de ontwikkeling van de volgende generatie BCR / ABL remmers, nilotinib en Ponatinib, mogelijk gemaakt door een grotere mechanistic inzichten opgedaan met mutagenese, structurele en functionele studies.

Eerder hebben we de resultaten van onze scherm met willekeurige mutagenese van BCR / ABL het spectrum van mutaties die resistentie tegen remmers zoals imatinib ^11,12, PD166326 ¹² en AP24163 ¹³ onthullen gerapporteerd. De resultaten niet alleen gewezen op de mutaties die klinische resistentie en de ziekte van terugval, maar ook voorzien van de mechanistische begrip van resistentie tegen geneesmiddelen en beginselen voor de kinase functie ^11,14. Hier bieden we aanvullende methodologische detail, met behulp van ruxolitinib en JAK2 als een drug target paar, om een ​​bredere toepassing van deze screening strategie mogelijk te maken.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures in dit protocol werden uitgevoerd volgens de National Institute of Health richtlijnen voor de ethische behandeling en verzorging van dieren, en volgens een goedgekeurde IACUC gebruik dier protocol.

1. Cell Line Maintenance

1. Cultuur BAF3 cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en penicilline / streptomycine (100 eenheden / ml en 100 ug / ml) en kweekmedium WEHI cellen brachten. Groeien HEK293T cellen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en penicilline / streptomycine (100 eenheden / ml en 100 ug / ml). Handhaaf cellen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO2.

2. Plasmideconstructie

1. Kloon de muis JAK2 en haar oncogene isovorm JAK2-V617F in pMSCV-puro-GW door LR Clonase behulp van standaard recombinatie kloonprocedure.
2. Voor de constructie van luciferase-expressievector (pMSCV-Luc-Cherry-GW) gebruikt in vivo beeldvorming, amplificeren luciferase van pLVX-Tet-ON vector door PCR met primers (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG en LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) gevolgd door klonering in pENTR-SD-TOPO te pENTR-Luc, dat opwekking het luciferasegen overdragen retrovirale vector, pMSCV-Cherry-GW door recombinatie gemedieerde klonering gebruikmaking van LR-clonase.

3. Voorbereiding van Random Mutation Bibliotheek, screenen en identificeren van de mutaties

3.1) Willekeurige mutagenese

1. Kloon volledige lengte van JAK2 wild-type en de V617F mutatie naar pMSCV-puro-GW retrovirale vector met behulp van een commercieel recombinatie klonen technologie.
2. Gebruik 1 ug JAK2 V617F-plasmide-DNA te transformeren, XL-1 Red, E. coli cellen die defect in DNA herstelmechanismen zodat ze willekeurige mutaties nemen tijdens de replicatie. Meer specifiek, meng 50-100 ng DNA (meer dan 100 ng DNA vermindert transformatie-efficiëntie) 100 pi competente cellen in een voorgekoeld polypropyleen buis en geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten, voorzichtig schudden om de 5 min. Voor een goede bibliotheek dekking, gebruiken 4-6 buizen van competente cellen.
   OPMERKING: Meer dan 100 ng DNA vermindert transformatie-efficiëntie
3. Dompel de buis in een waterbad bij 42 ° C voor een heat shock van 45 seconden en incubeer op ijs gedurende 2 minuten. Voeg vervolgens 1 ml SOC-medium (2,0% trypton, 0,5% gistextract, 0,05% NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, en 0,4% D-glucose). Incubeer de buis bij 37 ° C onder schudden bij 225-250 rpm gedurende 90 min.
4. Plaat cellen uit elke buis op vier 10 cm LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline. Incubeer de platen gedurende 16-24 uur bij 37 ° C.
5. Volgende zichtbare kolonies, verzamel ze door het afschrapen van de platen met een steriele plaat schraper. Pool cellen van elke plaat en isolaat plasmide-DNA met een commercieel plasmide extractie kit.
   OPMERKING: Meestal kolonies zijn kleiner en neemt 18-24 uur te zijnzichtbaar omdat deze langzaam groeiende bacteriestammen. In dit stadium, beoordeelt de heterogeniteit van mutaties in de bibliotheek door restrictiedigestie met frequente snijder zoals Sau3A1 of Taq1 of sequencing.

3.2) De productie van retrovirale Supematanten en Transduction

1. Een dag voor transfectie, plaat 4 x 10 ⁶ HEK 293T cellen op 100 cm schalen in DMEM met 10% FCS, penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine.
2. De volgende dag, de plaats van de middelgrote en transfecteren de cellen met gemuteerd pMSCV-JAK2-V617F bibliotheek. Voor elke 10 cm plaat, meng 10 ug DNA (5 ug van het plasmide bibliotheek en 5 ug retrovirale inpak plasmide, pCLEco) met 40 ul van FuGENE tot een totaal volume van 400 pl met serumvrij DMEM medium. Incubeer de DNA en lipide mengsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Na 20 min wijs Voeg de DNA-lipide-complex druppel bovenop HEK293T cellen.
3. Na zes uur, veranderen de transfectie media with vers medium en incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C gedurende virusproductie. Na 48 uur incubatie, verzamel virale supernatanten gefiltreerd door een 0,45 urn filter Acrodisc.

3.3) selectie van resistente klonen in vitro

1. Voor resistente JAK2 V617F-mutanten, transduceren 100000000 BAF3 cel 100 ml virus supernatanten met een virale titer van 0.5-1 x10 ^6. Meer specifiek, meng 10 ⁸ cellen met 100 ml virussupernatant tot een totaal volume van 300 ml met RPMI medium, dat 10% serum en 24 ug / ml polyberene (eindconcentratie van ployberene 8 ug / ml). Verdeel deze cel mixers in meerdere zes well platen (4-5 ml per putje).
2. Centrifugeer de platen bij 1250 xg gedurende 90 min bij 25 ° C. Na centrifugatie Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur.
3. De volgende dag, bundelen de cellen bij elkaar en meng met ruxolitinib en medium met zachte agar en vergulde in six well platen. Voor elke geneesmiddelconcentratie, meng 10 ml getransduceerde BAF3 cellen (10-20 miljoen cellen) met een aangepaste hoeveelheid ruxolitinib in een 50 ml buis. Vul met water aan tot 40 ml met behulp van RPMI dat 20% serum. Voeg 10 ml van 1,2% agar aan de cellen, mixcarefully en plaat in zes well platen.
4. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende twee weken. Pluk de resistente kolonies met behulp van 0,2 ml pipet tips en subcultuur ze individueel in 24 well platen voor 3-4 dagen.
5. Oogst de resistente BAF3 cellen door centrifugatie bij 450 xg gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Isoleer het genomische DNA met een commercieel genomisch DNA isolatie kit. PCR versterken volledige lengte JAK2 cDNA van 100 ng genomisch DNA met primers (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG en mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) en lange-template uitbreiden high fidelity PCR-systemen.
6. Scheid de PCR producten met agarosegelelektroforese. Accijnzen het 3,4 kb van DNA-band die JAK2 codering frame en isoleren van het DNAeen handelspraktijk gelextractiekit. Sequentie de volledige lengte van cDNA met 8 interne primers (P1 - P8) verspreid over de coderende sequentie en het analyseren sequenties met commerciële software.

4. In Vitro Validatie van Resistant Mutaties

Veel celklonen dragen meer dan één mutatie, om de bijdrage van elke mutatie in fenotype te testen, genereren geselecteerde varianten door plaatsgerichte mutagenese middels pMSCV-JAK2V-617F-plasmide als matrijs.

1. Voeren gerichte mutagenese op pMSCV-JAK2-V617F plasmide met behulp van een commercieel mutagenesekit en oligonucleotiden ontworpen om puntmutaties te creëren. Bevestigen de identiteit van de mutant klonen door sequencing.
2. Transduceren BAF3 cellen met retrovirussen gemaakt met behulp van mutante plasmiden gevolgd met de selectie met behulp van puromycine op 1 ug / ml.
3. Plaat 10 ⁴ BAF3-JAK2 V617F-cellen (50 pi RPMI met 10% FCS) in elk putje van een plaat met 96 putjes. Apartly voeg 50 ul van de ruxolitinib bevattende media aan de putjes in de plaat (eindconcentratie: 0, 1, 3, 5, 10, en 20 uM) en incubeer de platen gedurende 60 uur bij 37 ° C.
4. Beoordeel cellevensvatbaarheid door toevoeging van 10 pl WST-1 reagens aan elk putje gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 2-4 uur. Record absorptie bij A450 met behulp van een plaat lezer. Voer alle testen in drievoud en plot gemiddelde extinctie tegen INCB018424 concentraties. Voer een best-fit sigmoïdale curve met een niet-lineaire curve fitting algoritme. Score de geneesmiddelconcentratie resulteert in 50% cel levensvatbaarheid als cellulaire IC50.
5. Vervolgens plaat zes miljoen BAF3 cellen die JAK2 varianten in zes putjes in RPMI medium dat 10% serum met toenemende ruxolitinib en gedurende 4-6 uur bij 37 ° C.
6. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 450 xg gedurende vijf minuten bij 4 ° C. Was de cellen eenmaal met PBS, en lyseren in 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM natriumfluoride, 2 mM natriumvanadaat en 5% glycerol, aangevuld met protease inhibitor cocktail en fosfataseremmers. Ultrasone trillingen de celsuspensie gedurende 1 min, gevolgd door toevoeging van 5x gel laadbuffer (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM DTT, 15% SDS, 10 mM benzamidine, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM natriumvanadaat , Protease cocktail, 50% glycerol en 0,001% broomfenolblauw) en denaturatie bij 70 ° C gedurende 5-10 minuten.
7. Los de eiwitten op een 8% SDS-polyacrylamidegel onder denaturerende omstandigheden. Voeren immunoblotting met de muis monoklonaal anti-phopsho STAT5. Strip de vlekken en opnieuw gesondeerd met een konijn polyklonale anti-SATA5 antilichaam. Visualiseer de banden met behulp van ECL-reagentia volgens de aanbevelingen van de leverancier.

5. In vivo Validation

1. Transduce BAF3 cellen die luciferase en kersen (getransduceerd met retrovirussen gemaakt van pMSCV-Luc-cherry GW) met virussen uiten JAK2-V617F en resistente varianten. Selecteer cellen die puromycineselectie voor de expressie van JAK2 en de weerstand varianten overleven.
2. Injecteer twee miljoen actief groeiende BAF3-Luc / kers cellen die JAK2-V617F en resistente varianten in 200 pl PBS tot 6 Balb / C-muizen via-staartader injectie.
3. Na drie dagen cel transplantaties, injecteren de muizen met ruxolitinib (100 mg / kg) tweemaal per dag gedurende twee weken.
4. Uitvoeren-luciferase gebaseerde bioluminescentie beeldvorming met een imaging-systeem. .
   1. Kortom, bereiden luciferine-oplossing door oplossen 300 mg 25 ml steriel gedeïoniseerd water, aliquot in kleinere volumes en opslag.
      OPMERKING: Bewaren luciferin bij -80 ° C en beschermen tegen licht tot gebruik.
   2. Injecteer 250 ui aan elke muis met IP 125 mg / kg per muis bereiken. Verdoven de muizen uit dezelfde groep samen met inhalatie van isofluraan (1,5% -2,0%) in een verzegelde doos. Solliciteer dierenarts zalf op the oog tot droog voorkomen.
      OPMERKING: De tijd genomen voor muizen om te slapen (10-15 min) toegestaan ​​luciferin activiteit piek. Houd de tijd consistente tussen de groepen om variatie te voorkomen.
5. Breng de muizen onmiddellijk naar beeldvorming kamer podium en anesthesie bij 1,5-2% isofluorane te behouden tijdens de beeldvorming procedures. Afbeelding muizen met sequentiële 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60 en 300 sec belichting. Maak foto's en kwantificeren bioluminescentie intensiteit van het gebruik van image acquisitie en analyse software. Volgende beeldvorming terug de muizen terug naar zijn kooi.
6. Voor in vivo chimerisme oogst totaal beenmerg cellen. Euthanaseren de muizen met _CO2 gedurende 5 minuten gevolgd door cervicale dislocatie. Oogst de botten en verpletteren in 4 ml koud PBS om het beenmerg te verzamelen. Analyseer het percentage kers positieve cellen onder de fluorescentie microscoop en te kwantificeren met behulp van FACS. Verzamel twintigduizend gebeurtenissen uit elk monster.

Resultaten

Opkomst van genetische mutaties vormt grote uitdaging voor de gerichte anti-kinase-therapie. Mutatie-studies, naast het verstrekken van mechanistische en functionele inzichten die instrumenteel in de selectie en het ontwerp van de volgende generatie drug ontwikkeling zijn, maakt het ook mogelijk een betere klinische behandeling en kan in de toekomst meer behulpzaam zijn voor gepersonaliseerde behandeling. In dit experiment tonen wij screening ruxolitinib resistentie mutaties in JAK2 V617F-kinase (figuur 1).

Discussie

De klinische succes van Imatinib behandelen CML blijkt niet alleen het potentieel van de targeting rouge kinases kleine molecule inhibitoren, maar ook ontdekt beperkingen van gerichte therapie: klinische terugval en ontstaan ​​van resistentie mutaties in het doelgen. Identificatie van resistentie mutaties helpt bij een betere klinische beheer en de ontwikkeling van de volgende generatie remmers. Dit protocol beschrijft een methode voor resistente mutaties in de beoogde gen te identificeren. Deze werkwijze gebruikt een w...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cel- en weefselcultuur
BaF3 Cellen	ATCC
HEK293T cellen	ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW	Een geschenk van Ross Levine
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW	Zelf gemaakt
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW	Zelf gemaakt
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW	Zelf gemaakt
pMSCV-V617F-Cherry.GW	Zelf gemaakt
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW	Zelf gemaakt
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW	Zelf gemaakt
pMSCV-Luciferase-puro.GW	Zelf gemaakt
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1X	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
Protamine sulfaat	Sigma	P3369	5 mg/ml stock in water
Trypan Blauw oplossing (0,4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinib)	ChemieTeK	941678-49-5
WST-1	Roche	11644807001
0,45 micron schijffilter	PALL	2016-10
70 micron nylon celfilter	Becton Dickinson	352350
Bacteriecultuur
XL-1 rood E. coli cellen	Agilent Tech	200129
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicilline	Sigma	A0166	100 mg/ml stockoplossing
Bacto agar	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Kits
Dneasy Blood& tissue kit	Qiagen	69506
Expand long template PCR systeem	Roche	1168134001
Wizard Sv gel en PCR clean up systeem	Promega	A9282
Pure Yield plasmid mini prep systeem	Promega	A1222
PCR Cloning Systeem met Gateway Technology met pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells	Invitrogen	12535029
Gateway  LR Clonase Enzym mix	Invitrogen	11791019
Muis reagentia
Vivo-Glo Luciferine in-vivo Grade	Promega	P1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulinesyringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortorstamper	Coor tek	60316 en 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
Instrumenten
NAPCO serie 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor centrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 geautomatiseerde celteller	Bio-RAD		Dit is niet nodig, men kan standaard hemocytometer voor celtelling gebruiken