In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer

Samenvatting

Protein arginine methylatie, gekatalyseerd door een klasse van enzymen nl. Proteïne arginine methyl transferase (PRMTs), het proces van enzymatische additie van methylgroep (en) arginines in eiwitten. De in-vitro-methylatie test is de meest betrouwbare instrument voor de beoordeling van de methylatie status van bekende of nieuwe PRMT substraten.

Samenvatting

Protein arginine methylering is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties in de kern. Protein arginine methylering kan worden geïdentificeerd en / of bepaald via proteomische benaderingswijzen en / of immunoblotting met methyl-arginine specifieke antilichamen. Echter, deze technieken kunnen soms misleidend zijn en bieden vaak vals-positieve resultaten. Het belangrijkste is dat deze technieken geen direct bewijs voor de PRMT substraatspecificiteit. In vitro assays methylatie, anderzijds, bruikbaar biochemische assays die gevoelig zijn en consistent tonen als de geïdentificeerde eiwitten inderdaad PRMT substraten. Een typische in vitro assay omvat methylatie gezuiverde, actieve PRMTs, gezuiverd substraat en een radioisotoop gemerkt methyl donor ^{(S-adenosyl-L-[methyl-3H]} methionine). Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol katalytisch actieve PRMT1, een alomtegenwoordig uitgedrukt PRMT familielid isoleren. Het methyl transferase activiteiten van de gezuiverde PRMT1 werden later getest op Ras GTPase-activerend eiwit bindend eiwit 1 (G3BP1), een bekende PRMT substraat in de aanwezigheid van ^{S-adenosyl-L-[methyl-3H]} methionine als methyl donor. Dit protocol kan niet alleen gebruikt voor het vaststellen van de methylatiestatus van nieuwe fysiologische PRMT1 substraten, maar ook voor het begrip van de basismechanismen van proteïne arginine methylatie.

Inleiding

Eiwit methylatie werd voor het eerst beschreven in 1968 ^1. Het was pas de eerste klonen van PRMT1 in 1996, dat de onderzoekers begonnen met het belang van deze post-translationele modificatie ² waarderen. Interessant is ongeveer 2% van arginine residuen in de eiwitten van nucleaire extracten worden gemethyleerd ^3, waarin de overvloed van deze wijziging. Arginine is een positief geladen aminozuur met een basische zijketen stikstof / s in de zijketens van arginine kan post-translationeel gemodificeerd door de toevoeging van een methylgroep, een proces dat arginine methylatie ^4-6. Arginine methylatie wordt gekatalyseerd door een klasse van enzymen weten., Eiwit arginine methyl transferases (PRMTs). Arginine kan zowel monomethylated of digemethyleerd en deze kunnen ofwel symmetrisch of asymmetrisch zijn, afhankelijk van het type PRMTs katalyseren de werkwijze ^4-6.

Eiwitten die worden weergegeven argininee-glycine rijke motieven zijn potentiële doelwitten voor-PRMT gemedieerde katalyse. PRMT-gemedieerde methylering van substraten is aangetoond dat eiwit-eiwit interacties, eiwit-nucleïnezuur interacties acid, eiwitfunctie, genexpressie en / of cellulaire signalering, die cruciaal zijn voor normale cellulaire homeostase ^7-9 moduleren. Om de biologische rol van proteïne arginine methylering begrijpen, zijn nauwkeurige, efficiënte en reproduceerbare assays vereist om de methylatiestatus van de geïdentificeerde PRMT substraten stellen.

In vitro assay methylatie, die de mogelijkheden van gezuiverde PRMTs evalueert methylering van hun substraten katalyseren, is een goed geaccepteerde test voor bestuderen arginine methylering ^10-12. Het succes van deze test hangt grotendeels af van de activiteit van het gezuiverde PRMTs. PRMTs kan worden uitgedrukt en gezuiverd uit bacteriën of zoogdiercellen ^10,11. Dit in vitro assay methylatie, als dm gedetailleerde in het protocol is gebaseerd op een werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Tini en collega ^10. In dit protocol, laten we in detail de stappen die betrokken zijn bij de expressie en zuivering van PRMT1 in zoogdiercellen. Het vermogen van de gezuiverde PRMT1 methylering van Ras GTPase-activerend eiwit katalyseren bindend eiwit 1 (G3BP1), een bekende PRMT substraat ^8, werd later onderzocht in aanwezigheid van ^{S-adenosyl-L-[methyl-3H]} methionine als methyl donor. Met deze assay kunnen we betrouwbaar de mogelijkheden van de PRMTs definiëren methylaat nieuwe of bekende substraten, die een eerste stap in de studie van proteïne arginine methylatie.

Protocol

1 Voorbereiding van de Expression Constructs

1. Voordat het protocol kloon PRMTs in zoogdierlijke expressievectoren met een N-eindstandige epitoop tag (Myc of HA) en het substraat in-frame met glutathion-S-transferase (GST) voor hoogactief eiwitexpressie en zuivering van bacteriële cel lysaten middels standaard moleculair biologische technieken.

2 Zuivering van PRMTs

1. Gebruik 100 mm kweekschalen menselijke bronchiale epitheelcellen (Beas2B) handhaven. Passage van de cellen om de 3 dagen en laat ze groeien tot samenvloeiing.
2. De dag voor transfectie, zaaigoed 7,5 x 10 ⁵ cellen in 10 ml kweekmedium in een 100 mm kweekschaal. Swirl gelijkmatig verspreiden de cellen en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2 incubator.
3. De volgende dag, zuigen de media en voeg 5 ml kweekmedium zonder serum en antibiotica. Wervelen en zuig het medium. Herhaal deze stap eenmeer tijd en tenslotte voeg 5 ml serum / antibioticumvrij medium en verder naar transfectie.
4. Verdun 6 ug plasmide DNA in 750 ul serumvrij medium in een steriele 1,5 ml plastic centrifugebuis.
5. In een 1,5 ml plastic centrifugebuis Verdun 30 pi transfectie reagens in 750 ul serumvrij medium.
6. Breng het verdunde transfectie reagens oplossing (stap 2.5) aan de buis met verdunde DNA (stap 2.4). Meng voorzichtig door en neer te pipetteren meerdere malen.
7. Incubeer de transfectie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
8. Na 15 min, pipet de transfectie mengsel voorzichtig op de cellen swirl gelijkmatig mengen en incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2 incubator.
9. Na 3 uur, zuig het medium bevattende mengsels transfectie van de cellen. Voeg vers medium celkweek aangevuld met serum en antibiotica.
10. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2incubator voor 48 uur.
11. Na 48 uur lyseren van de cellen in 1 ml lysis buffer (1x fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat en 1 ug / ml phenlymethyl sulfonyl fluoride). Verzamel de lysaten in een plastic centrifugebuis met een cel lifter en incubeer de lysaten op ijs gedurende 30 minuten.
12. Centrifugeer de lysaten bij 15.000 xg gedurende 10 min op een bench-top centrifuge de lysaten van celafval te verwijderen. [* Het is sterk aanbevolen om de expressie van HA-PRMT1 via immunoblotting van een monster van de lysaten met anti-HA-antilichamen, te bevestigen alvorens over te gaan tot de zuivering van de enzymen voor methylatie test.]
13. Voor zuivering van PRMTs, incubeer 3 mg cellysaten met 30 gl 50:50 suspensie van anti-HA affiniteitsmatrix in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en draai nacht bij 4 ° C in een buis rotator.
14. De volgende dag draaien de buizen bij 14.000 xg op een bench-top centrifuge gedurende 2 minuten om te verzamelende kralen. Verwijder het supernatant en was de kralen 3x met 1 ml RIPA-buffer [20 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA en 1% Triton-X-100] in elk wassen gevolgd door centrifugatie bij 14.000 xg gedurende 2 min. Na de derde maal, was de parels eenmaal met 100 ui methylering buffer (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM _MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 mM sucrose). Na het centrifugeren, de bovenstaande vloeistof. De korrels die de geïmmobiliseerde PRMTs klaar voor gebruik in de methylatie analyse. [* Het wordt sterk aanbevolen om de geïmmobiliseerde PRMTs direct gebruiken in de methylatie test.]

3 Zuivering van de ondergrond

1. Inoculeer een enkele kolonie van GST-G3BP1 BL21 getransformeerd in 5 ml Luria-Bertani (LB) medium dat 100 ug / ml ampicilline. Groeien de kweken overnacht bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm.
2. De volgende dag, de overdracht van de 's nachts cultuur tot 50 ml vers LB-medium en continue te groeien tot een _OD600 van 0,5-0,7 (Het duurt ongeveer 2 uur).
3. Wanneer de _OD600 0,5-0,7 bereikt, voeg isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM en verder cultuur nog eens 4 uur bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm.
4. Oogst de cellen door centrifugatie bij 1500 xg gedurende 10 min, en de pellet verwerkt voor zuivering GST of bewaar bij -80 ° C.
5. Resuspendeer de bacteriële pellet in 5 ml lysis buffer (1x PBS met proteaseremmers, 100 ug / ml lysozym, en 0,1% Triton-X-100) en incubeer de lysaten bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Op dit moment de lysaten troebele en visceuze weergegeven door het vrijkomen van bacteriële genomische DNA.
6. Scheer het genomisch DNA door sonicatie (10 pulsen van 1 seconde elk een amplitude van 30%).
7. Maak de lysaten door centrifugatie bij 15.000 xg gedurende 10 min en breng de heldere supernatant aan 15 ml buis. Als de supernatant niet duidelijk herhalen centrifugaleting proces nog een keer.
8. Ondertussen was het GST-sepharose korrels tweemaal met ijskoud PBS en een 50:50 suspensie van GST-sepharose in PBS. Voeg 200 ul van de GST-sepharose suspensie de gewiste bacteriële cellysaat en roteren bij 4 ° C gedurende 1 uur.
9. Na 1 uur centrifuge de buizen bij 500 xg gedurende 3 minuten om de kralen te verzamelen. Was de kralen 3x met ijskoude PBS.
10. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de kralen in 100 ul elutiebuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 30 mM glutathion) en roteren bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
11. Centrifugeer de buisjes bij 15.000 xg gedurende 2 minuten en giet het supernatant dat de gezuiverde eiwit in een plastic centrifugebuis. Voer SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) analyse van 5 ui van het gezuiverde eiwit samen met bekende hoeveelheden bovine serum albumine (BSA) bij de concentratie van het gezuiverde eiwit te schatten.

4 Methylation Assay

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit in een aangewezen voor radio-isotopen werk en in overeenstemming met de protocollen van de instelling op het uitvoeren van experimenten met radioactieve isotopen aparte ruimte.

1. Voeg 2 ug gezuiverd GST-substraat en een master mix met 1x methylering buffer (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM _MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 mM sucrose), 1 uCi S-adenosyl- L ^[methyl-3H] methionine, en water tot een eindvolume van 10 pi aan de geïmmobiliseerde PRMTs (stap 2.13) en incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 1 uur.
2. Na 1 uur, stop de reactie door het toevoegen van 10 pi van 2x SDS sample buffer. Na denaturatie van de monsters bij 95 ° C gedurende 10 minuten, scheid de monsters op een SDS-PAGE gel.
3. Later, overdracht van de gescheiden eiwitten uit de SDS-gel op nitrocellulosemembraan met een semi-droge elektroforetische overdracht.
4. Na de overdracht, bedek het membraan met eenutofluor (een autoradiografische beeldversterker) en schud gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na 2 uur, giet de autofluor en bewaar deze voor later gebruik. [* Label de buis als radioactief materiaal]
5. Snel lucht drogen het membraan op een filtreerpapier, sluit deze in een plastic zak en het membraan een röntgenfilm blootgesteld bij -20 ° C. Voldoende belichtingstijd varieert tussen 5-30 dagen.

5 Bevestiging van PRMT Expression en gelijke Laden van de ondergrond

1. Na het bereiken van voldoende blootstelling, breng het membraan een plastic doos met blokkerende buffer [Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBST + 3% vetvrije melk)] en schud gedurende 1 uur.
2. Gooi de blokkerende buffer als radioactief afval. Incubeer het membraan met anti-HA antilichaam (1: 1000 verdunning) in TBST nacht bij 4 ° C, met zachte wiegen.
3. Was het membraan met TBST 3x en incubeer de membraan met HRP-gelabeld anti-muis secundair antilichaam(1: 5000 verdunning) in TBST bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht schommelen.
4. Na 1 uur was de membraan met TBST 3x en chemiluminiscence detectie van proteïnes met een HRP-substraat.
5. Na detectie van het HA-gelabeld PRMTs Incubeer het membraan met Ponseau-S kleurstofoplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Snel Was het membraan 3x met water tot de GST-gelabeld substraten detecteren. Scan de afbeelding.

Resultaten

De mogelijkheden van HA-PRMT1 te methyleren GST-G3BP1 werden bepaald door een in vitro methylering assay. HA-gelabeld PRMT1 gezuiverd van Beas2B cellysaten werd tewerkgesteld in een methyleringsreactie met GST-G3BP1, en ​​1 uCi van ^{S-adenosyl-L-[methyl-3H]} methionine, zoals een methylgroep donor. PRMT1 kon efficiënt katalyseren de methylatie van het GST-G3BP1 (Figuur 1, bovenste paneel). Methyleringsreacties middels pull-downs uitgevoerd op lysaten van lege vector getransfectee...

Discussie

De hierin beschreven protocol wordt routinematig gebruikt om de methylatiestatus van de geïdentificeerde PRMT substraten stellen. Deze robuuste en consistente analyse zal ook de definitieve gegevens over de specificiteit van PRMTs voor hun substraten. De belangrijkste componenten voor het succes van deze test zijn: 1 Expressie van PRMTs in zoogdiercellen 2 Activiteit gezuiverd PRMTs, 3 Expressie en zuivering van substraat en 4 volledige western overdracht van de eiwitten aan het nitrocellulose membraan.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfectiereagens
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affiniteitsmatrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antilichaam	roche
Ponseau S	Fisher Scientific