De zachte agar-kolonievormingstest is een methode die wordt gebruikt om cellulaire ankeronafhankelijke groei in vitro te bevestigen. Het doel van dit protocol is om een strenge methode te illustreren voor de detectie van het tumorigene potentieel van getransformeerde cellen en de tumoronderdrukkende effecten van eiwitten op getransformeerde cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De Soft Agar Kolonie Formatie Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onafhankelijke groei zonder verankering is het vermogen van getransformeerde cellen om onafhankelijk van een vaste oppervlakte te groeien, en wordt beschouwd als een kenmerk van carcinogenese. De zachte agar-kolonievormingstest is een goed gevestigde methode voor het karakteriseren van deze mogelijkheid in vitro en wordt beschouwd als een van de strengste tests voor maligne transformatie in cellen. Deze test maakt ook een semi-kwantitatieve evaluatie van deze mogelijkheid mogelijk in reactie op verschillende behandelingsomstandigheden. Hier zullen we de zachte agar-kolonievormingstest demonstreren met behulp van een muislongcarcinoomcellijn, CMT167, om de tumoronderdrukkende effecten van twee leden van de Wnt-signaleringsroute, Wnt7A en Frizzled-9 (Fzd-9), te demonstreren. Gelijktijdige overexpressie van Wnt7a en Fzd-9 veroorzaakte een remming van kolonievorming in CMT167-cellen. Dit toont aan dat expressie van het Wnt7a-ligand en zijn Frizzled-9-receptor voldoende is om tumorgroei te onderdrukken in een muislongcarcinoommodel.
Inleiding
De zachte agar kolonievorming assay is een techniek veel gebruikt om cellulaire transformatie in vitro evalueren. Historisch andere test de clonogene assay beschreven door Puck et al. In 1956 werd gebruikt om het vermogen van cellen om kolonies te vormen 1 evalueren. In deze techniek werden cellen gedispergeerd op een kweekplaat en gekweekt in aanwezigheid van feeder-cellen of geconditioneerd medium noodzakelijke groeifactoren verschaffen. De beperking van deze techniek is dat het alleen informatie verstrekt over de vorming van kolonies. Normale cellen verhinderd verankering-onafhankelijke groei, door een bepaald type van apoptotische doo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de materialen en reagentia
- Label elk putje van een weefselkweek behandelde plaat met 6 putjes adequaat voor elke cellijn of aandoening onderzocht.
- Bereid 2x celkweekmedium door het oplossen van 1 g poeder medium en 0,2 g natriumbicarbonaat in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml.
- Geef dit medium door een 0,2 um filter te steriliseren.
- Voeg extra componenten nodig voor normale kweek van de cellijn van belang. Zo groeien CMT 167 cellijn in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine oplossing. Warm medium tot 37 ° C in heet water bad vóór gebruik.
- Bereid 1x ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De expressie van Wnt7A en Fzd9 in CMT167 cellen effectief in tumorsuppressie, zoals blijkt uit onze zachte agar kolonievorming assay. Voorlopig gebruikten we Q-PCR aangetoond dat Wnt7A en Fzd9 mRNA expressie in lage niveaus in CMT167 cellen. CMT167 cellen vertoonden lage niveaus van endogeen Wnt7A en Fzd9 vergelijking met MLE-12 cellen, een met SV40 getransformeerde murine long epitheliale cellijn (Figuur 1). We vervolgens getransfecteerd CMT167 cellen met twee retrovirale overexpressie vectoren die de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In vitro bevestiging van de tumor onderdrukkende functie van signaaleiwitten is moeilijk. Een van de meest rigoureuze testen waarover deze eigenschap onderzoeken is de zachte agar kolonievorming assay. Hier hebben we de zachte agar kolonieformatie test met behulp van een muizen longcarcinoomcellijn stabiel overexpressie Wnt7a en Fzd9 ten opzichte van zijn ouderlijke CMT167 cellijn geïllustreerd.
Er zijn een aantal belangrijke punten om te overwegen met betrekking tot de zachte agar .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een Merit Award van het Amerikaanse Department of Veterans Affairs en een NIH-subsidie R01CA1385282522717 aan RW.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Kankercellijn van belang | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cellen |
| Gepoederd RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Wordt gebruikt om 2x celcultuurmedium voor te bereiden. |
| Vloeibaar RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Wordt aangeduid als 1x celcultuurmedium. |
| Fetaal Runderserum | HyClone | SH30910.03 | Wordt gebruikt om celcultuurmedium aan te vullen. |
| Penicilline/Streptomycine | CellGro | 30-002-Cl | Wordt gebruikt in celcultuurmedium. |
| Difco Edele Agar | BD Biosciences | 214230 | Wordt gebruikt om 1,0% en 0,6% agar voor te bereiden. |
| Natriumbicarbonaat | Fisher | BP-328-1 | Wordt gebruikt in 2x celcultuurmedium. |
| Trypsine | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Steriele Flessenstopfilters | Fisher | 09-761-126 | Wordt gebruikt om 2x medium sterieel te filteren. |
| Lipofectamine Reagens | Invitrogen | 18324-020 | Wordt gebruikt in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Platen, Tissue-cultuurbehandeld | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Wordt gebruikt om foto's van kolonies te maken. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Wordt gebruikt om celkolonies te tellen. | |
| 15 ml Conische buizen | |||
| 50 ml Conische buizen | |||
| 250 ml Erlenmeyerkolven | |||
| Microgolfoven | |||
| 5 ml Serologische pipetten | |||
| Pipettenusher | |||
| Micropipet | |||
| Hemacytometer met dekglas | |||
| Pipettipjes | |||
| Omgekeerde Lichtmicroscoop | |||
| Centrifuge | |||
| Hittebestendige Handschoenen | |||
| Saran Wrap | |||
| IJsemmer |
Referenties
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
