Methodenartikel

Experimentele en Imaging technieken voor de behandeling fibrinestolsel Structuren in normale en zieke Staten

DOI:

10.3791/52019

⸱

1 april 2015

 ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit manuscript worden experimentele technieken gepresenteerd, inclusief bloedvoorbereiding, confocale microscopie en lyse-snelheidsanalyse, om de morfologische verschillen tussen normale en abnormale stolselstructuren als gevolg van ziektoestanden te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibrine is een extracellulair matrixeiwit dat verantwoordelijk is voor het behoud van de structurele integriteit van bloedstolsels. Er is de afgelopen jaren veel onderzoek gedaan naar fibrine, waaronder onderzoek naar de synthese, structuur-functie en lysis van stolsels. Er is echter nog steeds veel onbekend over de morfologische en structurele kenmerken van stolsels die voortvloeien uit patiënten met een ziekte. In deze onderzoeksstudie worden experimentele technieken gepresenteerd die de mogelijkheid bieden om morfologische verschillen van abnormale stolselstructuren te onderzoeken als gevolg van ziekten zoals diabetes en sikkelcelanemie. Ons onderzoek richt zich op de bereiding en evaluatie van fibrine stolsels om morfologische verschillen te beoordelen met behulp van verschillende experimentele tests en confocale microscopie. Bovendien wordt ook een methode beschreven die een continue, real-time berekening van lysissnelheden in fibrine stolsels mogelijk maakt. De hier beschreven technieken zijn belangrijk voor onderzoekers en clinici die comorbide trombotische pathologieën willen verduidelijken, zoals hartinfarcten, ischemische hartziekten en beroertes bij patiënten met diabetes of sikkelcelanemie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Letsel aan endotheliale bekleding van een bloedvat wordt hersteld door de hemostatische reactie of de vorming van een bloedstolsel. Wanneer bloed doordringt in de extracellulaire matrix, weefselfactoren activeert bloedplaatjes stroom die initiatie van de coagulatie cascade vergemakkelijken. De belangrijkste mechanische componenten van dit genezingsproces is de fibrine matrix, samengesteld uit fibrine vezels die zeer elastisch, en kan grote krachten 1-4 ondersteunen. Veel onderzoekers hebben de vorming van structuur en functie van fibrine uitgebreid bestudeerd in de afgelopen decennia 5-13.

Patiënten met ziekten zoals diabetes mellitus en sikkelcel hebben een verhoogd risico op trombotische complicaties zoals myocardinfarct, ischemische hartziekte, en lijnen 14-19. Meer dan 2 miljoen mensen zijn met nieuw gediagnosticeerde diabetes mellitus elk jaar in de Verenigde Staten. Er zijn twee types van diabetes: Type I, waarbij delichaam niet in slaagt om voldoende hoeveelheden insuline, en type II, waar het lichaam resistent wordt voor insuline te produceren. Bij patiënten met diabetes, cardiovasculaire ziekte (CVD) is de oorzaak van 80% van de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met de ziekte 20,21.

Sikkelcelziekte (SCZ) is een erfelijke bloedziekte die meer dan 100.000 mensen in de Verenigde Staten 22 beïnvloedt. SCD is een puntmutatie ziekte die rode bloedcellen veroorzaakt halvemaanvormige worden, waardoor het moeilijk voor de cellen door het bloed vasculatuur 23 te passen. Beide ziekten vergroten de kans op het ontwikkelen atherotrombotische omstandigheden in het lichaam. Eén van de redenen hiervoor is een gevolg van veranderde fibrine structuur en functie in zieke toestanden 14,24-26.

Zowel diabetes en sikkelcelziekte, is hypercoagulatie en hypofibrinolysis activiteit die atherotrombose en cardiovasculaire ziekte induceert (CVD) in vergelijking met gezonde patiënten 17,27,28. Het is bekend dat hypofibrinolysis bevordert progressie van atherosclerose en wekt terugkerende ischemische gebeurtenissen voor patiënten met premature kransslagaderziekte 29. In de huidige manuscript, onderzochten we de rol van fibrine fysische eigenschappen in deze specifieke setting. Fibrinestolsel structuren niet zieke patiënten bestaan ​​uit dunne vezels, grotere poriën, en meestal minder dichte 14,24. De toegenomen porositeit en minder dichte fibrinestolsels bij gezonde patiënten zijn gevonden fibrinolyse 16 vergemakkelijken. In hyperthrombotic aandoeningen zoals diabetes en sikkelcelziekte, is er een toename van fibrinogeen productie, waardoor het fibrinogeen concentratie toenemen van normale niveaus van 2,5 mg / ml bij gezonde patiënten 30-33. Fibrine stolsels gevormd in diabetespatiënten gevonden minder poreus, stijver te zijn, meer vertakkingspunten en dichtere vergelijking met gezonde, niet-diabetic patiënten 14,24,33-35. De gewijzigde fibrine structuur is een gevolg van glycosylering mechanismen die optreden in de bij stolselvorming eiwitten. Niet-enzymatische (onomkeerbare) glycation treedt op wanneer glucose moleculen binden aan lysine residuen op de fibrinogeen molecuul, dat menselijke factor XIII bis (FXIIIa) niet goed verknoping glutamine en lysineresiduen 33,36,37 remt.

De structuuranalyse van fibrine netwerk is uitgebreid recent bestudeerd. In het bijzonder hebben onderzoekers elektronenmicroscopie en 3D reconstructie van fibrine netwerken 38, onderzocht hoe zowel intravasculaire (endotheel) cellen en extravasculaire (fibroblasten en gladde spier) cellen beïnvloeden fibrine structuur 39, gebruikt viscoelastische en spectraalanalyse in fibrine structuren 40 analyseren, en benut ontwikkelde correlaties tussen fibrine structuur en mechanische eigenschappen met behulp van experimentele en computationele benaderingen 41 . De focus van de huidige studie was om te stollen structuren te formuleren onder gesimuleerde diabetische en sikkelcelziekte trombose voorwaarden en confocale microscopie te gebruiken voor onderzoek naar de structuur en functie van de stolsels in zieke toestanden. Fibrinestolsels gevormd uit humaan fibrinogeen, humaan trombine en FXIIIa. De stolsels werden gelyseerd met plasmine. Om diabetesvoorwaarden simuleren, verhoogde concentratie van fibrinogeen werd geïncubeerd in glucoseoplossing in vitro fibrinogeen glycatie induceren. Aan sikkelcelanemie stolling omstandigheden te simuleren, werden verhoogd fibrinogeen concentraties gemengd met sikkelcelziekte hematocriet verzameld van patiënten zoals eerder gedaan door onze groep 42. Deze methoden werden gebruikt om de structuur en functies betrokken in fibrine stolselvorming en fibrinolyse onder ziektetoestanden, alsmede de mechanismen die CVD induceren onderzocht. Op basis van de huidige informatie over deze ziekten, de geglyceerde fibrinestolsel structuren waren dichter met minder eennd kleinere poriën. De fibrine stolsels met rode bloedcellen van sikkelcel patiënten (RBC) werden ook dichter en weergegeven aggregatie van de rode bloedcellen en fibrine geagglomereerde clusters. Dit is een gevestigde verschijnsel dat eerder 43 bepaald. Ook werd verondersteld dat de fibrinolyse percentage significant lager in geglyceerd fibrinestolsels met en zonder verminderde plasmine vergelijking met gezonde, normale fibrine is. De resultaten toonden dat voor geglycosileerd fibrinestolsels significant verschillend lysis coëfficiënt resulteert alleen in omstandigheden van verminderde concentratie plasmine waargenomen. Deze experimentele techniek van het gebruik van confocale microscopie biedt aanzienlijke voordelen boven andere beeldvormende technieken omdat de cellen en eiwitten blijven in hun natieve toestand, waarbij het vangen van real-time video van de stollingsactiviteit mogelijk maakt. Deze methode van synthetisch inducerende stolling is ook goedkoper en meer tijd efficiënter dan het verkrijgen van monsters van patiënten en te filteren op individueleeiwitten en enzymen. Bovendien, door gescheiden eiwitten en enzymen om stolsels synthetiseren, de stolsels werden gestandaardiseerd zodat er geen variabiliteit tussen monsters als gevolg van andere eiwitten in het plasma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Het volgende protocol houdt zich aan de door de Institutional Review Board (IRB) in te stellen aan de Georgia Tech richtlijnen.

1. bloedafname en rode bloedcellen isolatieprocedure

  1. Verzamel 40-120 ml bloed donoren in 10 ml gehepariniseerde Vacutainer buizen. Start PBMC (perifere bloed mononucleaire cellen) isolatie binnen 4 uur van de collectie. Gedurende deze tijd, blijven bloed bij KT.
    OPMERKING: O / N opslag van bloed in RT of in 4 ° C wordt niet aanbevolen, omdat dit zal leiden tot lagere PBMC opbrengst.
  2. Verdun volbloed 1: 1 in ijskoude (4 ° C) steriel PBS.
  3. Pipetteer 10 ml van ijskoude hydrofiele polysaccharide in een lege, steriele 50 ml conische buis. Zacht overdracht verdund volbloed bovenop de hydrofiele polysaccharide.
  4. Gebruik een pipet 25 ml in slow-instelling en de pipet bloed langs de kant van de buis heel langzaam. Zorg ervoor dat het bloed niet wordt gemengd met de saccharide vóór Centrifugation omdat de hydrofiele polysaccharide is giftig voor cellen en anders de PBMC rendement lager.
  5. Centrifuge bloedmonsters gedurende 30 min bij 400 xg bij 4 ° C. Indien beschikbaar, verminderen de rem snelheid van de centrifuge helft van maximum betere scheiding na centrifugeren.
  6. Zuig uit het plasma / bloedplaatjes fractie van de gecentrifugeerd bloedmonster. Aspireren voorzichtig de hydrofiele polysaccharide laag direct boven de verpakte RBC laag.
  7. Verzamel 8-10 ml van verpakte RBC en verdunnen 1: 1 met niet-steriele 0,9% NaCl zoutoplossing.

2. confocale microscopie Evaluatie van Geglyceerde Clot Structures (Simulated Diabetische Klonters)

  1. Ontdooi menselijk fibrinogeen en fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat bij 37 ° C.
  2. Pipet het volgende in een 0,5 ml afgestudeerd microcentrifugebuisje.
    1. Voor de gezonde, normale fibrinogeen stolsels, mengen menselijk fibrinogeen met 10% fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeenconjugaat in 50 mM Tris / 100 mM NaCl buffer bij een concentratie van 5 mg / ml.
    2. Voor kunstmatig geglyceerd fibrinogeen (simuleren diabetische stolsels), incubeer menselijk fibrinogeen en 10% fluorescent gelabelde conjugaat fibrinogeen in een 5 mM oplossing van glucose opgelost in 50 mM Tris / 100 mM NaCl gedurende een resulterende concentratie van 6,8 mg / ml.
  3. Bedek de micro-centrifugebuizen met een opaak materiaal om blootstelling aan licht te vermijden. Incubeer de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 48 uur.
  4. Maak een kamer op een glazen microscoopglaasje door het aanbrengen van een dunne lijm aan 2 kanten van de dia.
  5. Na de 48 uur incubatietijd, bereiden reagentia voor fibrinevorming door ontdooien FXIIIa en menselijke alfa trombine bij RT.
  6. Verdun FXIIIa 80 U / ml in 5 mM CaCl2 buffer.
  7. Verdun trombine 4 U / ml in 5 mM CaCl2 buffer.
    1. Voor normale stolsels, ervoor zorgen dat de uiteindelijke concentraties van fibrinogeen, FXIIIa, en trombine zijn 2,5 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl.
    2. Voor de geglyceerde stolsels, opdat de uiteindelijke concentratie van fibrinogeen, FXIIIa en trombine zijn 3.4 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl.
  8. Onmiddellijk Pipetteer 30 ul van de oplossing fibrine in de kamer gevormd door de kleefstof.
  9. Plaats een 22 mm x 22 mm glazen dekglas met een dikte van 0,15 mm bovenop de 2 lijmlagen. Verzegel de open zijden met duidelijke lijm te voorkomen dat de fibrine stolsel uitdroogt. Zorg ervoor dat de lijm niet interageren met de fibrinestolsel.
  10. Laat de fibrineklonters polymeriseren bij 21-23 ° C gedurende 2 uur voor confocale beeldvorming.
  11. Neem confocale microscopie beelden van de stolsels met behulp van een confocale microscoop met een 40X / 1.30 Olie M27 lens met een 488 nm Argon laser.

3. confocale microscopie Evaluatie van fibrineklonters bevattende RBC uit sikkelcelpatiënten

  1. Ontdooi menselijk fibrinogeen en fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat bij 37 ° C.
  2. Pipet het volgende in een 0,5 ml afgestudeerd microcentrifugebuisje.
    1. Voor de gezonde, normale fibrine, mengen menselijk fibrinogeen met 10% fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat in een 50 mM Tris / 100 mM NaCl buffer bij een concentratie van 5 mg / ml.
    2. Voor de stolsels die SCD RBCs, meng menselijk fibrinogeen en 10% fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat in een 50 mM Tris / 100 mM NaCl zodanig dat de verkregen concentratie van het fibrinogeen 10 mg / ml.
  3. Label de geïsoleerde RBC (zowel normaal als die van sikkelcelpatiënten verkregen uit de RBC isolatie protocol) met behulp van een cel-labeling oplossing.
    1. Suspendeer cellen bij een dichtheid van 1 x 10 6 per ml in elke gewenste serumvrij kweekmedium.
    2. Voeg 5 ul / ml van de celsuspensie aan de cel-labeling oplossing. Meng goed door zachte pipetteren voorzichtig.
    3. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
    4. Centrifugeer de suspensie gemerkte buizen bij 1.500 rpm gedurende 5 min bij 37 ° C.
    5. Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de cellen in 37 ° C medium.
    6. Herhaal het wassen procedure (3.3.4 en 3.3.5) nog twee keer.
  4. Verdun FXIIIa 80 U / ml in 5 mM CaCl2 buffer.
  5. Verdun trombine 4 U / ml in 5 mM CaCl2 buffer.
    1. Voor normale stolsels, opdat de uiteindelijke concentratie van fibrinogeen, FXIIIa en trombine zijn 2,5 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl.
    2. Voor de stolsels die SCD erytrocyten, opdat de uiteindelijke concentratie van fibrinogeen, FXIIIa en trombine zijn 5 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl.
  6. Pipetteer 10 ul van de gemerkte RBC in de fibrine oplossing. Pipetteer 30 ul van de fibrine met RBC op de microscoop glas (zie voorbereiding op gl schuivenycated stolsels).
  7. Laat de fibrine polymeriseren bij 21-23 ° C gedurende 2 uur voor confocale beeldvorming.
  8. Neem confocale beelden van de stolsels met de confocale microscoop en gebruiken excitatie lasers met golflengten van 488 nm en 633 nm om de fluorescent gelabelde fibrine en RBC wekken.

4. confocale microscopie Evaluatie van Fibrinolyse Tarieven in Geglyceerde Clot Structuren

  1. Herhaal de confocale microscopie protocol van geglyceerde stolsels (Protocol Stap 2) voor de fibrinolyse tarief evaluatie in geglyceerde stolsels.
  2. Raak de uiteinden van de kamer met duidelijke lijm niet dichten. Laat de fibrineklonters polymeriseren gedurende 1,5 uur bij 21-23 ° C in een afgesloten omhulling met 250 ml water om uitdroging te voorkomen.
  3. Na polymerisatie verkregen beelden van de stolsels met de confocale microscoop.
  4. Pipetteer plasmine in het open einde van de kamer en verspreiden de plasmine door de prop via capillaire werking.
    1. Voorde normale en geglyceerd fibrinolyse experimenten met normale concentraties pipet 25 pi 200 pg / ml van plasmine in de opening van de kamer.
    2. Voor de geglyceerde stolsels met verminderde concentraties pipet 25 ul bij 50 ug / ml in de opening van de kamer.
  5. Gebruik de tijdreeks-functie (zie figuur 1) in de confocale microscoop software om real-time videobeelden van de plasmine lyseren het stolsel te vangen.
    1. Klik acquisitie-modus en selecteer vervolgens "Time-serie." Selecteer het aantal cycli en de opname tijdsinterval.

5. Berekening Fibrinolysis tarieven

  1. Bepaal de lysis tarief door het instellen van een gebied (2500 um 2) en het berekenen van de verstreken tijd die nodig is om een vast gedeelte van het stolsel op te lossen. Bereken het percentage lysis met de volgende vergelijking (Figuur 2):
    figure-protocol-1

6. Statistische analyse van Fibrinolysis Tarieven

  1. Analyseer de lysis van gegevens met behulp van statistische analyse software. Voer een one-way ANOVA en een post hoc Tukey-Kramer-test 44,45.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Confocale microscopie Analyse van Geglyceerde fibrinestolsel Structuren

De confocale microscopie foto van normale en geglycosileerd stolsels zijn weergegeven in Figuur 3. Confocale microscopie analyse van de normale en geglyceerd bloedstolsels blijkt dat geglyceerd stolsels dichter zijn met kleinere poriën dan de normale stolsels met en zonder toevoeging van FXIIIa tijdens stolsel polymerisatie. In figuur 3A en 3B, is een lagere fibrine conc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om zinvolle gegevens over de structuur van stollingsmechanismen bij ziektetoestanden verkrijgen, is het belangrijk om de bij stolling om de effecten van de eiwitten en cellen onder deze omstandigheden vast factoren te isoleren. Dit protocol werd ontwikkeld ten behoeve van onderzoek naar de structuur van de fibrine klonter in diabetische cardiomyopathie toestanden in vitro.

Het is noodzakelijk om de bij de vorming van fibrine en fibrinolyse bij ziektetoestanden aangezien veranderde o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de Lam Lab bij Georgia Tech bedanken voor vele nuttige discussies bij het ontwikkelen van de experimentele assays. Het onderzoek dat in deze publicatie is gerapporteerd, werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder Award Nummer K01HL115486 en door New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 van het Office of the Director, National Institutes of Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (hydrofiel polysacharide)GE Healthcare45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubesBD Biosciences366643
Human FibrinogenEnzyme Research LaboratoriesN/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugateMolecular ProbesF13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tubeFisher Scientific05-408-120
Glucose powderLife Technologies15023-02
FXIIIaEnzyme Research LaboratoriesN/A
VIS Confocal MicroscopeZeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solutionLife TechnologiesL7781
PlasminEnzyme Research LaboratoriesN/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)Life TechnologiesAM9759
Statistical Modeling SoftwareIBMSPSS Statistics 22

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781(2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212(1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Confocale microscopiefibrinolyse snelhedengeglyceerde stolselssikkelcelanemiediabetes mellitustrombosehemostasereal time imagingstolselpolymerisatieplasmine ge nduceerde lyse

Gerelateerde artikelen