Real Time Analyse van Metabool profiel in Ex Vivo Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures

Samenvatting

Dunne darm crypte organoids gekweekt ex vivo een weefselkweek systeem dat de groei van de crypten afhankelijk van stamcellen en hun niche recapituleert. We hebben een methode om het metabole profiel in real time in primaire muis crypte organoids assay. We vonden organoids behouden fysiologische eigenschappen gedefinieerd door hun bron.

Samenvatting

De kleine darmslijmvlies vertoont een repeterende architectuur georganiseerd in twee fundamentele structuren: villi, die uitsteekt in het darmlumen en samengesteld uit volwassen enterocyten, bekercellen en entero-endocriene cellen; en crypten, wonende proximaal van de submucosa en de muscularis, herbergen volwassen stamcellen en progenitor cellen en rijpe Paneth cellen en stromale en immuuncellen van de crypte micromilieu. Tot de laatste jaren, in vitro studies van dunne darm beperkt tot cellijnen die afkomstig zijn van zowel goedaardige of kwaadaardige tumoren, en niet de fysiologie van normale darmepitheel en de invloed van de micro-omgeving waarin zij verblijven vertegenwoordigen. Hier tonen we een aangepaste werkwijze van Sato et al. (2009) voor het kweken van primaire muis intestinale crypte organoids afgeleid uit C57BL / 6 muizen. Daarnaast presenteren we het gebruik van de crypte organoïde culturen naar de crypte metabole profiel in real time door de maatregel assayment van basale zuurstofverbruik, glycolytic rate, ATP productie en respiratoire capaciteit. Organoids behouden eigenschappen gedefinieerd door hun bron en de aspecten van hun metabolische aanpassing weerspiegeld door zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven behouden. Real time metabole studies in deze crypte organoïde kweeksysteem zijn een krachtig hulpmiddel om crypte organoïde energiemetabolisme te bestuderen, en hoe het kan worden gemoduleerd door voedings- en farmacologische factoren.

Inleiding

Colorectale kanker (CRC) is de derde belangrijke oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten. Sporadische darmkanker - dat wil zeggen, dat later die zich voordoen in het leven (> 50 jaar) en zonder duidelijke predisponerende genetische factoren - is goed voor ~ 80% van alle gevallen, met de incidentie sterk beïnvloed door langdurige voedingspatronen ^1,2. Deze tumoren vertonen een metabolische verschuiving naar afhankelijkheid oxidatieve glycolyse, zogenaamde Warburgeffect, die gedeeltelijk kunnen maken hogere concentraties van cellulaire bouwstenen en energie beschikbaar (via glutaminolysis) mogelijk te maken en wellicht hoge percentages tumorcelproliferatie ^3-5 drijven . Studies darmkanker en andere gastro-intestinale kanker waaronder dunne darm kanker verschaffen belangrijke inzicht in de oorzaak van tumorvorming. Het onderzoeken van de metabole verschillen tussen normale, pro-tumorigene en tumorigeen staten van gastro-intestinale organen kan det helpenermination relatieve risico op tumorontwikkeling en vroegtijdige detectie van neoplasie. Bovendien is het begrip van bio-energetische stofwisseling waarbij mitochondriale ademhaling en glycolyse zal fundamenteel inzicht in hoe de cel fysiologie, veroudering en de ziekte staat verstoort intestinale homeostase bieden. Benutting van de bio-energetica assay technologie voor extracellulaire flux analyse kunnen de tarieven van de mitochondriale ademhaling en glycolyse gelijktijdig beoordelen in cellen groeien in cultuur in real time ^6,7.

Tot voor kort, werden in vitro onderzoek van dunne darm beperkt tot cellijnen die afkomstig zijn van zowel goedaardige of kwaadaardige tumoren ^8,9 en niet de fysiologie van normale darmepitheel en de invloed van de micro-omgeving waarin zij verblijven vertegenwoordigen. In 2009, Sato et al. ¹⁰ introduceerde een ex vivo cultuur systeem om driedimensionale (3D) muis intestinale epitheliale organoids groeien, of epithEliel "mini-lef", geschikt voor experimentele, diagnostische en therapeutische onderzoeken ^10,11. Bovendien crypten geïsoleerd van calorisch beperkte muizen behouden hun veranderde groei-eigenschappen als organoids in dergelijke culturen ^12. Vergeleken met getransformeerde cellijnen kunnen crypte organoïde culturen worden fysiologisch relevante gegevens die een beter model voor de in vivo toestand begrijpen genereren.

We aangepast bioenergetica analyse technologie om energie-metabolisme van intestinale crypte organoids assay. Muis intestinale crypte organoids werden gekweekt ex vivo naar de crypte organoïde energiemetabolisme studies gepresenteerd ontwikkelen. De zuurstof verbruik (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van crypte organoids werden gemeten in de afwezigheid en aanwezigheid van twee verschillende metabolische remmers (oligomycin, rotenon) en een ion drager (carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). De crypte organoid metabole reactie op deze chemische verbindingen werden met succes tot uiting door middel van het wijzigen van ECAR en OCR-waarden.

Cellulaire bio-energetische studies zullen de wederzijdse interacties tussen metabole toestand en ziekterisico en fenotype verhelderen bij kanker, obesitas, diabetes, metabole stoornissen en mitochondriale ziekten en helpen vooraf screeningsmethoden met rechtstreekse gevolgen voor translationele geneeskunde. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol te dunne darm crypten te isoleren en cultuur crypte organoids. Bovendien introduceren we een nieuwe methode om crypte organoïde culturen gebruiken voor metabole assays.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Commissie voor de ethiek van dierproeven van het Albert Einstein College of Medicine.

1. Crypt Isolatie en Cultuur

1. Isolatie van crypten uit de dunne darm:
   1. Isoleer intestinale crypten van elke muizenmodel met rente. Euthanaseren de muizen met _CO2, gevolgd door cervicale dislocatie.
   2. Het openstellen van de buik in de lengte en vul de dunne darm (SI) met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS (-Ca ^2+; Mg ²⁺⁾ met 2x antibiotica-antimycotische (anti-anti). Snel isoleren dunne darm.
   3. Grondig ontleden vrij van mesenteriale vet met behulp van een scalpel. Wees voorzichtig niet om het weefsel te perforeren - te allen tijde te houden het weefsel vochtig met ijskoude PBS. Openstellen inteStine lengterichting en grondig wassen met ijskoud PBS.
   4. Snijd dunne darm in twee secties en plat uit met behulp van een nat wattenstaafje voorzichtig afschrapen van de villi met behulp van een vooraf gekoeld slide. Was krachtig in ijskoude PBS meerdere malen.
   5. Incubeer 3 min in 20 ml 1 x PBS per 3 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) /0.5 mM dithiothreitol (DTT) voor niet-enzymatische dissociatie van het weefsel.
   6. Snij weefsel in kleine stukjes (2-4 mm) met een scheermesje op een voorgekoelde slide. Breng de stukken in een 50 ml buis met 20 ml ijskoud PBS.
   7. Pipet op en neer zachtjes 10x met behulp van een 10 ml steriele wegwerp pipet. Laat weefselfragmenten sediment door de zwaartekracht. Verwijder het supernatant met een pipet. Herhaal dit drie extra tijden; zorg ervoor dat bovenstaande is duidelijk.
   8. Voeg 20 ml PBS per 2 mM EDTA. Swirl en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min met zachte wiegen.
   9. Laat weefsel sediment en gooi supernatant. Voeg 15 ml ijskoude PBS en pipetop en neer 5x met een pipet 10 ml. Laat de weefselfragmenten sediment en het verzamelen van de supernatant als Fractie 1 (F1). Herhaal verzamelen F2-F5, elke fractie apart gehouden.
   10. Voeg 15 ml ijskoude PBS en deze keer Schud krachtig met de hand gedurende 15 sec. Verzamel F6 en herhaal voor F7, F8. Als weefsel stukken beginnen te zweven, tikt u op om hen te helpen vestigen.
   11. Inspecteren een aliquot van elke fractie onder de microscoop. Pool die fracties die crypten.
   12. Passeer de samengevoegde fracties door middel van een 70 micrometer nylon cel zeef, het verzamelen van crypten in een 50 ml buis.
   13. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, gooi supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml ijskoude PBS met 2x anti-anti crypten en overbrengen naar een 15 ml buis. Herhaal het wassen nog een keer.
   14. Was de crypten een keer met 10 ml ijskoude ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco 's Modified Eagle Medium / Ham' s F-12) - 2x anti-anti.
   15. Was de crypten een keer met 10 ml ADF - 1x anti-anti.
   16. Tel de crypten met behulp van een hemocytometer. Stel de crypte oplossingsvolume en naar een 1,5 ml buis zodanig dat de uiteindelijke concentratie bij crypte geresuspendeerd zal 100-500 crypten per 50 ui gelatineuze eiwitmengsel (Matrigel). Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer crypten in de gelatineuze eiwitmengsel.
   17. Plaat 50 ui crypt - gelatineuze eiwitmengsel suspensie per putje in een 24-well plaat (groeigebied: 2 cm ²⁾ voorzichtig plaatsen van de suspensie daling in het midden van elk putje. Handhaving van de plaat in een CO _2, 37 ° C incubator voor ~ 30 min tot de schorsing stolt.
   18. Voeg 500 ul ijskoud compleet kweekmedium (DMEM Uitgebreid / F12 met 1x anti - anti, 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 supplement, 1x N2 supplement, 1 mM N-Acetyl-L-cysteïne (NAC), 50 ng / ml epidermale groeifactor (EGF), 100 ng / mlHersenpan, 500 ng / ml R-Spondin).
       1. Reconstitueren groeifactoren in 0,1% runderserumalbumine (BSA) in PBS.
2. Crypte organoïde Cultuur en Passage:
   1. Passage crypt organoids 14-21 dagen na zaaien (of naar behoefte) als volgt:
      1. Change media elke vrijdag en maandag. Op woensdag, vervang de helft van de media met verse media.
   2. Verwijder het kweekmedium. Tweemaal spoelen van het monster met 500 pi PBS bij 5 min intervallen.
   3. Verwijder PBS en voorzichtig breken de geleiachtige eiwit mengsel met behulp van een steriele P1000 micro pipet tip.
   4. Voeg 1 ml compleet voedingsbodems tot één goed en resuspendeer de organoids in 1 ml media.
   5. Zachtjes verstoren de organoids met een P1000 door en neer te pipetteren 20-30x (kijk onder de microscoop voor juiste organoïde dissociatie met een goede opbrengst crypte totdat een consistente techniek ontwikkeld).
   6. Breng de crypten naar een 1,5 ml microcentrifugebuis;Centrifugeer bij 100 xg bij 4 ° C, 5 min.
   7. Was de pellet twee keer met 1 ml compleet kweekmedium.
   8. Splitsing in een verhouding van 1: 3 of 1: 6 als nodig resuspenderen crypten in 50 gl per putje Matrigel. Ga te werk zoals hierboven beschreven (paragraaf 1.1.16-18) beschreven.
3. Crypte organoïde Invriezen:
   1. Verwijder het kweekmedium. Was het monster in 500 pi PBS.
   2. De verspreiding van de geleiachtige eiwit mengsel met behulp van een P1000 pipet tip.
   3. Voeg 1 ml media om één goed en resuspendeer de organoids in 1 ml media.
   4. Breek voorzichtig de organoids met een P1000 door en neer te pipetteren 20-30x.
   5. Breng de organoids naar een 1,5 ml tube. Centrifugeer bij 100 xg bij 4 ° C, 5 min.
   6. Was de pellet twee keer met 1 ml compleet kweekmedium.
   7. Hersuspendeer crypten in 500 pi bevriezing media.
   8. Transfer crypten een cryotube Plaats de buis in een bevriezing container en op een -80 ° C vriezer overnight.
   9. Transfer crypten om vloeibare N ₂ tank.
      1. Recover bevroren crypte organoids door snel ontdooien in een 37 ° C waterbad. Wassen met 500 ul compleet kweekmedium eenmaal centrifuge bij 100 xg, 5 min en resuspendeer in gelatineuze eiwitmengsel en cultuur zoals hierboven beschreven. Voor beter herstel, voeg ROCK inhibitor (Y-27632) aan de bevriezing media.

2. Crypt organoïde Metabolisme Assay

1. 24-well plaat Bereiding:
   1. Isoleren en tel crypten volgens het protocol (zie paragraaf 1.1 voor crypte isolatie en paragraaf 1.2 voor crypte passage).
   2. Hersuspendeer crypten in geleiachtige eiwitmengsel (100-200 crypten per 20 pi).
   3. Plaat crypt-geleiachtige eiwitmengsel suspensie in een 24-well assay plaat (zorg ervoor dat er ten minste drie exemplaren voor elk monster) en laat de schorsing te stollen bij 37 ° C in een CO ₂incubator; voeg dan 500 ul compleet voedingsbodems.
   4. Cultuur crypten (zoals beschreven in paragraaf 1.1) en de in acht te nemen onder de microscoop tot crypten uitgroeien tot volledig ontwikkelde organoids.
2. Extracellulaire Flux Assay:
   1. Hydraat cartridge overnacht in een niet-CO ₂ (0% CO _2), 37 ° C incubator.
   2. Verwijder het kweekmedium en was organoids tweemaal met 500 ul DMEM (zonder glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, en met: fenolrood). Wacht 5 min.
   3. Voeg 675 ul per putje assaymedium (DMEM met 2 mM L-glutamine en 5 mM D-glucose) aan elk putje.
   4. Controleer crypte organoids microscopische morfologie om ervoor te zorgen dat organoids en de geleiachtige eiwit mengsel intact zijn na de wasbeurten. Incubeer 1 uur in een niet-CO _2, 37 ° C incubator.
   5. Bereid 10 uM injecteerbare verbindingen (oligomycin, carbonyl cyanide-p-trifluor-methoxy-fenyl-hydrazon (FCCP), rotenone) in testmedium.
   6. Set-up van de cartridge door het laden van 75 pi van 10 uM injecteerbare verbindingen in de havens van de cartridge sequentieel: Port A - oligomycin; Port B - FCCP; en Port C - rotenon (De uiteindelijke concentraties tijdens de test zal 1 uM zijn).
   7. Incubeer cartridge 30 minuten - 1 uur bij 37 ° C in een niet-CO ₂ incubator.
   8. Tegelijkertijd zet de XF Analyzer en maak de assayprotocol template.
   9. Plaats cartridge en het nut plaat in XF Analyzer en run "kalibreren" cartridge.
   10. Controleer crypte organoids microscopisch onderzoeken om ervoor te zorgen dat ze gehecht zijn aan de geleiachtige eiwitmengsel.
   11. Load celkweekplaat naar instrument en run-test protocol.

Resultaten

Crypte organoids werden vastgesteld op basis van 8 maanden oude C57BL / 6 muizen gevoed gezuiverd knaagdierendieet American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale crypte organoids kunnen worden gekweekt in cultuur voor langere tijd van een enkele crypte (Figuur 1A, enkele rode pijl). Organoids groeien uit crypte-achtige structuren in 18-20 dagen in kweek (Figuur 1B, rode pijlen). Crypten werden gepasseerd om de 3 weken en organoids efficiënt hersteld na elke passage.

Discussie

We testten het zuurstofverbruik rate (OCR) en de extracellulaire aanzuursnelheid (ECAR) van crypten geïsoleerd van 8 maanden oude muizen en uitgegroeid tot organoids ex vivo. Na meting van de basale snelheid, werd crypte metabolisme geëvalueerd door het toevoegen oligomycin, carbonyl cyanide -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en rotenon, sequentieel.

Basaal OCR en basale ECAR werden geregistreerd 0-29 min (figuur 2A en 2B). Op de ^29ste

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-vrij, LDEV-vrij	BD Biosciences	356231
PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing), geen magnesium, geen calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium zonder glucose, L-glutamine, fenol rood, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	D5030
Fenol rood natriumzout	Sigma-Aldrich	P4758	Eindconcentratie 15 mg/l in DMEM (D5030) - stap 2.2.2
Antibioticum-antimycoticum, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Eindconcentratie 1x of 2x
Penicilline-streptomycine, vloeibaar	Life Technologies	15140-122	Eindconcentratie 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Eindconcentratie 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethansulfonzuur), 1 M	Life Technologies	15630-080	Eindconcentratie 10 mM
N-acetyl-L-cysteïne, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Eindconcentratie 1 mM
100x N-2 supplement, vloeibaar	Invitrogen	17502-048	Eindconcentratie 1x
50x B-27® supplement minus Vitamine A, vloeibaar	Invitrogen	12587-010	Eindconcentratie 1x
Recombinant Muis R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Eindconcentratie 500 ng/ml
Recombinant Muur EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Eindconcentratie 50 ng/ml
Recombinant Muur Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Eindconcentratie 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Eindconcentratie 2 mM
Gibco® glucosepoeder	Life Technologies	15023-021	Eindconcentratie 5 mM
Ambion® 0,5 M EDTA (ethyleen-diaminetetraazijnzuur), pH 8,0	Life Technologies	AM9260G	Eindconcentratie 3 mM voor stap 1.1.5; 2 mM voor stap 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Eindconcentratie 3 mM
Albumine uit bovien serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0,1% in PBS
Foetaal bovien serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Celcultuur Bevriezingsmedium	Life Technologies	12648-010
ROCK-remmer (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Eindconcentratie 10 μM
Oligomycine	Sigma-Aldrich	O4876	Eindconcentratie 1 μM
Carbonylcyanide-p-trifluoro-methoxy-fenyl-hydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Eindconcentratie 1 μM
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875	Eindconcentratie 1 μM
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Eindconcentratie 0,1 N in PBS
XF24 Extracellulaire Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience