Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van &quot;Cargo Mapping&quot; Analyse

Sylvia Neumann; George E. Campbell; Lukasz Szpankowski; Lawrence S.B. Goldstein; Sandra E. Encalada

doi:10.3791/52029

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van "Cargo Mapping" Analyse

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52029

⸱

30 oktober 2014

Sylvia Neumann¹ , George E. Campbell^*¹ , Lukasz Szpankowski^*²^,³ , Lawrence S.B. Goldstein²^,⁴ , Sandra E. Encalada¹

¹Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, ³Department of Bioengineering, University of California San Diego, ⁴Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Intracellulair transport van ladingen, zoals blaasjes of organellen, wordt uitgevoerd door moleculaire motoreiwitten die op gepolariseerde microtubuli volgen. Dit protocol beschrijft de correlatie van de directionele richting van transport van individuele vrachtdeeltjes die zich binnen neuronen bewegen, naar de relatieve hoeveelheid en het type van geassocieerde motoreiwitten.

Samenvatting

Inzicht in de mechanismen waarmee moleculaire motoren hun activiteiten coördineren om vesiculaire ladingen binnen neuronen vervoeren vereist de kwantitatieve analyse van motor / vracht verenigingen bij de enkele blaasje niveau. Het doel van dit protocol kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebruiken correlatie ("kaart") de positie en richting van de beweging van levende lading van de samenstelling en relatieve hoeveelheden van motoren verbonden met dezelfde lading. "Cargo mapping" bestaat uit levend beeldvorming van fluorescent gelabelde ladingen bewegen axons gekweekt op microfluïdische inrichtingen, gevolgd door chemische fixatie tijdens de opname van levende beweging en daaropvolgende immunofluorescentie (IF) kleuring van exact dezelfde axonale gebieden met antilichamen tegen motoren. Colokalisatie tussen ladingen en hun bijbehorende motoren wordt beoordeeld door het toewijzen van sub-pixel positie coördinaten naar motor en vracht kanalen, door het aanbrengen van Gaussische functies om de diffractie-limited puntspreidingsfuncties vertegenwoordigen individuele fluorescerende puntbronnen. Vaste lading en motorische beelden worden vervolgens gelegd op percelen van vracht-verkeer, tot "kaart" om hun bijgehouden trajecten. De sterkte van dit protocol is de combinatie van levende en IF gegevens aan voor het transport van vesiculaire ladingen in levende cellen opgetekend en motoren gekoppeld aan deze exact dezelfde vesicles te bepalen. Deze techniek overwint eerdere uitdagingen die biochemische methoden gebruiken om de gemiddelde motor samenstelling van gezuiverd heterogene bulk blaasje populatie te bepalen, omdat deze methoden niet composities op enkele bewegende lading onthullen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor de analyse van andere transport- en / of handel trajecten in andere celtypes om de beweging van afzonderlijke intracellulaire structuren correleren met hun eiwitsamenstelling. Beperkingen van dit protocol zijn de relatief lage omzet hebben vanwege de lage efficiëntie van de transfectie van gekweekteprimaire neuronen en een beperkt gezichtsveld beschikbaar voor hoge-resolutie imaging. Toekomstige toepassingen kan werkwijzen omvatten het aantal neuronen tot expressie fluorescent gelabelde lading verhogen.

Inleiding

Intracellulair transport is essentieel in alle celtypes voor de afgifte van eiwitten, membranen, organellen, en signaalmoleculen verschillende cellulaire domeinen ^1. Neuronen zijn zeer gespecialiseerd cellen met lange, gepolariseerde projecties die belangrijke mate afhangen van intracellulaire transport van essentiële goederen voor hun lange afstand levering aan diverse axonale microdomeinen. Dit transport wordt gemedieerd door kinesins en dyneins - twee grote families van de moleculaire motor eiwitten - die binden aan ladingen en spoor langs gepolariseerd microtubuli in anterograde en retrograde richtingen, respectievelijk. Terwijl retrograde beweging wor....