Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van "Cargo Mapping" Analyse

Samenvatting

Intracellulair transport van ladingen, zoals blaasjes of organellen, wordt uitgevoerd door moleculaire motoreiwitten die op gepolariseerde microtubuli volgen. Dit protocol beschrijft de correlatie van de directionele richting van transport van individuele vrachtdeeltjes die zich binnen neuronen bewegen, naar de relatieve hoeveelheid en het type van geassocieerde motoreiwitten.

Samenvatting

Inzicht in de mechanismen waarmee moleculaire motoren hun activiteiten coördineren om vesiculaire ladingen binnen neuronen vervoeren vereist de kwantitatieve analyse van motor / vracht verenigingen bij de enkele blaasje niveau. Het doel van dit protocol kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebruiken correlatie ("kaart") de positie en richting van de beweging van levende lading van de samenstelling en relatieve hoeveelheden van motoren verbonden met dezelfde lading. "Cargo mapping" bestaat uit levend beeldvorming van fluorescent gelabelde ladingen bewegen axons gekweekt op microfluïdische inrichtingen, gevolgd door chemische fixatie tijdens de opname van levende beweging en daaropvolgende immunofluorescentie (IF) kleuring van exact dezelfde axonale gebieden met antilichamen tegen motoren. Colokalisatie tussen ladingen en hun bijbehorende motoren wordt beoordeeld door het toewijzen van sub-pixel positie coördinaten naar motor en vracht kanalen, door het aanbrengen van Gaussische functies om de diffractie-limited puntspreidingsfuncties vertegenwoordigen individuele fluorescerende puntbronnen. Vaste lading en motorische beelden worden vervolgens gelegd op percelen van vracht-verkeer, tot "kaart" om hun bijgehouden trajecten. De sterkte van dit protocol is de combinatie van levende en IF gegevens aan voor het transport van vesiculaire ladingen in levende cellen opgetekend en motoren gekoppeld aan deze exact dezelfde vesicles te bepalen. Deze techniek overwint eerdere uitdagingen die biochemische methoden gebruiken om de gemiddelde motor samenstelling van gezuiverd heterogene bulk blaasje populatie te bepalen, omdat deze methoden niet composities op enkele bewegende lading onthullen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor de analyse van andere transport- en / of handel trajecten in andere celtypes om de beweging van afzonderlijke intracellulaire structuren correleren met hun eiwitsamenstelling. Beperkingen van dit protocol zijn de relatief lage omzet hebben vanwege de lage efficiëntie van de transfectie van gekweekteprimaire neuronen en een beperkt gezichtsveld beschikbaar voor hoge-resolutie imaging. Toekomstige toepassingen kan werkwijzen omvatten het aantal neuronen tot expressie fluorescent gelabelde lading verhogen.

Inleiding

Intracellulair transport is essentieel in alle celtypes voor de afgifte van eiwitten, membranen, organellen, en signaalmoleculen verschillende cellulaire domeinen ^1. Neuronen zijn zeer gespecialiseerd cellen met lange, gepolariseerde projecties die belangrijke mate afhangen van intracellulaire transport van essentiële goederen voor hun lange afstand levering aan diverse axonale microdomeinen. Dit transport wordt gemedieerd door kinesins en dyneins - twee grote families van de moleculaire motor eiwitten - die binden aan ladingen en spoor langs gepolariseerd microtubuli in anterograde en retrograde richtingen, respectievelijk. Terwijl retrograde beweging wordt voornamelijk gemedieerd door dynein, wordt beweging in de anterograde richting vergemakkelijkt door een groot, functioneel diverse familie van kinesine motors. Bijgevolg kunnen anterograde transport van axonale ladingen worden gemedieerd door verschillende familieleden van de kinesine superfamilie ^1-5. Hoewel sommige ladingen bewegen voortdurend in beide richtingen, most ladingen bewegen bidirectioneel en reverse vaak op hun weg naar hun eindbestemming ^1,5-13. Verder is aangetoond dat de motoren van de tegengestelde gerichtheid associate gelijktijdig tot lading, het verhogen van de vraag hoe gereglementeerde beweging van ladingen wordt gecoördineerd door tegenovergestelde polariteit motoren ^5-7. Samen axonale transport van lading is een gecoördineerde proces dat wordt gereguleerd door de samenstelling van motoren en hun specifieke biochemische activiteiten, die op hun beurt afhankelijk van diverse adapters en regelgevende bindingspartners ^14.

Trouw beschrijven mechanisme van axonaal transport voor een bepaalde lading en de onderliggende regulering van dat transport ontdekken, is het noodzakelijk dat de samenstelling van motorische eiwitten en hun regulatorische bindingspartners geassocieerd met individuele goederen tijdens het vervoer van levende bepalen. Andere methoden, zoals biochemische benaderingen schattingen over gemiddelde motof samenstellingen op gezuiverd heterogene blaasje populatie, maar deze schattingen niet het type of de bedragen van de motoren gekoppeld aan enkele bewegende blaasjes onthullen. Ook reconstitutie van vesicle transport langs voorgemonteerde microtubules in vitro geactiveerd meten van de hoeveelheid van een type motor op een vesicle level ^15. Echter, deze experimenten niet direct correleren het aantal motoren van de transporteigenschappen van deze vesicles en transport gemeten in afwezigheid van cellulaire regulerende factoren.

Een protocol wordt hier gepresenteerd, waarvan de motor samenstelling (type en de relatieve hoeveelheid van de motoren) van de afzonderlijke bewegende blaasjes uit immunofluorescentie (IF): gegevens die endogeen tot expressie motor eiwitten bepaalt, en correleert deze parameters om het vervoer van levende exact dezelfde blaasjes in neuronen ^16. Deze methode is gebaseerd op een nauwkeurige kartering van IF-to-live-beweging vracht gegevens. Dit wordt bereikt door growing hippocampus muis neuronen in microfluïdische systemen, volgens vastgestelde protocollen ^17-19. Deze apparaten zorgen voor de identificatie en correlatie ("mapping") van axonen en enkele bewegende lading in vaste en live lichtmicroscopie modaliteiten (Figuur 1). Gekweekte neuronen worden getransfecteerd met fluorescent gelabelde lading eiwitten waarvan het transport wordt afgebeeld op een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te gedetailleerde informatie beweging die is uitgezet in kymographs verkrijgen. Tijdens beeldvorming wordt neuronen gefixeerd met paraformaldehyde, en vervolgens gekleurd met antilichamen tegen endogene eiwitten motor. Vaste lading en motorische beelden worden gelegd op live-beweging kymographs naar "kaart" (colocaliseren) hen naar de live-beweging vracht trajecten ^16. Om de live-beweging van ladingen met de vereniging van motorische eiwitten correleren, is colocalization geanalyseerd met behulp van een op maat gemaakte MATLAB software pakket genaamd "Motor colokalisatie ^"16,20. Fluorescent gelabelde ladingen en motoren genereren buigingsbegrensd punctate functies die gedeeltelijk kunnen overlappen. Om de positie van overlappende puncta lossen, eerst de software past automatisch Gaussische functies aan elke puntspreidingsfunctie, wat neerkomt op individuele fluorescerende puncta, om hun precieze XY sub-pixel-positie te bepalen coördineert en intensiteit amplitudes ^21-23. De posities van motoren en ladingen zijn vervolgens vergeleken met elkaar colocalization ^16,20 bepalen. Daarom is deze werkwijze nader kent colocalization tussen fluorescente puncta vergelijking met andere methoden ^24.

De kracht van deze methode is het vermogen om de colocalization motoren met individuele lading beoordelen gefixeerde cellen, waarvoor levende beweging trajecten (bijvoorbeeld de richting waarin zij bewegen bij de fixatie) zijn rec geweestorded. Met deze methode werden kinesins en dyneins vond gelijktijdig koppelen aan blaasjes die het normale prioneiwit dragen (PrP ^C -cellular), een neuronaal verrijkt lading die in twee richtingen beweegt of stilstaat in axonen ^16. Deze analyse liet de formulering van een werkmodel voor de regulering van PrP ^C blaasje beweging waarin anterograde (kinesine) en retrograde (dynein) motoren hun activiteiten coördineren om de blaasjes te verplaatsen in beide richtingen of stationair te blijven, terwijl in verband met de lading . Een ander sterk punt van deze methode is het potentieel brede toepasbaarheid voor het karakteriseren van colocalization / vereniging van vele fluorescent gelabelde ladingen die in bewegen vrijwel elk type cel, met een andere proteïne (s) van belang. Zo zou levende / vaste correlatie mogelijk maakt detectie van voorbijgaande proteïne-lading interacties kan zoveel afzonderlijke fluorescent gelabelde bewegende deeltjes worden geanalyseerd over een gewenst period van tijd. Gezien de brede toepasbaarheid en de aard van de vragen die deze methode kan pakken, zal dit protocol van belang zijn voor een breed publiek van cel biologen waaronder die studeert handel en transport in neuronen of in andere celtypen.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgende goedgekeurde protocollen en volgens de institutionele richtlijnen voor de humane zorg van proefdieren. Pasgeborene muizen werden gedood door onthoofding.

1. Voorbereiding van Microfluïdische Inrichtingen voor Cell Culture

1. Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische inrichtingen voor het kweken van hippocampale neuronen zoals beschreven door Harris en collega's ^17-19. Hieronder zijn enkele wijzigingen die werden aangepast aan de lading mapping protocol.
   OPMERKING: microfluïdische inrichtingen zijn ook commercieel verkrijgbaar (Materials List), waardoor toegang tot een fabricage faciliteit niet noodzakelijk.
2. Bereid No. 1½ dekglaasjes (24 x 40 mm) door wassen driemaal met aceton, gevolgd door driemaal wassen met 100% ethanol en drie wassingen van water. WINKEL dekglaasjes in water bij 4 ° C tot gebruik. Deze behandelingen helpen ervoor te zorgen dat coverslips schoon zijn van puin die kunnen interfereren met plating van CELls, vervuiling, en overleving.
   LET OP: aceton en ethanol zijn brandbaar en gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), van contact met de ogen (irriterend), van inslikken, van inademing. Afvalverwijdering volgens overheidsbepalingen.
3. Als u klaar bent om te gebruiken, plaatst u een dekking van glas in een 60 mm celkweekschaaltje per microfluïdische apparaat, en laat het aan de lucht drogen zonder deksel gedurende 45 min in een bioveiligheid kast om besmetting te voorkomen.
4. Na apparaten zijn geknipt uit de meesters en stoten zijn gesneden om de reservoirs te creëren (Figuur 1A, B), leg ze met de microfluïdische kanalen side-up in een bioveiligheid kast voorzien van een UV-lamp voor 45 min voor sterilisatie.
   OPMERKING: Leaving apparaten onder UV behandeling langer dan 2 uur kan de integriteit van de PDMS beïnvloeden.
5. Monteer de apparaten door het plaatsen van één apparaat op elke dekking van glas in de 60 mm plastic celkweekschaaltje zodat de microfluïdische kanalen naar beneden. Druk zachtjes op de top of het apparaat (raak het microkanalen) een niet-permanente verbinding van de inrichting aan het dekglas. Bedek elk 60 mm celkweek schaal met deksel.
6. Met een micropipet, hydrateren de inrichtingen door toevoeging celkweekniveau water boven twee microfluïdische reservoirs (1 en 2 in figuur 1A), waardoor water doorstromen. Verwijder water met een micropipet en voeg 1 mg / ml poly-L-lysine in microfluïdische reservoir 1 (200 ui) en 2 (100 pl). Het volume verschil zal voor de poly-L-lysine te stromen door de microkanalen (Figuur 1A, B).
7. Om de apparaten in de 60 mm celcultuurschalen niet omvallen in een 37 ° C incubator, nog drie 60 mm celkweek schalen met de hulpmiddelen in een 150 mm kunststof celkweekschaal en bedek de schaal met een deksel. Incubeer O / N in een 37 ° C incubator met 5% _CO2. Meestal meer dan 90% van de kanalen bruikbaar per apparaat en doeneventuele luchtbellen of fysieke blokkade niet bevatten.
8. Op de volgende dag vervangen poly-L-lysine met water en laat inrichting incubator gedurende ten minste 1 uur. Herhaal dit drie keer wassen. Verwijder water en voeg Neurobasal-A groeimedium (die 2% B-27 supplement en 500 uM GlutaMAX) aan elk apparaat. Laat O / N in een 37 ° C incubator met 5% _CO2.
9. Op de volgende dag, plaat hippocampale cellen zoals hierna beschreven.

2. Plating van Mouse hippocampus primaire neuronen in Microfluïdische Devices

OPMERKING: De voorbereiding van gekweekte hippocampale neuronen van pasgeborene ratten is eerder gepubliceerd in Jupiter ^25. Hieronder zijn enkele wijzigingen die werden aangepast aan de plaat muis hippocampale neuronen in microfluïdische apparaten, en die optimaal zijn voor transfecties waren.

1. Voor muizenhersenen dissectie, voorverwarmen Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum(FBS; zonder antibiotica), Mengsel A (125 mg DL-cysteïne, 125 mg runderserumalbumine (BSA) en 3.125 g D-glucose in 500 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), filter gesteriliseerd door een 0,22 um filter) en deoxyribonuclease I oplossing (DNase I: 50 mg DNase I en 0,5 ml van een 1,2 M _MgSO4 oplossing in 100 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) filter gesteriliseerd door een 0,22 urn filter) in een 37 ° C waterbad.
   1. Voorverwarmen Neurobasal-A groeimedium in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 om de pH in evenwicht.
2. Ontleden hippocampus 1-3 dagen oude pasgeboren muizen volgens vastgestelde protocollen ^26. Houd hippocampus in een 15 ml conische buis met 10 ml dissectie buffer (HBSS bevattende 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM glucose, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine), op ijs. Zet maximaal 4 zeepaardjes per 15 ml conische buis.
3. Voer de resterende protocol is onder steriele toestands in een bioveiligheid kast.
4. Verdun 45 eenheden van papaïne in 5 ml van mengsel A, vortex en incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C totdat papaïne poeder wordt opgelost. Voeg 1 ml DNase I oplossing. Filter de mix door een 0,22 pm spuitfilter unit.
5. Zorgvuldig aspireren HBSS 'van 15 ml conische buis met hippocampus. Voeg 10 ml koude (4 ° C) HBSS tot hippocampus en laten bezinken naar de bodem van de buis. Aspireren HBSS voorzichtig van 15 ml conische buis.
6. Voeg 1 ml papaïne / DNase I mix tot 4 hippocampus en incubeer gedurende 20-30 min bij 37 ° C. Kantel conische buis om de 5 min naar hippocampus baden met mix. Als alternatief plaatst hippocampus in een 37 ° C waterbad shaker met zachtjes schudden (~ 100 rpm).
7. Zuig papaïne / DNase I mengen en wassen hippocampus tweemaal met voorverwarmd DMEM (37 ° C) bevattende 10% FBS.
8. Na de tweede wasbeurt, voeg 2 ml voorverwarmde DMEM met 10% FBS aan hippocampus en handmatig vermaal hippocampus door pipetterenop en neer ~ 10-12 keer met behulp van een 1 ml pipet tip om neuronen te distantiëren.
9. Laat trituraat regelen voor ~ 1 min, omdat dit zal toelaten niet-gesplitste neuronen te vestigen op de bodem van de conische buis. Breng supernatant dat gedissocieerd neuronen in nieuw 15 ml conische buis vermeden Transmissie van grote weefsel dat zich op de bodem van de buis.
10. Spin cellen bij 1000 xg gedurende 2 min en supernatant voorzichtig verwijderen zonder de cel pellet. Resuspendeer cellen in 80 ul Neurobasal-A groeimedium door pipetteren voorzichtig.
11. Verwijder medium uit microfluidic reservoir 1 en 1 '. Solliciteer 20 ul van cellen (~ 275.000) naar microfluïdisch reservoir 1, en hen in staat stellen om door stromen. Plaats inrichting 37 ° C incubator met 5% _CO2 gedurende 20 minuten.
12. Kijk onder de microscoop om ervoor te zorgen dat cellen hebben gehandeld op grond van de dekking van glas. Voeg Neurobasal-A groeimedium naar boven uit alle reservoirs. Terug inrichting met cellen tot een 37 ° C incubator met 5% CO _2.
13. Controleer apparaten elke verdamping ~ 2-3 dagen en top off reservoirs met Neurobasal-A met 2% B-27 supplement (zonder GlutaMAX) te vermijden. Neuronen beginnen hun axons uitstrekken door microkanalen ~ 2-3 dagen na uitplaten. Onderwerp neuronen meestal 7-10 dagen na transfectie plating.

3. Transfectie van hippocampale neuronen Grown in Microfluïdische Device

1. Per apparaat, bereid een mengsel van 1,2 ul Lipofectamine 2000 in 30 ui Neurobasal-A en een mengsel van 0,5 ug fluorescerende lading fusieplasmide in 30 ui Neurobasal-A en incubeer 5 min bij RT. Voeg Lipofectamine mengsel DNA mix en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 60 ul van Neurobasal-A met 4% B-27 supplement aan het DNA / Lipofectamine mix en meng door flicking de buis.
2. Verwijder alle media uit microfluidische reservoir 2 en 2 'en zorgvuldig opvullen putten met Neurobasal-A met 2% B-27 supplement zonder te morsen op de middellange into de andere compartimenten.
3. Verwijder het afdrukmateriaal uit microfluidische reservoir 1 en 1 '. Voeg 120 ul van DNA / Lipofectamine mix aan microfluïdische reservoir 1 en laat het stromen. Terug apparaat 37 ° C incubator met 5% _CO2 gedurende 3-4 uur.
4. Verwijder alle media uit microfluidische reservoir 1 en 1 'en te vervangen door Neurobasal-A met 2% B-27 supplement voor 24 uur (of tot het moment van afbeelding). Typisch, 5-7 axonen die groeien door microkanalen worden getransfecteerd in die omstandigheden, die ongeveer 1-3% transfectie-efficiëntie in overeenstemming met efficiëntie gepubliceerd voor de hippocampus gekweekte cellen ²⁶ vertegenwoordigen.

4. "Cargo Mapping" Analyses

1. Live-Imaging van vracht-verkeer
   1. Voer de beeldvorming over een omgekeerde epifluorescente lichtmicroscoop uitgerust met een 37 ° C incubator en een CO ₂ regelkamer.
   2. Monteer het dekglaasje met hippocampale neuronen gekweekt in een microfluidic apparaat op de microscoop podium. Tot neuronale dood te voorkomen, werken vlot naar de monsters bij de microscoop gedurende niet langer dan 1 uur.
   3. Met een doelstelling hoge resolutie (100X), vind axonen van getransfecteerde cellen die zich door kanalen microfluidic kamers en noteer het aantal kanalen waarin de getransfecteerde axon gevonden. Tel het aantal kanalen met behulp van een hand tally teller.
      1. Voor optimale opnamen van live-beweging en de daaropvolgende colocalization analyse, kiest axonen die relatief vlak te groeien door de kanalen zodat de beeldvorming van de meeste blaasjes in focus kan worden uitgevoerd.
   4. Verwijder het grootste deel van het medium uit reservoirs 2 en 2 'met een 1 ml plastic transferpipet. Latere aanpassing van vaste beelden met beweging trajecten op kymographs vergemakkelijken lijn de rechterrand van de microkanalen met het gezichtsveld tijdens beeldvorming (Figuur 1B, C).
   5. Om fixin vergemakkelijkeng van de monsters tijdens de beeldvorming, live beeldvorming met twee mensen. Als alternatief, als levende beeldvorming wordt uitgevoerd door één persoon, gebruikt een microscoop systeem voorzien drift correctie.
   6. Start imaging live-beweging vracht met time-lapse specificaties die specifiek zijn voor de dynamiek vervoer van de vracht die wordt geanalyseerd (microscoop specificaties en instellingen voor beeldvorming YFP- PrP ^C zijn gespecificeerd in de legenda van figuur 2 en Materials List).
   7. Na voldoende levende beweging zijn verzameld, één persoon vullen reservoirs 2 en 2 'met voorverwarmd 4% paraformaldehyde in PBS dat 0,04 g / ml sucrose aan de cellen vast. Vermijd het aanraken van de microfluïdische apparaat, aangezien dit de focus van de live beeldvorming zal verstoren. Hebben de andere persoon pas de scherpstelling, terwijl het fixatief wordt toegevoegd. Fixatie is succesvol wanneer onmiddellijke stop van de beweging wordt waargenomen. Fixatief Naar 1 en 1 'daarna reservoir.
      OPMERKING: Tijdelijke photobleaching van de lading fluorescentie kunnen ook worden waargenomen, maar de fluorescentie aanhoudt nadat IF kleuring voor motor-eiwitten is afgerond (volgende stap).
      OPMERKING: Paraformaldehyde is schadelijk bij inademing, bij aanraking met de huid en opname door de mond. Irriterend voor de ogen, de ademhalingswegen en de huid. Afvalverwijdering volgens overheidsbepalingen.
2. IF kleuring van motorische eiwitten voor colocalization analyse
   OPMERKING: kwantificering van relatieve niveaus van motorische eiwitten (zoals bepaald door antilichaam kleuring), met betrekking tot individuele bewegende ladingen, valideren en titreer antilichamen zodat het antilichaam-antigeen-bindende verzadigd. Dit wordt gedaan door het bepalen van de specificiteit van het antilichaam met neuronen waarin het eiwit van belang is of knock-out of aangereden, en door het uitvoeren IF analyse met toenemende concentraties antilichaam. Voor negatieve controles, worden neuronen gekleurd met secundaire antilichamen in de afwezigheid van primaire antilichamen. Meer gedetailleerdeBeschrijving van antilichaam validatie vindt in Encalada et al. ¹⁶ en Szpankowski et al. ^20.
   1. Verwijder het dekglaasje met hippocampusneuronen geteeld in microfluïdische apparaat uit de microscoop podium. Gebruik het microfluïdische apparaat niet los van het dekglaasje, zoals de microkanalen nodig om de fase en vaste beelden af ​​intact blijven. Voer de volgende stappen in een vochtige kamer.
   2. Om de stroom van oplossingen in de microkanalen garanderen handhaven buffervolume verschil tussen reservoirs 1, 1 'en 2, 2' ten minste 30 ui. in alle daaropvolgende stappen. Bijvoorbeeld, voeg 100 ul medium volume microfluïdische reservoir 2, 2 ', en 70 pl media volume microfluïdische reservoir 1, 1'.
   3. Verwijderen fixatief van de kamers van het microfluïdische apparaat en wassen cellen driemaal met PBS 10 min wachten tussen wasbeurten.
   4. Permeabilize cellen door 0,1% Triton X-100 Diluted in PBS gedurende 5 min alle reservoirs.
   5. Verwijder oplossing uit alle reservoirs en wassen met PBS. Herhaal dit drie keer wassen wachten 10 min tussen de wasbeurten.
   6. Verwijder oplossing uit alle reservoirs en toepassing blokkerende buffer bevattende 10% Normaal Ezel Serum en 3% protease vrij en immunoglobuline G (IgG) vrij BSA in PBS en incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Spin primair antilichaam stockoplossing bij 20.000 xg gedurende 5 minuten om neerslagen te verwijderen. Verdun antilichaam aan een geschikte concentratie in blokkerende buffer. Vervang de blokkerende buffer van microfluïdische apparaat met antilichaam oplossing. Incubeer monsters gedurende 2 uur bij KT of O / N bij 4 ° C.
   8. Verwijder oplossing uit alle reservoirs en was driemaal met PBS, 10 min wachten tussen wasbeurten.
   9. Spin secundair antilichaam stockoplossing bij 20.000 xg gedurende 5 minuten om neerslagen te verwijderen. Verdun antilichaam aan een geschikte concentratie in blokkerende buffer. Vervang PBS met secundair antilichaam oplossing. Broedenmonsters gedurende 1 uur bij KT.
   10. Verwijder oplossing uit alle reservoirs en was driemaal met PBS, 10 min wachten tussen wasbeurten.
   11. Vervang PBS met ~ 10-20 ul fixeermiddel door direct pipetteren fixeermiddel in de opening van de kanalen verbinden de reservoirs. Laat de montage media drogen ~ 20 min - 1 uur bij kamertemperatuur.
   12. Opslag apparaten op 4 ° C beschermd tegen licht te vermijden fotobleken en beeld axonen binnen twee dagen (maximaal één week) van kleuring.
   13. Na het kleuren is voltooid, monteren dekglaasje met hippocampusneuronen geteeld in microfluïdische apparaat op de microscoop podium. Zoek het gebied van de getransfecteerde axon afgebeeld in stap 4.1.1-4.1.7.
   14. Verwerven Z-stack afbeeldingen (300 nm treden) voor elk van de drie kanalen: lading, motor 1, motor 2, met een objectief met hoge resolutie (bijvoorbeeld een hoge numerieke apertuur olie of water objectief).
       OPMERKING: Verwerving van Z-stacks is belangrijk als axonen vaak niet perfect vlak groeienin microkanalen en dus niet alle fluorescerende puncta in hetzelfde focal plane.
3. Cargo Mapping
   1. Genereer een kymograaf van vracht-verkeer met behulp van software voor beeldanalyse. De ImageJ plugin ontwikkeld door Rietdorf en Seitz (EMBL) wordt aanbevolen voor het genereren kymographs (te downloaden zie Materials List).
      OPMERKING: ImageJ is een publiek domein, Java-gebaseerde beeldverwerking programma ontwikkeld aan de National Institutes of Health ^27,28 (te downloaden zie Materials List).
   2. Lijn de stilstaande beelden van de fluorescerende lading (opgewekt in stap 4.2.14) handmatig door superpositie ze op de positie van de banen in de kymograaf op het fixatiepunt (figuur 2A, B), met een algemeen verkrijgbare grafische software (Materials lijst). Handmatig uitlijnen door eerste afbeelding van de vaste lading superpositie op de kymograaf en handmatig kiezen van de lading puncta die overeenkomt met een specifiek traject opde kymograaf. Voor de beste uitlijning resultaten gebruikt de Z slice dat is in het beste focus voor de lading in kaart gebracht. Verscheidene Z segmenten worden gebruikt.
   3. Voor elk beeld in de Z-stack (cargo, motor 1 en motor 2, gegenereerd in stap 4.2.14) bepalen de XY-coördinaten en intensiteit amplitudes voor elke fluorescerende puncta via een vastgestelde algoritme voor 2D Gaussische passen bij de puntspreidingsfunctie dat vertegenwoordigt elke puntbron in elk van de drie kanalen ^16,20,21 (figuur 2D).
      OPMERKING: Om de XY coördinaten, een op maat gebouwde MATLAB software pakket genaamd "Motor colokalisatie" werd ontwikkeld ^16,20, wat een Gauss fitting algoritme ontwikkeld door Jaqaman, Danuser en collega's ^21-23 bevat verkrijgen. Het softwarepakket en gedetailleerde instructies voor het gebruik ervan kan worden verkregen op aanvraag.
   4. Voor elk van de individuele lading puncta die werden in kaart gebracht op de mobiele of vaste trajecten op de kymograaf, selecteert tHij XY coördinaten en intensiteit amplitudes van de resultaten van het programma "Motor colocalization" (deze ladingen individueel geëtiketteerd in figuur 2B). Gebruik meerdere Z-stack beelden verkregen in stap 4.2.14) om meer ladingen die zijn gevonden op verschillende brandpunten vliegtuigen in kaart.
   5. Vergelijk de individuele XY coördinaten voor de toegewezen lading die verkregen voor elk van de motor kanalen in de overeenkomstige Z-segment (Figuur 2D). Bepaal en selecteer de XY motor coördinaten die binnen een straal van 300 nm van de lading. Voor ladingen en motoren dat signaal binnen dezelfde focal plane hebben, gebruik dan de "Motor colokalisatie" softwarepakket om de puncta die zich bevinden binnen een straal van 300 nm te bepalen.

Resultaten

Figuur 1 toont een overzicht van de microfluïdische inrichting waarmee hippocampale neuronen groeien (Figuur 1A, B). Neuronen worden uitgeplaat in reservoir 1. De grootte van de microkanalen voorkomt de diffusie van cellichamen (soma) in het axonale compartiment terwijl de lengte van de kanalen voorkomt dendritische uitsteeksels vanaf kruising tot aan het axonale compartiment. Na ~ 2-3 dagen in cultuur, beginnen de neuronen een verlenging van hun axonen over microkanalen in het axonale ...

Discussie

De hier gepresenteerde protocol kan de correlatie van gerichtheid verkeer van individuele fluorescerende microtubule gebaseerde bewegende lading deeltjes met het type en de relatieve hoeveelheid geassocieerde motor eiwitten in levende neuronen. Eerder, de totale motor samenstelling van axonale vesiculaire lading werd getest op heterogene populaties van biochemisch gezuiverd blaasjes en organellen ^9,15. Echter kenmerkend motor samenstelling voor één soort lading in cellen uitdagend v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
poly-L-lysine	Sigma	P5899-20mg
D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x)	Life Technologies	11965092
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	10082147
Neurobasal-A Medium (1x)	Life Technologies	10888022
B-27 Serum Free Supplement	Life Technologies	10888022
GlutaMAX I Supplement (100x)	Life Technologies	35050061
HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution)	Life Technologies	24020117
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x)	Life Technologies	14190250
Penicillin/Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140122
Corning cellgro Water for Cell Culture	Fisher Scientific	MT46000CM
Papain	USB Corporation	19925
DL-cysteine HCl	Sigma-Aldrich	C9768
BSA (bovine serum albumin)	Sigma-Aldrich	A7906
D-glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DNAse I grade II	Roche Applied Sciences	10104159001
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027
Formaldehyde Solution 16% EM Grade	Fisher Scientific	50980487	Let op: Schadelijk bij inademing, bij contact met de huid en indien ingeslikt. Irriterend voor ogen, ademhalingswegen en huid. Weggooien volgens de officiële voorschriften.
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
HEPES	Sigma	H-3375
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-0121
BSA fatty acid and IgG free	Jackson Immuno Research	001-000-162
Acetone	Fisher Scientific	BP2403-4
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-100
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934
Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm	Corning	2980-244
Axis microfluidic device, 450 µm	Millipore	AX450
Adobe Photoshop	Adobe
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon
Coolsnap HQ camera	Roper Scientific
60 mm cell culture dish	Fisher Scientific	12-565-95
150 mm cell culture dish	Fisher Scientific	12-565-100
Antibodies Used:
Anti-Kinesin light chain, V-17	Santa Cruz	sc-13362	specificiteit geverifieerd met behulp van KLC1-/- neuronen (Ref. 16), aanbevolen verdunning 1:100.
Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325	Santa Cruz	sc-9115	specificiteit geverifieerd met behulp van shRNA tegen DYN1HC1 (Ref. 16), aanbevolen verdunning 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody	Life Technologies	A10042	aanbevolen verdunning 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A31573	aanbevolen verdunning 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody	Life Technologies	A11057	aanbevolen verdunning 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A21447	aanbevolen verdunning 1:200.
Plugins en Macro's
ImageJ			http://imagej.nih.gov/ij/index.html.
ImageJ Kymograph Plugin			http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.