Grondmonstername en isolatie van Entomopathogene Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidea)

Samenvatting

Entomopathogene aaltjes-grondbewonende rondwormen die een brede waaier van insecten parasiteren. We tonen bemonsteringsmethoden voor de isolatie van deze nematoden uit de bodem met behulp van twee technieken: de insecten lokken en de gewijzigde White val, voor het herstel van nematoden uit bodemmonsters en geïnfecteerde insecten kadavers, respectievelijk.

Samenvatting

Entomopathogene nematoden (aka EPN) vormen een groep van-grondbewonende nematoden die een brede waaier van insecten parasiteren. Deze aaltjes behoren tot twee families: Steinernematidae en Heterorhabditidea. Tot nu toe hebben meer dan 70 soorten beschreven in de Steinernematidae en er zijn ongeveer 20 soorten in de Heterorhabditidea. De nematoden hebben een mutualistische partnership met Enterobacteriaceae bacteriën en samen vormen ze fungeren als een krachtig insecticide complex dat een breed scala aan soorten insecten doodt.

Hierin, richten we ons op de meest gebruikte technieken in aanmerking komen voor het verzamelen van EPN uit de bodem. Het tweede deel van deze presentatie richt zich op de insecten lokken techniek, een veel gebruikte aanpak voor de isolatie van EPN uit bodemmonsters, en de gewijzigde Witte trap techniek die wordt gebruikt voor het terugwinnen van deze nematoden uit besmette insecten. Deze methoden en technieken zijn belangrijke stappen voor de succesvolle oprichting van EPN cultgelen in het laboratorium en ook de basis vormen voor andere bioassays dat deze nematoden beschouwen als modelorganismen voor onderzoek in andere biologische disciplines. De in deze presentatie technieken overeenkomen met de uitgevoerde en / of door de leden van SP De laboratorium als die beschreven door verschillende auteurs.

Inleiding

Veel nematoden worden geassocieerd met insecten en hun gastheer interacties variëren van gunstig schadelijk. Hierin, richten we ons op een groep van nematoden die ziekteverwekkers van insecten, ook wel bekend als entomopathogene nematoden (of EPN). Twee nematode families behoren tot deze groep van nematoden: Steinernematidae en Heterorhabditidea ^11,13. Hun pathogene effect is in feite door hun interactie met facultatief anaërobe darmbacteriën (Xenorhabdus bacteriën associëren met steinernematids en Photorhabdus bacteriën associëren met heterorhabditids) ² toegekend. De bacteriën worden gevectoriseerd van de ene host naar de andere insecten door de enige vrij levende aaltjes moment de derde-fase infectieuze juveniele (ook bekend als dauer jeugdcriminaliteit, infectieuze jeugdige of IJ), die leeft in de bodem. Eenmaal binnen het insect, de aaltjes laat de bacteriën in hemolymph het insect, die het insect host door massale bloedvergiftiging doden. De bacteriën ookdegraderen weefsels van het insect en word voedselbron de aaltjes ', waardoor ze om te rijpen en zich te vermenigvuldigen. Meestal een of twee generaties van volwassen nematoden worden geproduceerd binnen het insect kadaver. Het nageslacht van de laatste generatie volwassen reassociates met enkele bacteriële cellen in een meer gespecialiseerd wijze dan hun vorige voeding relatie, en voeden deze cellen in de darmen zoals zij uit te gaan van de insecten karkas in de grond waar andere insecten zullen wachten tot parasiteren ^6,11,14 (figuur 1).

Sinds hun ontdekking in 1927, hebben EPN beschouwd als waardevolle alternatieven voor chemische bestrijdingsmiddelen als ze een breed scala aan insecten die landbouwongedierte ^3,4,5 zijn kunnen parasiteren. Echter, in de afgelopen twee decennia, deze nematoden en hun symbiotische bacteriën zijn erkend als een kneedbare modelsysteem voor het bestuderen van biologische, ecologische en evolutionaire aspecten van gastheer-microbe Interactio¹⁴ ns.

Het doel van deze presentatie is om de methoden en technieken het meest gebruikt voor de bemonstering en de isolatie van EPN bodem vertonen. Een verscheidenheid aan instrumenten is beschikbaar en kan worden gebruikt voor het verzamelen van bodemmonsters inclusief: bodem corers, troffels, post-gatengravers, grondboren, bemonstering buizen, met de hand schoffelen, onder anderen (figuur 2).

Afhankelijk van het doel van het onderzoek kunnen twee monsters strategieën beschouwd: a) gestratificeerd, b) steekproefsgewijze (figuur 3). De gestratificeerde steekproef wordt meestal gebruikt als onderdeel van een intensieve studie in een specifieke of demarked gebied gedurende een bepaalde periode. In het algemeen wordt een transect demarked en bodemmonsters genomen vastgelegd intervallen in het transect gedurende een tijdsperiode (figuur 3A) ^15. De aselecte steekproef wordt in het algemeen toegepast bij het scherpstellen op een uitgestrekt gebied. Deze bemonstering strategie werd gebruikt voor het bestuderen van de diversiteit van EPN from een groot geografisch gebied of regio (Figuur 3B) ^12. Een aantal factoren kunnen worden beschouwd, afhankelijk van de focus van de studie, waaronder een diverse waaier van verhogingen, bodemtexturen en habitats (bv., Akkers, bossen, weilanden, parken, zeekusten, oeverstaten gebieden, etc.).

We tonen de insecten lokken techniek, die oorspronkelijk werd beschreven door Bedding en Akhurst ¹ en staat voor een eenvoudige en selectieve alternatief voor het herstellen van EPN van bodemmonsters. Dit is een selectief procedure die is gebaseerd op de vooronderstelling dat de nematoden (IJ fase) wordt aangetrokken door een insect gastheer en het parasiteren. Deze techniek kan ook worden beschouwd voor isolatie van andere insecten pathogenen zoals schimmels, bacteriën en ^8,10.

We tonen ook gemodificeerde Witte trap techniek die wordt gebruikt voor het ophalen nematode nakomelingen van geïnfecteerde insect gastheren ^7,14. Dit is een moeiteloze voldaanhod dat het voordeel van het ophalen van een 'schone' nematode nakomelingen vrij van vuil uit de vernederende insect kadavers biedt.

Tenslotte, de beschreven en in dit artikel technieken overeen met die bedacht en / of uitgevoerd en in ons laboratorium die beschreven door verschillende collega's en medewerkers.

Protocol

1. Soil Sample Collection

1. Overwegen met betrekking tot een minimale oppervlakte van 2-4 m ² voor elk bemonsterd.
2. Verzamel bodemmonsters op een diepte van ten minste 15 cm (figuur 4).
3. Neem ten minste 5 steekproeven binnen dit gebied.
4. Neem 3 submonsters per monster. Afhankelijk van het doel van de studie, ofwel combineren deelmonster of houd ze apart.
5. Plaats elk monster in een plastic zak. Overweeg dubbel-zakken om het lekken van monsters (figuur 4) te vermijden.
6. Label monsters met een watervaste stift. De volgende gegevens bevatten uit elke bemonstering site: Site informatie (inclusief plaats / regio / naam van de site en GPS coördinaat informatie), datum, habitat, bijbehorende vegetatie, temperatuur, hoogte, etc.
   OPMERKING: Indien van toepassing, te verzamelen en / of opnemen van de aanwezigheid van insecten of andere ongewervelden verzameld met het monster voor latere identificatie. Zij kunnen potentiële natuur vertegenwoordigenal. EPN gastheren.
7. Clean verzamelen gereedschap tussen de monsters door het grondig wassen met water en / of desinfecteren met 70% ethanol of 0,5% bleekwater oplossing.
8. Houd monsters in een koeler (8 - 15 ° C) tijdens het vervoer naar het laboratorium.
9. Neem een ​​deel van het grondmonster voor analyse naar informatie over bodemsamenstelling textuur, vochtigheid, geleidingsvermogen of andere gewenste bodemparameters verkrijgen.

. 2 Nematoden Isolatie van bodemmonsters: Insect-uitspanning Techniek

1. Verwijder alle vuil (dwz., Rotsen, stukken hout of schors, bladeren, enz.) Verzamelde met uw monsters om besmetting met saprobische micro-organismen te voorkomen.
2. Voeg water om de grond te bevochtigen en de beweging van nematoden vergemakkelijken.
   OPMERKING: Gebruik een spray fles langzaam te verhogen het vochtgehalte van de bodem.
3. Plaats ongeveer 200 tot 250 ml vochtige grond in een schone plastic container met een deksel.
4. Voeg insect aas. Overweeg 5 tot 10 insecten aan het bodemoppervlak van elk monster (Figuur 5).
5. Bedek de container met een deksel en zet containers ondersteboven.
6. Handhaaf containers in het donker bij kamertemperatuur (meestal 22-25 ° C).
7. Controleer containers elke 2-3 dagen en het verwijderen van dode insecten.
   OPMERKING: voeg extra gezonde insecten elke container voor verdere ophitsing van het bodemmonster.
8. Verwijder dode insecten uit de containers. OPMERKING: Kadavers met een bruine of okerkleurige kleur worden meestal geparasiteerd door steinernematids, terwijl steenrood tot donker paars kadavers worden geparasiteerd door heterorhabditids.
9. Spoel kadavers in steriel water.
10. Plaats kadavers in een gewijzigde Wit val voor herstel van de nematode nageslacht (zie onderstaande procedure).

. 3 Nematoden Herstel van Infected Cadavers: Gewijzigde Wit Trap

1. Plaats de bovenkant van een 50 (of 60) mm diam. Petrischaal in een grotere schaal (100 mm).
2. Stel een zondegle cirkelvormige filtreerpapier (Whatman nr. 1) in de kleinere schaal.
3. Plaats kadavers op het filterpapier van de kleinere schaal en zorg ervoor kadavers elkaar niet aanraken om verontreiniging te voorkomen.
4. Vul het buitenste (grotere) petrischaal met ca. 20 ml steriel gedistilleerd water. Geen water toe te voegen in het gerecht dat de kadavers houdt.
5. Bedek de grote petrischaal en de inhoud van het deksel (figuur 6).
6. Label gerechten dienovereenkomstig. Voeg de volgende informatie: naam Nematoden (soorten / isolaat), infectie (datum besmetting werd vastgesteld) en val datum (dit is de datum van de val is ingesteld).
7. Houd val bij KT tot ontstaan ​​van infectieuze juveniele stadia (IJs) optreedt. Dit proces kan tussen de 10 nemen - 25 dagen, afhankelijk van de nematode soort en / of stam beschouwd.
8. Oogst water met IJs door het verwijderen van de grotere schaal van de val en het gieten van water met nematoden in een bekerglas.
9. Laat nematoden bezinken naar de bodem van de bEaker. Dit proces kan enkele minuten duren.
10. Giet water voorzichtig, waarbij u nematoden blijven in de bodem van het bekerglas.
11. Spoel nematoden door het toevoegen van meer water en het toestaan ​​van nematoden te decanteren. Deze stap kan worden herhaald 2-3 keer totdat het water schoon is.
12. Plaats nematode suspensie in een weefselkweek kolf (250 ml). Houd concentratie van de suspensie tot 1000 - 3000 nematoden / ml.
13. WINKEL kolf nematode suspensie in een koude kamer of in incubator van 10 - 20 ° C.
    NB: controleer opgeslagen flessen periodiek houdbaarheid van EPN is variabel. Meestal steinernematids kan worden opgeslagen voor 6 - 12 maanden, zonder de noodzaak van subcultuur, terwijl heterorhabditids meer periodieke check-ups kunnen vereisen.

Resultaten

Grondmonster Collection

Derde fase infectieuze jonge exemplaren van EPN zijn de enige vrij levende stadia in de levenscyclus van deze nematoden 'die wonen in de bodem (figuur 1). Daarom grondmonsters is een zeer efficiënte methode om te herstellen van deze nematoden. Figuur 4 toont een bodemprofiel waarin de diepte waarop de monsters moeten worden genomen. Het behoud van het vocht van een monster is een belangrijke factor voor de overleving van de nemato...

Discussie

Dit is de eerste demonstratie van twee vormen die een aantal technieken die algemeen worden gebruikt voor het bestuderen EPN en hun symbiotische bacteriën beschrijven. Deze technieken vormen belangrijke stappen voor de succesvolle oprichting van EPN culturen in het laboratorium en vormen tevens de basis voor andere bioassays die EPN in dienst als modelorganismen voor onderzoek.

Diverse bodemonderzoeken van EPN hebben aangetoond dat hun omvang en de verspreiding kan variëren over seizoenen, h...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	Voor insectenloktechniek
Filterpapier, 55 mm Grade 1 Cellulose	Whatman/VWR	28450-048	Infectiekamer en White trap-assemblage
60 x 15 mm Petrischotels	VWR	25384-092	Infectiekamer en White trap-assemblage
100 x 15 mm Petrischotels	VWR	25384-088	Infectiekamer en White trap-assemblage
ZIPloc plastic zakjes	Ace Hardware of lokale ijzerwarenwinkel		Boemboorproef
Mechanische pipettor P1000, P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	Infectiekamer en White trap-assemblage
Pipettops 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	Infectiekamer en White trap-assemblage
Bleach	Ace Hardware of lokale ijzerwarenwinkel		Boemboorproef, desinfectie
Natriumhypochloriet	Ace Hardware of lokale ijzerwarenwinkel		Boemboorproef, desinfectie
70% Ethyl alcohol	AAPER	17212945	Boemboorproef, desinfectie
Schoppen	Ace Hardware of lokale ijzerwarenwinkel	N/A	Boemboorproef
Tubulaire bodemmonsternemer	Accuproducts		Boemboorproef
Bodemsonde, lange handgreep	Nupla	PRB4T 69401 Classic	Boemboorproef
Meetlint	Ace Hardware of lokale ijzerwarenwinkel		Boemboorproef
Markeerband, verschillende kleuren	Ace Hardware of lokale ijzerwarenwinkel		Boemboorproef
Weefselkweekflacons	VWR	Falcon, 29185-304	White trap, verzameling van EPN
Wasflessen, polyethyleen, brede mond	VWR	16650-107	White trap, verzameling van EPN