Cardiale genexpressie profielen te analyseren tijdens zebravis ontwikkeling van het hart, heeft totaal RNA worden geëxtraheerd uit geïsoleerde harten. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten door snelle handmatige dissectie van de zebravis embryo's tot cardiale-specifieke mRNA te verkrijgen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De zebravis embryonale hart is samengesteld uit slechts een paar honderd cellen, die slechts een klein deel van de gehele embryo. Daarom, om de cardiale transcriptoom van wordt gemaskeerd door het wereldwijde embryonale transcriptoom voorkomen, moet voldoende harten voor verdere analyse te verzamelen. Zoals zebravis hartontwikkeling snel verloopt, hart inzameling en RNA winningsmethoden moet snel zijn om de homogeniteit van de monsters te verzekeren. Hier presenteren we een snelle handleiding dissectie protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten van de zebravis embryo's. Dit is een essentiële voorwaarde voor verdere cardiaal-specifieke RNA-extractie cardiale genexpressie te bepalen door transcriptoom analyse, zoals kwantitatieve real-time polymerase-kettingreactie (RT-qPCR). De methode is gebaseerd op differentiële klevende eigenschappen van de zebravis embryonale hart in vergelijking met andere weefsels; Dit maakt een snelle PHYsieke scheiding van cardiale van extracardiale weefsel door een combinatie van vloeibare dwarskracht verstoring stapsgewijze filtratie en handmatige verzameling van transgene fluorescent gelabelde harten.
Inleiding
Zebravis (Danio rerio) wordt veel gebruikt in ontwikkelingsbiologie in organogenese in vivo te bestuderen vanwege zijn snelle, transparante en buitenbaarmoederlijke embryonale ontwikkeling, in combinatie met de geringe omvang en de beschikbaarheid van transgene reporter lijnen met weefsel-specifieke expressie van fluorescerende eiwitten. Dit kleine gewervelde is bijzonder geschikt voor hartontwikkeling studeren, omdat oxygenatie van de vroege zebravis embryo niet afhankelijk hartslag en bloedstroom; Deze functies zijn toegelaten de karakterisering van grote aantallen cardiovasculaire mutanten 1,2 en de zebravis is nu algemeen erkend modelorganisme hartziekten 3 bestuderen.
Om de genexpressie te bestuderen tijdens de embryonale ontwikkeling, zijn transcripties vaak geanalyseerd door geheel-mount in situ hybridisatie (WISH) 4, RT-qPCR 5, microarrays 6, of next generation sequencing (RNA-Seq) 7. TerwijlWISH kan een ruimtelijk-temporele analyse van genexpressie in het gehele embryo worden transcript niveaus gewoonlijk bepaald door RT-qPCR, microarrays of RNA-Seq benaderingen. Deze werkwijzen vereisen weefsel verrijking voor genexpressie profilering.
Omdat het zebravis embryonale hart slechts een klein deel van de gehele embryo, transcriptoom studies gedurende cardiale ontwikkeling vereist een protocol voor dissectie en verrijking van harten. Bovendien fysiologisch relevante gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om de cardiale weefsel volledig functioneel tot RNA-extractie behouden. We beschrijven hier een protocol voor het snel isoleren fysiologisch normaal en kloppende harten van honderden zebravis embryo's van hoge kwaliteit RNA monsters efficiënt te krijgen voor verdere analyses. De onderhavige werkwijze is gebaseerd op het protocol beschreven door Burns en MacRae, 2006 8. Voor verrijking van hartweefsel beide methoden een transgene myocardiale reporter lijnen profiteer van de differentiële hechting eigenschappen van de zebravis embryonale harten versus andere weefsels. Kort pipetteren veel embryo en neer door een smalle pipetpunt, harten gelijktijdig vrijkomen uit embryonale organen en vervolgens gescheiden uit embryonale puin in twee stappen snel filtreren; fluorescent gelabelde harten worden vervolgens handmatig gesorteerd blijft vuil en verzameld voor verdere verwerking.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol volgt de verzorging van dieren richtlijnen van de Duitse en Berlijn staat de wet; zebravis administratiekosten werd gecontroleerd door de lokale autoriteiten voor de bescherming van dieren (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. Het verkrijgen van zebravis embryo's voor Hart Extraction
- Kruis cardiale reporter zebravis, zoals de Tg (myl7: EGFP) twu34 transgene lijn 9 om embryo's te verkrijgen met hart-specifieke GFP expressie.
- Handhaving van de embryo's in ei water bij 28,5 ° C tot de gewenste embryonale fase 10,11. Zorg ervoor dat de verzamelde embryo bevolking homogeen is zowel genetisch en door ontwikkelingsstadium om variaties in genexpressie te beperken.
- Dechorionate de embryo's handmatig.
2. Ontleden de zebravis embryonale Hearts
OPMERKING: Houd alle oplossingen op het ijs. Indien mogelijk, doe teamwork: één persoon ontleedt de harten van de EMBzelfgerolde sigaretten toe terwijl een ander sorteert de harten onder de fluorescentie stereomicroscoop. Dit maakt de verwerking van verscheidene honderden embryo's in een paar uur.
- Breng ongeveer 100 embryo's in een 1,5 ml centrifugebuis. Verdoven de embryo's met tricaïne (0,16 mg / ml in medium E3). Tijd na de embryo duidelijk verdoofd (en niet zwemmen en sediment naar de bodem van de buis, maar hun hart nog kloppen).
- Verwijder de tricaïne / E3 oplossing en was het embryo eenmaal met 1 ml L-15/10% FBS medium en op ijs handhaven.
OPMERKING: De L-15/10% FBS medium belang organen en cellen in leven gedurende de gehele dissectie totdat de harten werden overgebracht naar RNAlater of Trizol. - Voeg 1 ml L-15/10% FBS medium om de embryo's en pipet op en neer 5-8 keer met een Round Gel Laden Tip totdat de dooier volledig wordt verstoord. Pipetteer de embryo druppelsgewijs op het oppervlak van de oplossing, zodat de druppel barsten ende embryo's worden voorzichtig verstoord.
OPMERKING: Hoe krachtig en hoe vaak de embryo's hebben om te worden gepipetteerd en neer hangt af van het ontwikkelingsstadium van het embryo, dat wil zeggen meer pipetteren nodig is op de late stadia (bijvoorbeeld bij 56 HPF). - Voor de eerste partij ontleed embryo, beoordeelt de integriteit van het embryo en de hoeveelheid ontleed harten onder een stereomicroscoop, aangezien sommige harten blijven aan het embryo als ook voorzichtig gepipetteerd. Pas de wijze van pipetteren de volgende rondes van dissectie dienovereenkomstig.
OPMERKING: Gebruik een lage retentie pipet tips en microcentrifugebuisjes om de harten vast te houden aan het plastic te minimaliseren. - Breng het monster op een 100 um filter geplaatst op een 50 ml centrifugebuis; Spoel 1,5 ml buis met 1 ml L-15/10% FBS medium en breng dit op de filter om verlies van monster te minimaliseren (sommige harten kunnen kleven aan de wanden van de buis). Was het filter tweemaal met 1 ml L-15 / 10% FBS. In deze stap het hart door het filter en worden verzameld in de 50 ml buis.
- Breng de doorstroming op een 30 urn filter geplaatst op een 15 ml centrifugebuis en spoel de filter eenmaal met 1 ml L-15/10% FBS medium. In deze tweede filtratiestap, worden de harten vastgehouden in de filter en kleinere vuil wordt weggespoeld.
- Draai het filter ondersteboven en spoel de harten uit de filter in een 1% agarose gecoate petrischaal door toepassing van drie opeenvolgende wassingen met 1 ml L-15/10% FBS.
- Handmatig scheiden GFP-positieve harten van de fluorescent embryonale vormt (zoals ooglenzen) met een pincet onder een fluorescentie stereomicroscoop en ze te concentreren in het midden van de schaal. Verzamel ze volgens stap 3.
OPMERKING: Als de embryo's ouder zijn dan 24 HPF, moet de harten te kloppen, wat aangeeft dat de weefsels nog fysiologisch normaal.
3. Het isoleren van mRNA uit Dissected Hearts
- Verzamel de harten in het kleinst mogelijke volume (bijvoorbeeld 10 pi) en pipet in een 1,5 ml buis met 0,75 ml RNAlater (op ijs). Controleer of er geen harten blijven in de pipet door het bekijken van het onder een fluorescentie stereomicroscoop.
- Als alternatief, als een chemische kap is verkrijgbaar in de onmiddellijke nabijheid van de fluorescentie microscoop, de overdracht van de verzamelde harten tot Trizol (LET) onder de chemische motorkap. Dit omzeilt het mogelijke verlies van harten steken in de pipet tip en ook tijdens het centrifugeren van de harten (stappen 3.4, 3.5 en 3.7). Bundelen de harten van verschillende rondes van isolatie in dezelfde buis met Trizol en ga direct naar stap 3.8; het eindvolume niet meer dan 10% van het oorspronkelijke TRIzol volume.
LET OP: Lees de Trizol Material Safety Data Sheet (MSDS) voor gebruik. Handvat Trizol reagens onder een kap en slijtage persoonlijke veiligheidsuitrusting is aanbevolen. Contact met de huid, ogen en clothi voorkomenng. Verwijder alle ontstekingsbronnen. - Verzamel de harten van verscheidene rondes van isolatie in dezelfde buis met RNAlater (op ijs), de efficiëntie van RNA isolatie verbetert de hoeveelheid weefsel verzameld. Als de totale steekproef volume van meer dan 10% van de oorspronkelijke RNAlater volume, gebruik dan een extra buis met 0,75 ml RNAlater voor opslag (op ijs).
- Centrifugeer de monsters bij 15.700 xg gedurende 20 min bij 4 ° C om de harten sedimenteren.
- Onder een fluorescentie stereomicroscoop, verzamel voorzichtig zoveel supernatant mogelijk in een 1% agarose gecoate petrischaal die 3 ml L-15/10% FBS medium, maar de gesedimenteerde harten niet verstoren de bodem van de centrifugebuis. Aangezien tot 15% van de harten in de supernatant blijven vanwege de hoge viscositeit van RNAlater, halen ze als beschreven in stap 3.7.
- Onder een chemische motorkap, voeg 0,5 ml Trizol aan de buis met het bezonken harten en blijf op ijs.
- Onder de fluorescerende Micrpe, breng de harten (uit stap 3.5) van de 1% agarose gecoate schaaltje met het RNAlater / L-15/10% FBS oplossing in een 1% agarose gecoate schaal met 3 ml L-15/10% FBS te verdunnen uit de RNAlater. Verzamel de harten in het midden van de petrischaal en overbrengen in een klein volume in de buis gesedimenteerd harten in Trizol onder een chemische kap.
- Vortex 1,5 ml buis met de harten in Trizol het hart verstoren en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Onder een chemische motorkap, voeg 100 ul chloroform (LET), meng en breng de Trizol / chloroform oplossing in een 1,5 ml voorgevulde gesponnen PLG buis (centrifuge 30 sec bij maximale snelheid voor gebruik). Incubeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur.
LET OP: Lees de chloroform MSDS voor gebruik. Handvat chloroform reagens onder een kap en slijtage persoonlijke veiligheidsuitrusting is aanbevolen. Vermijd contact met de huid, ogen en kleding. Uit de buurt van onverenigbare houden zoals metalen, basen. - Centrifugalege het monster bij 15.700 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en breng de waterige fase naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
- Voeg 5-10 gg glycogeen en 250 pl voorgekoeld (bij -20 ° C) isopropanol; Meng goed en incubeer overnacht bij -20 ° C.
- Centrifugeer het monster bij 15.700 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Was de pellet met 1 ml 75% ethanol, centrifugeer bij 15.700 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Laat het ethanol verdampen door drogen de pellet bij kamertemperatuur totdat deze wit (bijv 10-15 min).
- Voeg 20 ul RNase-free DDH 2 O tot de pellet en incubeer gedurende 10-15 min bij 55 ° C om het RNA te lossen; dan blijven op ijs.
- Beoordeel de RNA-concentratie en zuiverheid door absorptie meting. Beoordeel de RNA integriteit door het uitvoeren van het monster op een 1% agarosegel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We beschrijven hier een representatief hart dissectie experiment met behulp van de zebravis Tg (myl7: GFP) twu34 transgene lijn 9, die groen fluorescerend eiwit (GFP) drukt uitsluitend binnen het myocard (afb. 1). We verzamelden zowel ontleed hart en de embryo's waarvan ze zijn afgeleid om de zuiverheid van het hart monster beoordelen. In het kort, homozygote Tg (myl7: GFP) twu34 zebravis 9 werden outcrossed met wild-type, zodat alle embryonale harten wer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol maakt de snelle verrijking van de zebravis embryonale hartweefsel voor genexpressie analyses. De kwantiteit en kwaliteit van de cardiale-specifieke RNA-monster is sterk afhankelijk van een aantal cruciale stappen: eerst wordt de hoeveelheid van het monster sterk verbeterd als het verlies van de harten wordt voorkomen bij elke stap van het protocol, omdat RNA zuivering werkt alleen met voldoende uitgangsmateriaal. Ten tweede, de zuiverheid van het monster, die volledig afhankelijk is van de experimentator, w...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen C. Burns, C. McRae bedanken voor het schetsen van het basisprincipe van dit zuiveringsprotocol, en F. Priller voor de eerste implementatie van deze methode in ons lab. S.A.-S. wordt ondersteund door een Heisenberg-hoogleraarschap van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dit werk werd ondersteund door DFG-subsidie SE2016/7-1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Equipment for raising fish and collecting eggs | zie het Zebrafish Book11 voor details | ||
| Fluorescentie stereomicroscoop | |||
| Gekoelde microcentrifuge | |||
| UV-Spectrofotometer | bijv. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleïnezuur elektroforesekamer | |||
| Petrischalen 4 cm Ø, gecoat met 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipetten en tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5 ml centrifugebuizen | |||
| 15 ml en 50 ml centrifugebuizen | |||
| Paar Dumont #5 pincet | |||
| ExactaCruz™ Ronde Gel Loading Tips in steriele Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5 ml buizen | Prime | 2302810 | |
| Eiwater medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0,00001% (w/v) Methyleen Blauw | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoëzuurethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stamoplossing, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-vrij water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-vrij water of gesteriliseerde DEPC behandelde ddH2O | |||
| Nucleïnezuur laadbuffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer voor elektroforese |
Referenties
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
