Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Samenvatting

Peptide array screening is een hoogdoorlaattest voor het identificeren van interactieplaatsen tussen eiwitten. Dit maakt het mogelijk om meerdere interacties van een doeleiwit in kaart te brengen en kan dienen als een methode voor het identificeren van plaatsen voor remmers die een eiwit aanspreken. Hier beschrijven we een protocol voor het screenen en analyseren van peptide arrays.

Samenvatting

Eiwit-eiwit interacties mediëren meeste processen in de levende cel en controle homeostase van het organisme. Verminderde eiwit interacties kunnen leiden tot ziekte, waardoor eiwit interacties belangrijke drug targets. Het is dus zeer belangrijk deze interacties op moleculair niveau te begrijpen. Eiwit interacties worden bestudeerd met verschillende technieken, variërend van cellulaire en biochemische assays kwantitatieve biofysische bepalingen en deze kan worden uitgevoerd hetzij met volledige lengte proteïnen, met eiwitdomeinen of peptiden. Peptiden dienen als uitstekende tools waarmee eiwit interacties te bestuderen omdat peptiden gemakkelijk kan worden gesynthetiseerd en laat de focus op specifieke interactie sites. Peptide arrays mogelijk zijn om de interactie plaatsen tussen twee eiwitten en het screenen op peptiden die het doelwit eiwit binden voor therapeutische doeleinden. Ze laten ook een hoge doorvoersnelheid SAR studies. Voor de identificatie van bindingsplaatsen, een getypeerdcal peptide matrix bevat meestal gedeeltelijk overlappende 10-20 resten peptiden afgeleid van de volledige sequenties van één of meer partnereiwitten van de gewenste doeleiwit. Screening van de array voor het doeleiwit bindende onthult de bindende peptiden overeenkomend met de bindingsplaatsen in de partnereiwitten, op een gemakkelijke en snelle manier met slechts kleine hoeveelheid eiwit.

In dit artikel beschrijven we een protocol voor het screenen van peptide-arrays voor het in kaart brengen van de interactie plaatsen tussen een target eiwit en haar partners. Het peptide array is ontworpen op basis van de sequenties van de partner eiwitten rekening houdend met hun secundaire structuren. De arrays gebruikt in dit protocol waren Celluspots arrays bereid door Intavis Bioanalytisch Instruments. De array wordt geblokkeerd aspecifieke binding en vervolgens geïncubeerd met het onderzochte eiwit te voorkomen. Detectie met behulp van een antilichaam blijkt de binding peptiden die overeenkomen met de specifieke interactieplaatsen tussen de eiwitten.

Inleiding

Eiwit-eiwit interacties mediëren meeste processen in de levende cel. Verminderde eiwit interacties kunnen leiden tot ziekte, waardoor eiwit interacties belangrijke drug targets. Het is dus zeer belangrijk deze interacties op moleculair niveau te begrijpen. Eiwit interacties worden bestudeerd met verschillende technieken, variërend van cellulaire en biochemische assays kwantitatieve biofysische bepalingen en deze kan worden uitgevoerd hetzij met volledige lengte proteïnen, met eiwitdomeinen of peptiden. Peptiden dienen als uitstekende tools waarmee eiwit interacties te bestuderen. Dit is omdat peptiden gemakkelijk worden gesynthetiseerd en laat het richten op een specifieke interactie plaats enerzijds en meerdere targets in high throughput wijze anderzijds ^1,2. Peptide matrix screening is een snel, gemakkelijk te voeren werkwijze voor het verkrijgen van een grote hoeveelheid gegevens over de interactie van een doeleiwit met talrijke partners in korte tijd ³. In tegenstelling tot andere biochemische of biofysische werkwijzen voor het detecteren en analyseren van eiwit-eiwit interacties, peptide matrix screening vereist een zeer lage concentratie van eiwit en kan detecteren zeer zwakke binding. Peptide arrays kunnen worden gebruikt voor vele toepassingen in peptide-eiwit interacties, zoals in kaart brengen van eiwit-eiwit of receptor-ligand interactie plaatsen ^4, homo- of hetero-oligomerisatie interfaces, karakteriseren antilichamen epitopen ^5, bestuderen enzymactiviteiten ⁶ en high throughput structuur- activiteit (SAR) bestudeert ^7. Voor een diepgaande review over peptide-array screening zie Katz et al. ⁴

Verschillende soorten peptide arrays momenteel bestaan. Er zijn twee belangrijke synthetische strategieën om peptide arrays: synthese van de peptiden voordat ze aan de vaste drager, of synthese van peptiden direct aan de vaste drager, meestal via de SPOT techniek ^4,8. Hetpeptiden gesynthetiseerd op vaste drager gewoonlijk met 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) chemie ^8. Onder de gemeenschappelijke synthetische schema zijn peptide bevestiging via de N-terminus (bijv JPT Pepstar arrays ⁹⁾ en peptide bevestiging via de C-terminus (bijv PEPSCAN pepchip arrays ^10, JPT pepspot arrays ⁹ en Intavis celluspot arrays ^{11) 4.} De vaste drager kan variëren en dus ook de chemie van het peptide koppeling aan. Cys eindigende peptiden kunnen via de thiolgroep ¹² worden bevestigd aan glasplaatjes. De N terminus van een peptide covalent gebonden aan een hydroxylgroep op het cellulose membraan door verestering van het aminozuur bevestigd ^8.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het screenen van peptide arrays als een methode voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties. De matrix we gebruikten de Celluspots array, die een micro-array met grote amount plekken (duplicaten tot 384 spots) op een kleine cellulose membraan ondersteund door een glasplaatje. Dit maakt het werken met lage hoeveelheden eiwitten en antilichamen en het verkrijgen van aanzienlijke hoeveelheid data per afzonderlijk experiment. Deze array bevat ook een hoge dichtheid peptide dat detectie van lage affiniteit binden toelaat. De matrix werd gebruikt voor het afbeelden van de STIL-CHFR interactie, die zeer belangrijk is voor het regelen van normale celproliferatie ^13. Ongecontroleerde interactie tussen de twee eiwitten kan leiden tot de ontwikkeling van kanker. Door het in kaart brengen van deze interactie vonden we de specifieke bindingsplaats en bindende residuen ^14. Dit maakt de weg vrij voor het ontwerpen van een rationele remmers dat deze interactie eiwit-eiwit te remmen.

Protocol

1. Het ontwerpen van een Peptide Array

1. Verdeel de sequentie van het doeleiwit in gedeeltelijk overlappende peptiden 10-20 residuen. Bepalen hoeveel overlapping op de specifieke experiment en de middelen van de uitvoerende lab maar in principe hoe langer de overlap beter. Bij het ontwerpen van de peptiden rekening houdend met bekende secundaire structuur elementen in het eiwit dat verantwoordelijk is voor de interactie kan.
2. Bestel het ontworpen peptide-array via commerciële leveranciers. Hier, gebruik peptiden covalent gebonden aan de matrix via de C-terminus.

2. blokkeren aspecifieke binding

1. Maak een 50 mM Tris of fosfaatbuffer bevattende 0,05% Tween 20 (TBST / PBST) en op de gewenste pH met een afgemeten hoeveelheid HCl of NaOH (om precies ionsterkte kennen) en de gewenste ionsterkte met NaCl . Hier, gebruik een pH van 7,5 en een ionensterkte van 150 mM.
2. Maak een blokkerende oplossing van2.5% (w / v) magere melkpoeder in TBST / PBST.
3. Om niet-specifieke binding te voorkomen, dompel de array in 5 ml blokkeeroplossing. Incubeer de array voor 2-4 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C op een schudinrichting.

3. incuberen met Protein

1. Was de matrix eerst met 5 ml blokkerende oplossing gedurende 30 seconden en vervolgens tweemaal met 5 ml TBST / PBST gedurende 5 minuten op een shaker bij kamertemperatuur.
2. Incubeer de matrix gewassen met 5 ml van His-gemerkt eiwit oplossing bevattende 2,5% (w / v) magere melkpoeder niet-specifieke binding te voorkomen. Hier gebruiken 4.5 uM eiwitoplossing (STIL 500-650) opgelost in de beschreven blokkerende oplossing.
   OPMERKING: Meestal 5-10 uM eiwit worden gebruikt voor de screening, maar de eiwitconcentratie zelfs zo laag als 2-3 uM, afhankelijk van de bindingsaffiniteit en de lokale concentraties van de peptiden die aan de matrix gebonden (efficiëntie van de synthese). De buffer waarin het eiwitopgelost kan variëren, maar is gebruikelijk om het eiwit verdunnen met dezelfde blokkerende oplossing hierboven beschreven.
3. Incubeer de array in de eiwitoplossing gedurende 3-8 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.

4. incuberen met antilichaam

1. Was de serie drie keer met 5 ml TBST / PBST. De eerste wasbeurt is 30 seconden, gevolgd door twee wasbeurten van 5 minuten shaker bij kamertemperatuur.
2. Incubeer de matrix gewassen met 5 ml van verdunde HRP-geconjugeerd antilichaam (1: 1500) in een incubatiebuffer die dezelfde ingrediënten bevat in dezelfde concentraties als de blokkerende oplossing gedurende 1 uur op een schudinrichting bij kamertemperatuur. Het antilichaam kan ofwel het doeleiwit of tag bindt.
3. Controlemetingen experimenten testen van de interactie van het antilichaam met peptiden van de array, vooral indien de array peptiden uit het doeleiwit (bijvoorbeeld voor oligomerisatie studies) door herhaaldelijk hetzelfde protocol zonder step 3, incuberen met het eiwit.
4. Was de serie drie keer met 5 ml TBST / PBST. De eerste wasbeurt is 30 seconden, gevolgd door twee wasbeurten van 5 minuten shaker bij kamertemperatuur.

5. Het lezen van de Array

1. Voeren chemiluminescentie ontwikkeling met een ECL-western blotting substraat kit.
2. Voer de detectie van een luminescerende beeldanalyse.
3. Analyseer de resultaten. Zorg ervoor dat zowel duplicaten op de array vertonen dezelfde signalen, zodat de resultaten betrouwbaar zijn. Indien de structuur van het eiwit partner bekend is, zoekt de structuur van het bindende peptiden en zoek de bindingsplaatsen. Ook peptiden die ver in de sequentie dicht bij elkaar in de tertiaire structuur en een bindingsplaats.

Resultaten

STIL is een zeer belangrijk centrosomal eiwit. Het controleert de normale celdeling en celproliferatie ^{13,15 - 19.} STIL interageert met verschillende eiwitten ^18,20,21, en ​​de meeste interacties plaatsvinden via het middengedeelte, dat een intrinsiek ontvouwen gebied (IDR) ^14. We ontwierpen een serie samengesteld uit peptiden afgeleid van de STIL bindend eiwit CHFR. CHFR is een tumor suppressor die wordt geïnduceerd in reactie op stress ²² mitose. Omdat de structuur van de ST...

Discussie

Peptide-array screening is een uitstekend hulpmiddel voor het identificeren van de bindingsplaatsen van een doelwit eiwit in haar partners. Deze test is gemakkelijk uit te voeren en de resultaten kunnen worden verkregen in één of twee dagen. Peptide matrix screening is veelzijdig en kan worden gebruikt voor vele doeleinden. Het kan gebruikt worden voor het karakteriseren na translatie modificaties zoals fosforylering en substraten te identificeren van kinasen. Bijvoorbeeld: de FLT3 kinase, die gerelateerd is aan acute m...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Peptide array	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Antibody (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Biological industries	20-500-120
Skim Milk	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	FUJI film