Methodenartikel

Met behulp plusTipTracker Software om dynamiek van microtubuli Meet in Xenopus laevis Groei Kegels

DOI:

10.3791/52138

⸱

7 september 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De MATLAB-gebaseerde, open source software pakket, plusTipTracker, kan worden gebruikt voor het analyseren afbeelding reeks van fluorescent gelabelde + tips om dynamiek van microtubuli kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microtubuli (MT) plus-eind volgen eiwitten (+ tips) te lokaliseren aan de groeiende plus-uiteinden van MT's en reguleren MT dynamiek 1,2. Een van de meest bekende en algemeen gebruikte + filtreren voor het analyseren MT dynamiek de End-bindingseiwit, EB1, waarbij alle groeiende MT plus-uiteinden bindt, en dus is een merker voor MT polymerisatie 1. Veel studies van EB1 gedrag binnen de groei kegels zijn tijdrovend en vooringenomen computerondersteunde, met de hand bijhouden methoden gebruikt om individuele MT 1-3 analyseren. Onze aanpak is om globale parameters van MT dynamiek met behulp van het softwarepakket, plusTipTracker 4, na de overname van een hoge resolutie, live beelden van gelabeld EB1 in gekweekte embryonale groei kegels 5 kwantificeren. Deze software is een MATLAB-gebaseerde, open-source, gebruiksvriendelijk pakket dat geautomatiseerde detectie, tracking, visualisatie en analyse voor films van fluorescent-gelabelde + TIP's combineert. Hier presenteren we het protocol voor het gebruik van plusTipTracker voor de analyse van fluorescent-gelabelde + TIP kometen in gekweekte Xenopus laevis groei kegels. Echter kan deze software ook worden gebruikt om MT dynamiek karakteriseren verschillende celtypen 6-8.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze methode is kwantitatieve informatie over microtubuli (MT)-plus-end volgen proteïne (+ TIP) dynamiek in levende groei kegels verkrijgen. MT + TIP's zijn een groep van eiwitten die lokaliseren aan de plus-uiteinden van MT 9,10. Zij voeren een groot aantal functies om de parameters van MT dynamische instabiliteit 11, met inbegrip van de tarieven van de polymerisatie, catastrofe, en redding te reguleren. Een veel gebruikte werkwijze voor het analyseren MT dynamiek het gedrag van de + TIP EB1, dat specifiek bindt aan groeiende MT plus 1,12 details volgen. EB1 is bekend dat een aantal andere eiwitten te werven om aan de groeiende MT plus-ends 13,14, en is onlangs opgericht als een MT rijping factor 15, het bevorderen van zowel MT groei en catastrofe frequentie 15,16.

Veel studies van MT dynamiek binnen de groei kegels zijn hand volgen methoden om veranderingen in EB1-GFP dynamiek in de tijd 1-3 te meten gebruikt, zoals EB1 localizatiop MT plus-uiteinden kunnen worden gebruikt als een marker voor MT polymerisatie. Een belangrijk voordeel voor de behandeling EB1-GFP kometen als een proxy voor de MT groei is dat MT dynamiek kan worden gemeten, zelfs in regio's van belangrijke MT overlap. Hoewel de werkwijze hand bijhouden EB1-GFP kometen nuttige inzichten voorziet in MT gedragingen 1-3, is tijdrovend en kan worden voorgespannen. Bovendien, als afwijkende groei kegel gedrag waarschijnlijk het gevolg van minuut verschuivingen in het cytoskelet dynamiek, het analyseren van slechts een klein deel van de MT's (meestal nodig bij de hand-opsporing) belangrijke informatie kunnen missen.

Zo meten we globaal MT dynamiek parameters met behulp van het softwarepakket, plusTipTracker 4, na de overname van een hoge resolutie, live beelden van gelabeld EB1 in gekweekte embryonale groei kegels 5. Deze software, ontwikkeld in de Danuser Lab, is gebruikt in verscheidene studies karakteriseren MT dynamiek in verschillende celtypen 6-8. Het is een open-source, onser-vriendelijke, MATLAB-gebaseerde pakket dat geautomatiseerde detectie, opsporing, visualisatie en analyse voor films van fluorescent-gelabelde + TIP's omvat. Een lange lijst van specifieke parameters van MT dynamiek wordt berekend door deze software (zie referentie 4 voor details), maar voor de analyse van MT dynamiek in de groei kegels, de meest bruikbare parameters MT groeipad snelheid (in microns / minuut), de groei spoor Levensduur (in seconden) en de groei baanlengte (in microns). De software kan rechtstreeks vanaf de website Danuser Lab te downloaden (onder 'Software'). Terwijl de Danuser Lab ondersteunt momenteel een nieuwere interface voor + TIP bijhouden analyse, die is opgenomen in een software pakket genaamd u-spoor 2.0, de oorspronkelijke, stand-alone software zal beschikbaar blijven. De onderliggende algoritmes tussen beide programma's hetzelfde (althans 2014), met slechts een verschil interface en analyse outputs. Voor de beginnende gebruiker met weinig MATLAB en / of geautomatiseerde analyse experirentie, plusTipTracker heeft meer gebruiksvriendelijke functies, waaronder automatische statistische parameter uitgangen.

Hier beschrijven we de stappen voor het analyseren van beelden van EB1-GFP dynamiek in gekweekte Xenopus laevis groei kegels. Dit protocol werd gebruikt in een recente paper MT dynamiek 17 onderzoeken. Zie ook Lowery et al. 2012 5 voor gedetailleerde instructies over het kweken groei kegels uiten EB1-GFP. Hoewel dit document vooral gericht op EB1-GFP dynamica in groei kegels behandeling kan hetzelfde protocol worden gebruikt voor andere celtypes 17. Voor alle celtypen, moet het tijdsinterval tussen frames tussen 0,5-2 seconden voor optimale + TIP tracking. Een tijdsinterval van maximaal 4 seconden tussen frames mogelijk, maar deze verhoogde interval leidt tot extra spoorvolgfouten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol en de video zijn bedoeld om te dienen als een aanvulling op de oorspronkelijke papieren beschrijving van het softwarepakket in meer detail 4, alsmede het technisch rapport dat wordt geleverd met de software te downloaden op de website Danuser Lab. Lezers worden aangemoedigd om deze documenten zorgvuldig te beoordelen of er extra vragen over het gebruik van de software.

1 Voorafgaand aan beeldanalyse

  1. Convert elke time-lapse film in een reeks van TIFF (Tagged Image File Format) beeldbestanden. Als er meerdere groei kegels / cellen in een bepaalde film, eerste oogst elk groeikegel / cel om zijn eigen reeks beelden te creëren.
    Opmerking: Dit is niet nodig, als afzonderlijke regio-of-interest (ROI) kunnen worden geselecteerd binnen plusTipTracker. Het gebruik van kleinere afmetingen beeld verhoogt de snelheid van de rekenkundige bewerking, dus deze stap wordt aanbevolen als er aanzienlijke lege ruimte in het beeld.
  2. Sla elke TIFF-serie in zijn eigenmap met de naam "beelden" in een pad dat MATLAB is ingesteld op toegang (merk op dat "beelden" is hoofdlettergevoelig). Om een ​​nieuw pad toe te voegen, gaat u naar het desbetreffende bestand directory in het venster "Huidige map", klik met de rechtermuisknop op het pictogram van de map en selecteer "Toevoegen aan Path - Geselecteerde mappen en sub-mappen". Belangrijk is dat de software map plusTipTracker worden toegevoegd aan het pad, ook.

2 plusTipGetTracks

Opmerking: De eerste stap in de beeldanalyse is om de EB1-GFP kometen op te sporen, te koppelen van de kometen in tracks, en het bepalen van de parameters van de dynamiek van microtubuli. Dit wordt verkregen met het commando "plusTipGetTracks" 4.

  1. Tot analyse, geopend MATLAB applicatie beginnen en typ "plusTipGetTracks" in het commando venster. Dit zal leiden tot een nieuw dialoogvenster weergegeven.
  2. Klik op "Set Up New Projects" en kies een (of more) van de vorige TIFF afbeelding serie door de juiste "images" map (of mappen met "beelden" mappen) te selecteren. Na voltooiing van deze stap, een bestandsmap (roi_1) zal worden gemaakt (in dezelfde map die "beelden" houdt) dat zal de toekomst gegevensbestanden bevatten. Let op: de "Set Up New Projects" stap kan van tevoren worden afgerond, tijdens een aparte sessie.
  3. Een nieuw venster zal verschijnen: "Selecteer een veelhoek, klik met de rechtermuisknop op de laatste punt, en klik op 'Create Mask'". Klik op "OK". Het eerste beeld van de geselecteerde afbeelding serie wordt dan weergegeven. Gebruik de muis te klikken en maak een polygoon die het geheel van de groei kegel omvat. Dubbel klik op de muis om de veelhoek te sluiten.
  4. Zodra de veelhoek is gesloten, zal een dialoogvenster verschijnen: "Wilt u nog een ROI te kiezen?" Heeft het beeld een andere groeikegel te analyseren, "Ja"; anders suitverkorenen "Nee".
  5. Selecteer de projecten die onmiddellijk zullen worden geanalyseerd. Klik op "Selecteer Projects" en selecteer de map (roi_X) te analyseren.
  6. Een listSelectGUI scherm verschijnt. Selecteer het project (s) vanaf de linkerzijde van het scherm en verplaatsen ze naar de rechterkant van het scherm. Klik op "OK". Kies een locatie aan de lijst project op te slaan en klik op "Opslaan".
  7. Selecteer "Detectie", "Tracking" en "Post-Processing". Zodra deze selecties zijn gemaakt, zal de rechterkant van het dialoogvenster geconfigureerd worden. Configureer elke optie.
    1. Deze parameters worden gebruikt om gedetecteerd kometen verwijzen naar MT tracks. Details voor de keuze van deze controle parameters voor het bijhouden van zijn opgenomen op de pagina's 9-10 van het Technisch Rapport PDF die het softwarepakket te downloaden begeleidt; Lees dit verslag of de problemen worden ondervonden. Voor de toepassing van het bijhouden EB1-GFP kometen in Xenopons laevis groei kegels, gebruikt u de volgende Tracking Instellingen: Zoeken in een straal van Range (pixels) 5-12, Minimum Sub-Track Lengte (frames) 3; Max Gap Lengte (frames) 8; Max Krimp Factor 0.8, Max hoek Voorwaarts 50, Max hoek achteruit 10, Fluctuation Radius 2.5. Deze instellingen worden getoond in figuur 1.

    Opmerking: Max Krimp Factor ingesteld op het aantal "backward gaps" gedetecteerd, want een "backward gaten" niet bruikbaar te analyseren in de context van groei kegels, gezien de overvolle omstandigheden die fouten in spoor bindingen. Bovendien, zowel Max doorgeven hoek en fluctuatie Omgeving liggen relatief hoog, zoals groeikegel MT vertonen kleine frequent translocaties naast groei en krimp, en verhogen deze besturingsinstellingen maakt deze verhoogde beweging in de koppeling stap.
    1. Vul in het Post-Processing Instellingen, afhankelijk van de gewenste specifieke beeldaanwinst instellingen.
  8. Zodra de instellingen zijn geconfigureerd, klikt u op "Start". De software zal draaien welke instellingen zijn geselecteerd. Dit kan minuten tot uren, afhankelijk van het aantal geselecteerde projecten en hun grootte. De Command Window geeft de geschatte resterende tijd voor elke functie. Wanneer de plusTipGetTracks stap is voltooid, zal het Command venster weer te geven "Klaar!"
    Opmerking: Een lange lijst van specifieke parameters van MT dynamiek zijn nu berekend door deze software (zie referentie 4 voor details), maar voor de analyse van MT dynamiek in de groei kegels, de meest bruikbare parameters te onderzoeken zijn MT groeipad snelheid (in microns / minuut), groeispoor levensduur (in seconden) en de groei baanlengte (in microns).

3 plusTipSeeTracks

Opmerking: Nu de microtubuli tracks zijn gedefinieerd, de functie "plustipSeeTracks" wordt gebruikt voor het spoor visualisatie 4. Deze functiekan bieden meerdere uitgangen voor visualisatie, inclusief ruimtelijke MT dynamiek kaarten en speed films, maar hier ligt de focus uitsluitend op het gebruik van "Track Movies" naar MT tracks bovenop de groeikegel beelden weer te geven. Terwijl plusTipGetTracks kan analyseren meerdere films op een moment, kan plusTipSeeTracks alleen analyseren een film tegelijk.

  1. Typ "plusTipSeeTracks" in het commando venster.
  2. Na het dialoogvenster wordt geladen, klik op "Select Project". Selecteer de bovenliggende map met het project te visualiseren en klik op "Select Folder". Een nieuw venster wordt weergegeven: "Selecteer het project dat u wilt visualiseren". Kies het bestand om te visualiseren en klik op "OK".
  3. Vervolgens klikt u op "Selecteer Opgeslagen ROI". Navigeer naar dezelfde roi_X map als de in de vorige stap een en selecteer het bestand met de naam "roiYX".
  4. Klik op "Select Output Directory 'voor de omschrijving whier MATLAB zal de baan visualisatie bestanden op te slaan. Opmerking: Wij raden het gebruik van dezelfde map met de rest van de gegevens bevat.
  5. Selecteer "Maak Track Movie" en een scherm zal verschijnen met alle tracks plusTipGetTracks berekend op basis van de + TIP kometen. Deze stap slaat de bijgehouden tijdreeksen in een film formaat, in het bestand "allTracks_X_X_X". Er is een optie voor het opslaan van de film als AVI, anders is de standaard indeling is als een Quicktime.mov bestand.

4 plusTipGroupAnalysis

Opmerking: Deze laatste functie wordt gebruikt om groepen van films te maken voor analyse en vergelijking van hun MT spoor parameters.

  1. Typ "plusTipGroupAnalysis" in het commando venster. Om de groepen handmatig te selecteren om te vergelijken, eerst de-selecteer "Auto groep van hiërarchie". Klik vervolgens op "Select projecten". Navigeer naar de bovenliggende mappen met daarin alle roi_X mappenanalyseren.
  2. Een listSelectGUI scherm verschijnt. Selecteer alle projecten in de groepen op te nemen vanaf de linkerkant van het scherm en beweeg ze over naar de rechterkant van het scherm. Klik op "OK". Kies een locatie aan de lijst project op te slaan en klik op "Opslaan".
  3. Er verschijnt een venster: "Selecteer de eerste groep in de lijst". Klik op "OK". Het venster listSelectGUI zal opnieuw weer te geven. Deze keer, selecteer alleen de bestanden die overeenkomen met de eerste groep die samen moeten worden samengevoegd. Klik op "OK".
  4. Voer vervolgens de naam van de groep, en klik op "OK". Er verschijnt een venster: "Kies een andere groep?" Antwoord dienovereenkomstig en blijven selecteren van groepen. Er verschijnt een venster: "Selecteer een locatie om uw groep lijst op te slaan". Navigeer naar de locatie en klik op "Opslaan".
  5. Klik op "Select Output Directory" om te kiezen waar de output mappen zal zijnopgeslagen.
  6. Kies welk type groep analyse uit te voeren - of de MT wegen moeten worden gebundeld per groep of per cel analyse moet worden uitgevoerd. De aanbevolen statistische tests reeds aangeduid. Om alle nummers in de analyse, inclusief de selectie "Verwijder tracks aan het begin / einde van de film". Anders, met dit vakje geselecteerd verwijdert alle MT groei tracks die aan de gang zijn als de film begint of eindigt.
  7. Na de Groep Analyse selectie is gemaakt, selecteert u "Vergelijk groepen".

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van deze software zoals hier beschreven zal meerdere bestanden van de informatie die + TIP dynamiek kwantificeren in levende cellen.

De functie plusTipGetTracks identificeert de tracks (met behulp van bijvoorbeeld de instellingen weergegeven in figuur 1), en dan geeft de parameters met betrekking tot de + TIP tracks. Om de informatie die de software heeft verkregen bekijken, ga in de roi_X directory die is gemaakt in stap 2.2. De "prestatie" map bevat &q...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PlusTipTracker verschaft een eenvoudige grafische user interface voor vrijwel alle zichtbare EB1-GFP kometen snel en automatisch te detecteren in een cel of groeikegel koppelen kometen in sporen en bereken MT parameters. Andere publicaties is het ontwerp van soortgelijke software gerapporteerd (bijvoorbeeld Marx et al. Ook gebruikt kwantitatieve analyse van gemerkte EB1 dynamica in groei kegels 18). Maar lijkt deze software uniek in het gemak van toegang tot, als hij vrij is te downloaden van de webs...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Gaudenz Danuser en leden van zijn lab voor het maken van de plusTipTracker software en voor nuttige discussie over het gebruik van de software, in het bijzonder Maria Bagonis en Sebastien Besson. We danken vooral het Boston College Media Center voor hun hulp en ondersteuning bij het maken en bewerken van de video. We danken ook leden van het Lowery Lab voor nuttige discussies en constructieve kritiek, en Abigail Antoine voor het lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door een NIH R00 MH095768 award aan LAL.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
plusTipTracker softwareDanuser Labhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.htmlDeze software kan in de toekomst op een andere website worden gehost.  Als de vermelde site niet bestaat, zoek dan naar "Danuser Lab Software" in een zoekmachine om de site te vinden.
MATLAB softwareMathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
  2. Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
  3. Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
  4. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
  5. Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232(2012).
  6. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
  7. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
  8. Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413(2012).
  9. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
  10. Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
  11. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  12. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
  13. Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
  14. Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
  15. Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
  16. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
  17. Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22(2013).
  18. Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EB1 GFP trackingtracking van het plus uiteinde van microtubuligeautomatiseerde detectietrackingtime lapse beeldanalysefluorescent eiwitvisualisatiegroepsanalysevergelijkingMATLAB gebaseerde analyse

Gerelateerde artikelen