Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays

Samenvatting

Peptidarrays gesynthetiseerd door de SPOT-methode kunnen worden gebruikt om de substraatspecificiteit van proteïne lysine methyltransferases (PKMTs) te analyseren en om het substraatspectrum van PKMTs te definiëren om hun biologische rol te begrijpen. Dit protocol beschrijft hoe peptidearrays te synthetiseren, ze te methyleren met PKMTs en de resultaten te analyseren.

Samenvatting

Lysine methylering is een nieuwe post-translatie modificatie en is geïdentificeerd verschillende histon en niet histon eiwitten, waar het speelt cruciale rol in celontwikkeling en vele ziekten. Circa 5000 lysine methylatie sites werden geïdentificeerd op verschillende eiwitten, die door enkele tientallen eiwit lysine methyltransferases zijn ingesteld. Dit suggereert dat elke PKMT methyleert meerdere eiwitten echter tot nu toe slechts één of twee substraten geïdentificeerd voor verscheidene van deze enzymen. Om dit probleem aan te pakken, hebben we geïntroduceerd peptide array gebaseerde substraat specificiteit analyses van PKMTs. Peptide arrays zijn krachtige instrumenten om de specificiteit van PKMTs karakteriseren omdat methylatie van diverse ondergronden met verschillende sequenties kunnen worden getest op een array. We gesynthetiseerd peptide arrays op cellulosemembraan met behulp van een Intavis SPOT synthesizer en de specificiteit van de verschillende PKMTs geanalyseerd. Op basis van de resultaten voor een aantal van deze enzymen, nieuwe substrates konden worden geïdentificeerd. Bijvoorbeeld voor NSD1 door gebruik peptide arrays hebben we aangetoond dat het methyleert K44 van H4 plaats van de gerapporteerde H4K20 en bovendien H1.5K168 is het substraat sterk de voorkeur boven de eerder bekende H3K36. Vandaar peptide arrays zijn krachtige tools om biochemisch karakteriseren de PKMTs.

Inleiding

In de laatste twee decennia, verschillende rapporten het belang aangetoond van post-translationele modificaties (PTM) in cellulaire ontwikkeling en verschillende ziekten zoals kanker, maar onlangs eiwit lysine methylatie heeft ontpopt als een ander vitaal PTM. Terwijl aanvankelijk histon lysine methylering bleek een essentiële chromatine merk zijn latere werk toonde ook lysine methylatie van verschillende non-histon-eiwitten ^1-4. De sequentiële overdracht van methylgroepen van S-adenosyl-L-methionine de ε-aminogroep van lysineresten wordt gekatalyseerd door een familie van enzymen genaamd Protein Lysine methyltransferase (PKMTs) dat meer dan 60 eiwitten in....

Protocol

1. Bereiding van Peptide Arrays

1. Programmering van de peptidesequenties
   1. Ontwerp peptidesequenties voor de synthese met de MultiPep Spotter software. Voer het peptide sequenties in enkele letter codes.
      Peptide 1: TARKSTGGKA
   2. Genereer alanine of arginine lopen bibliotheken met een specifieke opdracht (.Plaats, A) om de belangrijke aminozuren die nodig zijn voor de erkenning van een bepaald substraat screenen. Bijvoorbeeld in het volgende voorbeeld de eerste lijn is de wildtype sequentie en van de tweede regel elk aminozuur in een peptide gewijzigd in alanine sequentieel.
      vervangen, A
      TARKSTG
      Een -....

Resultaten

Peptide arrays werden met succes gebruikt om biochemisch karakteriseren de specificiteit van PKMTs, en verschillende nieuwe histon en niet-histon substraten van PKMT werden geïdentificeerd door deze aanpak ^5,16-19. Het definiëren van de juiste substraat spectrum van een PKMT (of een enzym) is een essentiële stap op weg naar begrip van de moleculaire mechanisme en cellulaire functies.

Als voorbeeld van de toepassing van het peptide SPOT matrix methylering methode worden de resultat.......

Discussie

SPOT synthese zoals hier beschreven is een krachtige methode om eiwit-eiwit interactie plaatsen in kaart en onderzoekt de substraatherkenning van peptide modificerende enzymen. Echter, SPOT-synthese nog steeds bepaalde nadelen, want hoewel de peptiden gesynthetiseerd door de SPOT werkwijze worden gerapporteerd aan meer dan 90% zuiverheid ²¹ hebben dit moeilijk te bevestigen telkens. Derhalve resultaten te worden overgenomen door andere werkwijzen bijvoorbeeld gebruik eiwitdomeinen of gezuiverde peptiden gesyn.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ethanol abs Gradient Grade HPLC	Honeywell	10299901	Ontvlambaar
N,N-Dimethylformamide Peptide Synthese	Biosolve	4193302	Ontvlambaar, Toxisch
Piperidine ≥99% voor peptidesynthese	Roth	A122.1	Ontvlambaar, Toxisch, corrosief
Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetaat )	Novabiochem	8510860100
N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC	Fluka	38370	Ontvlambaar, Toxisch, corrosief
Azijnzuuranhydride	Roth	CP28.1	Ontvlambaar, Toxisch, corrosief
Triisopropylsilaan 99%	Aldrich	233781	Ontvlambaar, Toxisch
Dichloormethaan ≥99.9%	Roth	P089.1	Carcinogeen
N-Methyl-2-pyrrolidon	Roth	4306.2	Toxisch
Gederivatiseerde cellulosemembraan	Intavis AG Keulen	32.1
Trifluorazijnzuur	Roth	P088.2	Toxisch, corrosief
Broomfenolblauw	AppliChem	A3640.0010
Ammoniumwaterstofcarbonaat	Roth	T871.2	Toxisch
Natriumdodecylsulfaatpellets	Roth	CN30.3	Toxisch, Ontvlambaar
MultiPep Synthesizer	Intavis AG Keulen	n.v.t.
HyperfilmTM hoge prestatiefilm	GE Healthcare	28906837
Phoretix-software	TotalLab	n.v.t.