Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een Ex vivo Model van een Oligodendrocyte gericht T-Cell Attack in Acute Brain Slices

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52205

⸱

5 februari 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

In dit artikel

Samenvatting

Om mechanismen van demyelinisatie en neuronale apoptose in corticale laesies van inflammatoire demyeliniserende aandoeningen aan te pakken, worden verschillende diermodellen gebruikt. We beschrijven hier een ex vivo benadering door gebruik te maken van oligodendrocyten-specifieke CD8+ T-cellen op herfsneden, wat resulteert in oligodendrogliale en neuronale dood. Potentiële toepassingen en beperkingen van het model worden besproken.

Samenvatting

De dood van oligodendrocyten, vergezeld door vernietiging van neuronen en axonen, zijn typische histopathologische bevindingen in corticale en subcorticale grijze-stoflesies bij inflammatoire demyeliniserende aandoeningen zoals multiple sclerose (MS). Bij deze aandoeningen worden voornamelijk CD8+ T-cellen van veronderstelde specificiteit voor myeline- en oligodendrocyte-gerelateerde antigenen aangetroffen, zodat neuronale apoptose in grijze-stoflesies mogelijk een neveneffect van deze cellen is. Er zijn verschillende soorten diermodellen ontwikkeld om de onderliggende mechanismen van de genoemde pathofysiologische processen te bestuderen. Echter, hoewel ze sommige aspecten van MS nabootsen, is het onmogelijk om het exacte mechanisme en de tijdsafhankelijkheid van ‘’collaterale’’ neuronale celdood te onderscheiden. Om dit te aanpakken, laten we hier een protocol zien om de mechanismen en tijdsreactie van neuronale schade na een oligodendrocyte-gerichte CD8+ T-cel aanval te bestuderen. Om alleen de myeline-omhulling en de oligodendrocyten te targeten, worden in vitro geactiveerde oligodendrocyte-specifieke CD8+ T-cellen overgebracht naar acuut geïsoleerde hersenslices. Na een gedefinieerde incubatieperiode kan myeline- en neuronale schade worden geanalyseerd in verschillende regio's van belang. Potentiële toepassingen en beperkingen van dit model zullen worden besproken.

Inleiding

De dood van oligodendrocyten en vernietiging van de myelineschede, vergezeld van verlies van neuronen en axonen, zijn typische pathologische bevindingen in grijze-stof-laesies bij personen die lijden aan multiple sclerose (MS)1,2. Corticale laesies kunnen tot nu toe worden onderverdeeld in drie verschillende subtypen2: subpiale, intracorticale en leukocorticale laesies. In vergelijking met witte-stof-plaques worden infiltraten gekenmerkt door een overheersing van CD8+ T-cellen, wat wijst op hun mogelijke doorslaggevende rol bij ontstekingen in de grijze stof3. Verder kunnen oligoclonale expansies in bloed, cerebrospinale vloeistof (CSF) en binnen ontstekingslaesies worden gevonden voor CD8+ T-cellen zelf4-6.

In overeenstemming hiermee wordt aangenomen dat CD8+ T-cellen specifiek kunnen zijn voor verschillende myeline-eiwitten7,8. Inderdaad worden CD8+ T-cellen gevonden in de buurt van oligodendrocyten en myelinescheden9,10 die MHC I-expressie vertonen11 en daarom verantwoordelijk kunnen zijn voor het verlies van de myelineschede. Dit proces wordt vaak gezien samen met uitgebreide ‘‘collaterale’’ neuronale en axonale schade in de grijze stof van het centrale zenuwstelsel (CZS)1,2. In feite wordt directe en indirecte dood van oligodendrocyten en neuronen geïnduceerd door CD8+ T-cellen via twee verschillende mechanismen: (i) zwelling en ruptuur van de celmembraan als gevolg van de vorming van cytotoxische granulen na de afgifte van perforines en granzymen en (ii) binding aan de Fas-receptoren of blootstelling van FasL op hun oppervlak8,12,13.

Er zijn verschillende typen diermodellen ontwikkeld om de onderliggende mechanismen van de genoemde processen te bestuderen. In dit opzicht kunnen geprimede CD8+ T-cellen die specifiek zijn voor autoantigenen met geïnduceerde expressie in CZS-gliacellen, zoals oligodendrocyten of astrocyten, adoptief worden overgedragen om vervolgens ‘‘collaterale’’ neuronale en axonale dood in de grijze stof te analyseren14,15. Het uitvoeren van dergelijke in vivo experimenten is een grote hulp om sommige pathofysiologische aspecten van MS na te bootsen, maar deze aanpak is niet geschikt om de onderliggende mechanismen en de kinetiek van axonale schade en neuronale apoptose op te lossen.

Om deze beperkingen te overwinnen, werd een ex vivo aanpak ontwikkeld om de mechanismen en de tijdsverloop van neuronale celdood na een door CD8+ T-cellen veroorzaakte aanval op oligodendrocyten te bestuderen. Omdat alleen oligodendrocyten en dus de productie van myelinescheden door immuuncellen zouden moeten worden aangevallen, worden MHC-klasse-I-beperkte, ovalbumine (OVA)-reactieve OT-I T-cellen gebruikt16. Deze cellen worden vervolgens overgebracht naar herfsneden verkregen van muizen die selectief OVA tot expressie brengen in oligodendrocyten (ODC-OVA muizen)17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met muizen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de respectieve institutionele dier zorg en gebruik commissie.

1. Algemene opmerkingen voor Muis Experimenten

  1. Houd de muizen onder-pathogeen-vrije omstandigheden en hen in staat de toegang tot voedsel en water ad libitum.
    OPMERKING: Het is belangrijk om voor leeftijd en geslacht gematchte muizen in de experimentele groepen gebruiken omdat immunologische patronen kunnen variëren met leeftijd en geslacht.

2. Bereiding en activering van OVA-specifieke CD8 + T-cellen (OT-I)

  1. Voer stimulering van OT-I T-cellen zoals hierna 5 dagen eerder beschreven bereiding hersencoupes.
    OPMERKING: 5 x 10 5 geactiveerde effector CD8 + OT-I-T-cellen (CD8 + T-cellen van transgene muizen herkennen alleen OVA 257-264 peptide in de context van MHC-I-moleculen) nodig per segment De concentratie 5 x 10 5 gekozen experimentally een optimale men een goede cel-cel interacties bevorderen nadat de cellen beginnen te migreren in het segment en, tegelijkertijd, de hoeveelheid cellen niet te hoog om een overreactie waardoor cel tellen 8,18 induceren.
  2. Bereid het medium voor kweken OT-I T-cellen. Supplement 500 ml DMEM met 5% foetaal kalfsserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 50 pM 2-mercaptoethanol, 1% niet-essentiële aminozuren en 25 ug / ml gentamicine. Bewaar het bij 4 ° C tot gebruik.
  3. Verwijder de milt van OT-I transgene muizen als per referentie 16. Zet ze in de voorbereide medium.
  4. Genereer enkele celsuspensie door stampen milten door een 70 urn zeef en centrifugeer suspensie bij 300 xg gedurende 5 min, 4 ° C.
  5. Incubeer celsuspensie met 5 ml ammonium- chloride-kalium (ACK) buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) gedurende 5 minuten om rode bloedcellen te lyseren.
  6. Stoppen incubatiop 10 ml medium en centrifugeer opnieuw zoals hierboven beschreven.
  7. Verdunde celsuspensie in middelgrote en bereken nummers. Plate cellen bij een dichtheid van 3 x 10 7 cellen / putje in een 12-well plaat en prime ze door incubatie met OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) en interleukine 2 (IL-2) (500 IE / ml) 5 dagen.
  8. Na 4 dagen, voeg IL-2 in een concentratie van 500 IE weer / ml.
  9. Na stimulatie, zuiveren OT-I T-cellen uit celsuspensie door een negatieve selectie gebaseerd muis CD8 + T-cell isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Zuivering is gebaseerd op de uitputting van alle niet-CD8 + cellen met een cocktail van antistoffen tegen CD4, CD 11 b, CD 11 c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC klasse II, Ter-119 en TCRγ / δ die vervolgens verwijderd met behulp van magnetische kolommen voor de elutie van het gezuiverde CD8 + T-cellen.
    OPMERKING: Kritische stappen in deze proceduopnieuw worden aangegeven door de fabrikanten: het is belangrijk dat de reactie omvat slechts enkele cellen vanwege de aanwezigheid van klonten de kolom tijdens de elutiestap kunnen blokkeren; het tellen van de cellen voor het toevoegen van de Byotin cocktail is belangrijk voor de mate van zuiverheid van het monster en de procedure moet worden uitgevoerd op ijs onspecifieke bindingen antilichaam minimaliseren.

3. Voorbereiding van de Acute Brain Slices en co-cultuur met OT-I T-cellen

  1. Voor de bereiding van acute hersenschijfjes 19 bereiden placedine ijskoude fysiologische zoutoplossing met 200 mM sucrose, 20 mM PIPES, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH 2PO 4, 10 mM MgSO4, 0,5 CaCl2 en 10 mM dextrose en kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2PO 4, 24 mM NaHCO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM dextrose. Stel de pH van elke oplossing om 7.35 door using NaOH. Voor het instellen van de pH van ACSF dient oplossing borrelen met een mengsel van 95% O2 en 5% CO2.
  2. Pre-koelen oplossingen.
  3. Verdoven 8-10 weken oude muizen (bijvoorbeeld C57BL / 6 als controle of transgene ODC-OVA muizen 17 met inhalatie met 5,0% isofluraan, 5,0% halothaan of Injecteer 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine via ip Wait anesthesie en gebruik een teen knijpen om het niveau van anesthesie beoordelen en onthoofden ze tegelijk. Euthanaseren de muizen per institutionele Animal Care en gebruik commissie criteria voor euthanasie.
  4. Zet de muis in het ventrale positie. Desinfecteren en sagittally snijden hoofdhuid. Open het schedelbot saggitaal, snel te verwijderen van de hersenen met behulp van een schep en plaats deze op het bord van een vibratome door het gebruik van lijm.
  5. Vul het bord met de voorbereide placedine ijskoude fysiologische zoutoplossing.
  6. Snijd 300 micrometer coronale plakjes met de vibratome.
    OPMERKING: Deze procedure is wetenn om levensvatbare intact weefsel exemplaren die geschikt is voor functionele cellulaire studies binnen een tijdsinterval van ten minste 8 uur 19-21 opleveren. Immers, na deze periode, al beginnen na 6 uur, het preparaat blijkt verminderde kwaliteit, namelijk de ontwikkeling van het basis- en functionele eigenschappen zoals actiepotentiaal generatie en voortplanting.
  7. Na het snijden, overdragen één schijfje meteen in elk putje van een 12-wells plaat gevuld met ACSF.
  8. Voeg zorgvuldig 5 x 10 5 OT-I T-cellen per schijfje.
  9. Incubeer plakjes tot 8 uur in een incubator (37 ° C, 5% CO2).
  10. Na de incubatieperiode, oogst plakjes en insluiten ze met behulp van oktober samengestelde weefsel-tek en vries ze in vloeibare stikstof. Bewaar ze bij -20 ° C voor verdere histologische studies om bijvoorbeeld evalueren neuronale structuur (bijvoorbeeld met behulp van anti-MAPII of anti-synaptophysine antilichamen) of apoptose (bijvoorbeeld met anti-caspase-3-antilichamen en anti-anti NeuNorganen) volgens standaard procedures.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na incubatie van hersencoupes met oligodendrocyten gerichte CD8 + T-cellen, oligodendrocyten en neuronen ondergaan apoptose (figuur 2A en 1C respectievelijk). Histologische tekenen van apoptose (bijvoorbeeld caspase-3, Tunel) worden vroegst waargenomen na 3 uur incubatie. Incubatietijd mag niet langer dan 8 uur zijn om een ​​goede kwaliteit van het preparaat en reproduceerbare resultaten te garanderen. Apoptotische cellen kan worden gevonden over de slice met overwicht in gemyelinise...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende dierlijke modellen zijn beschreven in de afgelopen decennia de pathologische kenmerken van inflammatoire demyeliniserende ziekten als MS pakken. In vivo muis en ratmodellen worden wijd gebruikt om pathofysiologie van de ziekte na te bootsen, namelijk analyse van de gevolgen van demyelinisatie en remyelinisatie processen en vermengde afleveringen van ontstekingen en neurodegeneratie. Toch alleen een ex vivo benadering maakt het mogelijk om de exacte onderliggende mechanismen te ontleden. <...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 naar S.G.M. ME3283/2-1 naar S.G.M.) en door Innovatieve Medische Onderzoek, Münster (I-BI111316, SB en SGM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12-Well plateCorning3513
2-MercaptoethanolGibco31350-010
2-MethylbutaanRoth3927.1
70 µm zeefFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500calciumchloride
CD8+-isolatiekitMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-glucoseMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021warm in 37 °C waterbad voor gebruik
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151foetaal kalfsserum
GentamicineGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500kaliumchloride
KHCO3SigmaP9144kaliumwaterstofcarbonaat
L-GlutamineGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500magnesiumsulfaat
NaClSigma31434natriumchloride
NaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500natriumwaterstoffosfaat
NaHCO3Merck1.06329.0500natriumwaterstofcarbonaat
NaOHMerck1.09137.1000natriumhydroxide
NH4ClSigma213330ammoniumchloride
Niet-essentiële aminozuurGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbumine
PIPESSigmaP6757
SucroseMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

Referenties

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van CD8+ T-cellenVoorbereiding van hersendoorsnedenImmunofluorescentiemicroscopieApoptose van oligodendrocytenNeuronale apoptoseT-cel co-cultuurHistologische analyse
Een Ex vivo Model van een Oligodendrocyte gericht T-Cell Attack in Acute Brain Slices
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.