Permanente Ligatie van de linker anterior Aflopend Kransslagader in Muizen: Een model van Post-myocardinfarct Remodelling en hartfalen

Samenvatting

Hartfalen is de belangrijkste oorzaak van ziekenhuisopname en een belangrijke doodsoorzaak. Een model van permanente ligatie van de linker voorste afdalende kransslagader bij muizen wordt toegepast om ventriculaire remodellering en cardiale disfunctie na een myocardinfarct te onderzoeken. De techniek van invasieve hemodynamische metingen bij muizen wordt gepresenteerd.

Samenvatting

Hartfalen is een syndroom waarbij het hart faalt om bloed te pompen met een snelheid evenredig met mobiele zuurstofbehoefte in rust of tijdens stress. Het wordt gekenmerkt door het vasthouden van vocht, kortademigheid en vermoeidheid, met name bij inspanning. Hartfalen is een groeiend probleem voor de volksgezondheid, de belangrijkste oorzaak van ziekenhuisopname, en een belangrijke oorzaak van sterfte. Ischemische hartziekten is de belangrijkste oorzaak van hartfalen.

Kamerdilatatie verwijst naar veranderingen in structuur, grootte en vorm van de linker ventrikel. Deze architecturale hermodellering van de linker ventrikel wordt geïnduceerd door verwonding (bijvoorbeeld myocardinfarct) door drukoverbelasting (bijvoorbeeld systemische arteriële hypertensie en aortastenose), of volume overbelasting. Sinds ventriculaire remodeling beïnvloedt muur stress, het heeft een grote invloed op de hartfunctie en op de ontwikkeling van hartfalen. Een model van permanente ligatie van de linker anterior descending kransslagader bij muizen wordt gebruikt om de ventriculaire remodeling en hartfunctie post-myocardinfarct onderzoeken. Dit model is fundamenteel anders dan in termen van doelstellingen en pathofysiologische relevantie ten opzichte van het model van voorbijgaande ligatie van de linker voorste dalende kransslagader. In dit laatste model van ischemie / reperfusie schade, de aanvankelijke omvang van het infarct worden gemoduleerd door factoren die myocardiale salvage na reperfusie beïnvloeden. Daarentegen wordt het infarct gebied op 24 uur na permanente ligatie van de linker voorste dalende kransslagader vast. Hartfunctie bij dit model zal worden beïnvloed door 1) het proces van uitbreiding van het infarct, infarct genezing en littekenvorming; en 2) de gelijktijdige ontwikkeling van de linker ventrikel dilatatie, hypertrofie van het hart, en ventriculaire remodeling.

Naast het model van permanente ligatie van de linker voorste dalende kransslagader, de techniek van invasieve hemodynamische meaopnieuw metingen bij muizen wordt in detail gepresenteerd.

Inleiding

Hartfalen is een syndroom waarbij het hart niet in staat is om bloed te pompen in een tempo dat overeenkomt met de cellulaire zuurstofbehoefte in rust of tijdens stress. Het wordt gekenmerkt door vochtretentie, kortademigheid en vermoeidheid, met name bij inspanning. Hartfalen is een groeiend probleem voor de volksgezondheid, de belangrijkste oorzaak van ziekenhuisopnames en een belangrijke doodsoorzaak. Ischemische hartziekte is de belangrijkste oorzaak van hartfalen¹.

Ventriculaire remodellering verwijst naar veranderingen in structuur, grootte en vorm van de linker ventrikel. Met andere woorden, ventriculair remodelleren betreft een verandering van de linker ventrikel architectuur. Deze architectonische hermodellering van de linker ventrikel wordt veroorzaakt door letsel (bijv. myocardinfarct), door drukbewaking (bijv. systemische arteriële hypertensie of aortastenose) of door volumebelasting (bijv. mitralis-insufficiëntie). Aangezien ventriculair remodelleren de wandspanning beïnvloedt, heeft het een diepgaande impact op de hartfunctie en op de ontwikkeling van hartfalen.

Verlies van myocardweefsel na een acuut myocardinfarct resulteert in een verminderde systolische ejectie en een verhoogde linker ventrikel eind-diastolische volume en druk. Het Frank-Starling mechanisme, wat inhoudt dat een verhoogd eind-diastolisch volume resulteert in een verhoogde druk die tijdens de systolische fase wordt ontwikkeld, kan helpen om de cardiale output te herstellen. De bijkomende verhoogde wandspanning kan echter regionale hypertrofie in het niet-infarcteerde segment veroorzaken, terwijl in het infarcteerde gebied expansie en verdunning kunnen optreden. Experimentele dierstudies tonen aan dat het infarcteerde ventrikel hypertrofieert en dat de mate van hypertrofie afhankelijk is van de grootte van het infarct².

Het verlies van myocardweefsel na een acuut myocardinfarct resulteert in een plotselinge toename van de belastingsomstandigheden. Post-infarct remodellering vindt plaats in een omgeving van volumebelasting, omdat het uitgerekt en verdunde infarcteerde weefsel het linker ventrikel volume verhoogt. Een verhoogd ventrikelvolume impliceert niet alleen verhoogde preload (passieve ventrikelwandspanning aan het einde van de diastole) maar ook verhoogde afterload (totale myocardwandspanning tijdens systolische ejectie). Afterload is verhoogd omdat de systolische straal is vergroot. Daarom wordt ventrikelremodellering na een myocardinfarct gekenmerkt door gemengde kenmerken van volumebelasting en drukbewaking.

Het myocard bestaat uit 3 geïntegreerde componenten: cardiomyocyten, extracellulaire matrix en de capillaire microcirculatie. Alle 3 componenten zijn betrokken bij het hermodelleringsproces. Matrix-metalloproteïnasen geproduceerd door ontstekingscellen veroorzaken afbraak van intermyocytaire collageen steunen en cardiomyocyte glijdering. Dit leidt tot infarctexpansie gekenmerkt door de onevenredige verdunning en dilatatie van het infarctsegment³. In latere stadia van hermodellering wordt interstitiële fibrose geïnduceerd, wat een negatief effect heeft op de diastolische eigenschappen van het hart.

Het vasculaire en cardiomyocyte compartiment in het myocard moet in het proces van ventrikelremodellering in balans blijven om weefselhypoxie te voorkomen^4,5. Of hypertrofie progresseert tot hartfalen of niet, kan kritisch afhankelijk zijn van dit evenwicht tussen het vasculaire en cardiomyocyte compartiment in het myocard.

Een model van permanente ligatie van de linker voorste dalende kransslagader bij muizen wordt gebruikt om ventrikelremodellering en cardiale functie na een myocardinfarct te onderzoeken. Dit model is fundamenteel anders in termen van doelstellingen en pathofysiologische relevantie in vergelijking met het model van tijdelijke ligatie van de linker voorste dalende kransslagader. In dit laatste model van ischemie/reperfusie letsel, kan de initiële omvang van het infarct worden gemoduleerd door factoren die de myocardiale salvage na reperfusie beïnvloeden⁶. In tegenstelling daarmee is het infarctgebied 24 uur na permanente ligatie van de linker voorste dalende kransslagader vastgesteld. De cardiale functie in dit model zal worden beïnvloed door 1) het proces van infarctexpansie, infarct genezing en littekenvorming; en 2) de gelijktijdige ontwikkeling van linker ventrikel dilatatie, cardiale hypertrofie en ventrikelremodellering.

Protocol

NB: Alle in dit hoofdstuk beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en Onderzoek Raadgevend Comité van de Katholieke Universiteit Leuven (Project: 154/2013-B De Geest).

1. Permanente Ligatie van de Left Anterior Descending coronaire

1. Verdoven de muis door intraperitoneale toediening van 40 mg / kg tot 70 mg / kg natriumpentobarbital. Zorg ervoor dat de muis zijn juiste vlak van anesthesie bereikt wanneer het niet meer reageert een stevige teen knijpen. Controleer altijd de juiste verdoving deze manier voorafgaand aan elke chirurgische ingreep of interventie. Gebruik smerende oogzalf droogheid van de cornea te voorkomen tijdens het onder narcose. Zorg preoperatieve analgésie 2-4 uur voor het begin van de procedure (buprenorfine 0,05 mg / kg SQ).
   1. Gelden consistente aseptische technieken tijdens overleven chirurgie. Uitvoering van procedures die remmen om een ​​maximaal mogelijke omvang microbiële concontaminatie zodat significante infectie of suppuration niet optreedt. Deze procedures omvatten het gebruik van steriele instrumenten en steriele materialen, desinfectie van het operatiegebied, en verwijdering van bont / haar over de operatiewond en ontsmetting van deze site.
2. Intuberen de muis met een zelf bereide afgestompte 20-gauge naald.
   1. Zet de muis in rugligging met hyperextensie van het hoofd.
      1. Focus het licht op de nek regio. Til de tong met een afgestompte pincet. De ingang van de larynx duidelijk te zien.
      2. Passeer de afgestompte naald door het strottenhoofd in de luchtpijp onder direct zicht. Beoordeel correcte intubatie van de muis op het beademingsapparaat (slagvolume in pl: 3 x lichaamsgewicht (g) + 155; frequentie: 120 slagen per minuut).
   2. Als alternatief verbeteren visualisatie van endotracheale intubatie door eerst zorgvuldig het blootstellen van de luchtpijp.
      1. Maak een 5 mm mid-hals incisie en trekkenspierweefsel net boven de luchtpijp.
      2. Voer de intubatie met een chirurgische stereomicroscoop voor directe visualisatie van de luchtpijp. Til de tong en voer het zelf-bereide afgestompt 20 gauge naald in de luchtpijp. Bevestig correcte intubatie van de muis op het beademingsapparaat (slagvolume in pl: 3 x lichaamsgewicht (g) + 155; frequentie: 120 slagen per minuut).
3. Houd de muis in rugligging en zet de muis met tape. Voeren een operatie aan een verwarming pad om onderkoeling te voorkomen.
   1. Scheren en desinfecteren van de huid met Betadine. Zorg ervoor dat de linker achterpoot kruist de juiste achterste ledematen om een ​​beter zicht op de linker ventrikel te verkrijgen tijdens de operatie.
4. Maak een kleine dwarse cutane incisie tot aan het borstbeen en het scheiden van de onderliggende huid en spieren.
5. Trek de m opzij. pectoralis minor en de m. pectoralis major met een 5-0 zijden hechtdraad.
6. Maak een incision in de derde intercostale ruimte door het invoegen van een afgestompte pincet.
7. Beweeg de pincet onder de intercostale spieren van lateraal naar mediaal tot het borstbeen is bereikt. Punctie het thoraxwand door op de pincet vanuit de huid. Voltooi de thoracotomie door het zorgvuldig snijden van de intercostale spieren net boven de pincet met een kleine schaar. Met deze techniek om puncturing van de longen voorkomen.
8. Zet een spons ondergedompeld in 0,9% NaCl in de holte naar de longen beschermen. Introduceer een wond spreider (borst oprolmechanisme) in de intercostale ruimte om de blootstelling van de linkerkant van het hart te verkrijgen. Vanaf nu, het linker atrium, de linker ventrikel en de linker voorste dalende kransslagader zijn zichtbaar onder de stereomicroscoop.
9. Voer een ligatie van de linker voorste dalende kransslagader met een 6-0 Prolene ligatuur ongeveer 1 mm onder de punt van de linker atrium. Dit is distaal van de eerste diagonale tak.
   OPMERKING: U kunt ook met 7-0 (0.05 Mm diameter) of 8-0 draden (0.04 mm diameter) worden gebruikt. De naald is een C-1 13 mm 3/8 cirkel taper Point naald. Succesvolle ligatie van de linker voorste dalende kransslagader induceert onmiddellijke verkleuring, waardoor een bleke verschijnen myocardium in het getroffen gebied.
10. Verwijder de wond strooier (borst oprolmechanisme).
    1. Plaats drie 6-0 Ti-Cron hechtingen rond de intercostale ruimte. Voor het aandraaien van de hechtingen, verwijder de spons uit de borstholte en opnieuw uitbreiden van de longen door het blokkeren van de uitstroom van de ventilator. Door dit te doen, de longen opnieuw te verbinden met de pariëtale pleura.
    2. Vervolgens trek de hechtingen strak en herhaal re-expansie door te drukken op de borst. Bevestig de succesvolle afsluiting van de thorax met een kleine hoeveelheid zoutoplossing (geen luchtbellen worden gezien wanneer het uitoefenen van druk op de borst).
    3. Kijk door de intercostale spieren om de normale groei van de longen te bevestigen. Herpositioneren beide pectoralis spieren, die als eenextra barrière voor de preventie van een pneumothorax.
11. Sluit de huid met 5-0 zijde-hechtingen.
12. Koppel de muis van de ventilator en laat herstel op de verwarming pad. Heeft een dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging behouden. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
13. Consequent postoperatieve analgesie (buprenorfine 0,05 mg / kg SQ BID gedurende minstens 48 uur na de operatie).

2. In vivo invasieve hemodynamische metingen in Muizen

1. Voor de procedure onderdompelen 1,0 Franse Millar drukkatheter in steriel water bij 37 ° C gedurende ten minste 30 min signaaldrift minimaliseren. Elektronisch kalibreren van de druksensor op 0 mm Hg en 100 mm Hg en registreren van gegevens bij 2000 Hz.
2. Voeren anesthesie door intraperitoneale toediening van 1,4 g / kg urethaan. Controleer datde muis de juiste vlak van anesthesie bereikt wanneer het niet meer reageert een stevige teen knijpen.
3. Plaats de verdoofde muis in rugligging. Veilig zijn ledematen met tape. Handhaven van de lichaamstemperatuur met een verwarmingselement en monitor met een rectale sonde. Scheer de nek regio en maak een middellijn incisie in de nek regio om de schildklier bloot.
4. Bevestig de hals met verbogen naalden.
5. Trek afgezien van de speekselklier en de juiste gemeenschappelijke halsslagader bloot. De nervus vagus, die een witte draad lijkt, ligt langs de slagader. Haal voorzichtig de halsslagader van de nervus vagus via een gebogen pincet.
6. Laat een gebogen pincet onder de rechter halsslagader te scheiden van andere weefsels. Verwijder bindweefsel rond de slagader.
7. Passeer twee 6-0 zijde draden onder de juiste gemeenschappelijke halsslagader. Maak een strakke knot op de bovenste draad, die wordt geplaatst in de richting van het hoofd, in de buurt, en fixeren met een Kocher (distale occlusie ligatie). Passeer de Proximal draad twee keer van links naar rechts en bevestig met 2 kochers (proximale niet-occlusieve draad).
8. Houd de halsslagader vochtig door het droppen van een steriele 0,9% NaCl. Drogen overtollige vloeistof met wattenstaafjes.
9. Een insnijding in de rechter halsslagader met een 26-gauge naald tussen het distale en het proximale ligatie niet-occlusieve draad.
10. Breng de druksensor in de slagader. Controleer of er geen bloedverlies. Duw de 1,0 Franse Millar drukkatheter voren en pas de proximale niet- occlusieve draad zodanig dat de katheter goed kan door het draad onder het sleutelbeen.
    1. Minimaliseren bloedverlies tijdens aanpassing van de proximale niet-occlusieve draad. Laat de druksensor te veel en bevordert tegelijk want het is zeer fragiel niet comprimeren. Sinds de proximale draad de slagader niet mag afsluiten, moet het vat gevuld blijven met bloed.
11. Beginnen met het opnemen van de druk signaal. Een arteriële druk signaal Fluctuates in een gezonde muis tussen een diastolische druk van 60 - 70 mm Hg en een systolische druk van 100-120 mm Hg.
12. Richt de katheter via de anonyma slagader en via de aorta in de linker ventrikel. De ventriculaire druk schommelt tussen 0 mm Hg en 100-120 mm Hg. Laat de katheter te stabiliseren in de linker ventrikel. Noteer het signaal gedurende 30 min tot 60 min, afhankelijk van de experimentele eisen.
13. Na voltooiing van het experiment, genieten de katheter Alconox 1% gedurende 30 min. Was de katheter met Milli-Q water. Bewaar de katheter in een schuim blok.
14. Win gegevens van de opname software voor verdere analyse.
    1. Voor data-analyse, overwegen een tijdsinterval waarin de druk stabiel is. Minstens 10 opeenvolgende hartcycli van de geregistreerde gegevens van belang.
    2. Gebruik LabChart software versie 8.0 of vergelijkbaar met de hartslag, de maximale systolische linker ventrikel druk, de minimale diastolische linker ventr analyserenicular druk, de pieksnelheid van isovolumetrische linker ventriculaire contractie (dP / dt _max), de pieksnelheid van isovolumetrische linker ventriculaire relaxatie (dP / dt _min), het eind-diastolische linker ventriculaire druk, en de tijdconstante van de isovolumetrische linker ventrikel drukval (tau) ^7.
       OPMERKING: De eind-diastolische druk komt overeen met de druk aan de tijd die vlak boven de drukgolf veroorzaakt door isovolumetrische contractie. De berekening van tau is gebaseerd op het aanbrengen van de linker ventriculaire druk in een mono-exponentiële verval kromme, uitgedrukt als P _(t) = P ₀ e ^{-t / tau} + b, In deze formule P _(t) is de linker ventriculaire druk op tijdstip t na de maximale negatieve waarde van dP / dt is bereikt. De parameter B komt overeen met de theoretische asymptoot, die een vereenvoudigde benadering kan worden verondersteld nul. Verbeterde isovolumetrische ontspanning resulteert in een kleinere waarde van tau.

Resultaten

De mate van myocardiaal infarct kan worden beoordeeld door Evans blue / 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) double kleuring. TTC is een redox indicator, die wordt omgezet dieprode 1,3,5-triphenylformazan in levend weefsel door de activiteit van verscheidene dehydrogenases in aanwezigheid van NADH ^8. Figuur 1 toont een representatief deel van het hart 24 uur na ligatie van de linker voorste dalende kransslagader. Blauw-gekleurde vlakken geven niet-ischemische / normale regio's. Het myo...

Discussie

Chronische veranderingen in myocardiale structuur en functie, kan de ontwikkeling van de linker ventriculaire disfunctie, en progressie van hartfalen te onderzoeken in verschillende muizenmodellen ^12. Remodellering en disfunctie kan worden geïnduceerd door myocardinfarct of drukoverbelasting secundaire aorta vernauwing dwarse, of kunnen worden onderzocht in genetische modellen van gedilateerde cardiomyopathie ^12. Uiteraard is het meest uitgesproken voordeel van muismodellen is de beschikbaarheid va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Buprenorfine (Buprenex)	Bedford Laboratories
Natrium Pentobarbital (Nembutal)	Ceva
Betadine	VWR internationals	200065-400
5 - 0 zijden hechtdraad	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	K890H
6 - 0 proleen hechtdraad	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1832
6 - 0 Ti- Cron hechtdraad	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1823
Urethaan	Sigma	94300
Alconox	Alconox Inc.
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Borst retractor of Thorax retractor	Kent Scientific corporation	INS600240	ALM Zelfhoudend, gekarteld, 7 cm lang, 4 x 4 "L" gevormde tanden, 3 mm x 3 mm
1.0 French Millar drukkatheter	Millar Instruments	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart® software	ADInstruments Pty Ltd.
Rectaal sonde	ADInstruments Pty Ltd.