Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Samenvatting

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Samenvatting

De mogelijkheid om biomoleculen in vivo te bestuderen is cruciaal voor het begrijpen van hun functie in een biologische context. Een krachtige aanpak omvat het fuseren van moleculen van belang met fluorescente eiwitten zoals GFP om hun expressie, lokalisatie en functie te bestuderen. GFP en zijn derivaten zijn echter aanzienlijk groter en minder fotostabiel dan organische fluoroforen die over het algemeen worden gebruikt voor in vitro experimenten, en dit kan het onderzoeksgebied beperken.

We hebben onlangs een eenvoudige, veelzijdige en hoog-doorvoer methode geïntroduceerd op basis van elektroporatie, die de internalisatie van biomoleculen gelabeld met organische fluoroforen in levende micro-organismen mogelijk maakt. Hier beschrijven we hoe elektroporatie te gebruiken om gelabelde DNA-fragmenten of eiwitten te internaliseren in Escherichia coli en Saccharomyces cerevisiae, hoe de hoeveelheid geïnternaliseerde moleculen te kwantificeren met behulp van fluorescentiemicroscopie, en hoe de levensvatbaarheid van geëlektroporeerde cellen te kwantificeren. Gegevens kunnen worden verzameld op het niveau van enkele cellen of enkele moleculen met behulp van fluorescentie of FRET. De mogelijkheid om niet-gelabelde moleculen te internaliseren die een fysiologisch waarneembaar antwoord in vivo uitlokken, wordt ook gepresenteerd. Ten slotte worden strategieën voor optimalisatie van het protocol voor specifieke biologische systemen besproken.

Inleiding

De meeste studies fluorescentie binnen levende cellen afhankelijk proteïne fusies met fluorescente proteïnen (FP), zoals GFP ^1. Deze fluorescerende labels laten onderzoeken van het aantal kopieën, diffusie patroon of lokalisatie van eiwitten die betrokken zijn bij processen zoals genexpressie of membraan transport ^2-7. KP's bieden een hoge etikettering specificiteit, eenvoudige implementatie, en zijn verkrijgbaar in een grote voorraad van varianten met verschillende fotofysische en chemische eigenschappen ^1. Echter, organische fluoroforen blijven de eerste keuze voor in vitro experimenten vanwege hun grotere photostability (tot 100 maal stabieler dan KP) ^8,9, klein formaat (tot 100 maal kleiner volume dan FP) en gemak van intramoleculaire labeling (hoofdzakelijk door middel van cysteïneresten). Al deze factoren zijn met name belangrijk voor enkel-molecuul fluorescentie en FRET bestudeert ^10.

Verschillende internalisatie methoden combining de voordelen van biologische etikettering en in vivo detectie geïntroduceerd in het afgelopen decennium; Dergelijke werkwijzen hebben ofwel relatief grote polypeptiden markeringen (bijvoorbeeld TMP, halogeen of 20 kDa SNAP markeringen) ^11-14, vereisen het gebruik van niet-natuurlijke aminozuren ¹⁵ of beperkt tot een enkele, grote membraan eukaryotische cellen (bijv. , schraap laden, spuit laden, micro-injectie) ^16-19.

Dit protocol beschrijft een nieuwe, eenvoudige en high-throughput internalisatie methode die koppels de voordelen van biologische fluoroforen met in vivo observatie. Om deze techniek te ontwikkelen wij elektroporatieprocedure vaak gebruikt om cellen te transformeren met plasmide DNA ^20,21 om micro-organismen, zoals E. laden aangepast coli of S. cerevisiae met organisch label biomoleculen. Het protocol bestaat uit 4 stappen: incubatie van cellen met gelabelde biomoleculen,elektroporatie, cel herstel, en cel wassen om niet-geïnternaliseerde biomoleculen te verwijderen. Hier presenteren we deze elektroporatie protocol, alsook de cell imaging en gegevensanalyse processen celgebaseerde en enkel-molecuul fluorescentie bestuderen en FRET-signalen.

Elektroporatie vertrouwt op het ontladen van een hoog voltage elektrische veld over een lage ionsterkte celsuspensie voorbijgaande membraan poriën waardoor biomoleculen cellen kan komen (figuur 1) ^20,21 vormen. Net als bij transformatie van bacteriën of gist met plasmide-DNA, cellen voorafgaand aan elektroporatie hun electrocompetency waarborgen worden voorbereid. Deze procedure bestaat uit verscheidene wasstappen met water, verhoogt het membraan permeabiliteit en verlaagt de ionische sterkte van de celoplossing boogvorming in de elektroporatie cuvette te voorkomen. In dit protocol kunnen cellen worden bereid zoals hieronder beschreven (zie PROTOCOL: 1,1) of gekocht van commerciële aanbieders.

Figuur 1: Schematische weergave van de internalisatie protocol Van links naar rechts:. Voeg enkele microliters van gelabelde biomoleculen aan het monster van elektrocompetente cellen (dubbel-gemerkte DNA-fragmenten en bacteriën in dit voorbeeld); Incubeer 1 tot 10 minuten op ijs en naar een vooraf gekoelde elektroporatie cuvette; electroporate en voeg dan 0,5-1 ml rijk medium aan de cellen onmiddellijk na; incuberen bij 37 ° C (of de door het organisme temperatuur, bijvoorbeeld 29 ° C voor gist) laten de cellen te herstellen; voeren 5 wassen stappen om het overtollige niet-geïnternaliseerde gelabelde moleculen te verwijderen; resuspendeer de laatste pellet in 100-200 pi PBS-buffer en pipet 10 pi op een agarose pad; bedekken het pad met een gereinigd dekglaasje en beeld op een fluorescentie microscoop (in brede veld modus of HILO-modus).

Elektrocompetente cellen worden geïncubeerd met de gelabelde biomoleculen net voor elektroporatie, dat kan worden uitgevoerd met standaard electroporators in de meeste biochemische laboratoria. Onmiddellijk na elektroporatie worden cellen geïncubeerd in een rijk medium waardoor hun herstel voor het wassen (figuur 1). De overmaat van niet-geïnternaliseerde gelabelde biomoleculen wordt eerst verwijderd door wassen in een buffer die een relatief hoge concentratie van zout en wat afwasmiddel (zie PROTOCOL: 3.3). De aanwezigheid van zout verstoort aspecifieke elektrostatische interacties gevormd door niet-geïnternaliseerde gemerkte biomoleculen die anders kunnen plakken op het buitenmembraan. Ook de aanwezigheid van detergens in de wasbuffer verstoort niet-specifieke hydrofobe interacties.

Terwijl DNA internalisatie is eenvoudig (figuur 2), moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het ​​internaliseren van gelabelde eiwitten met behulp van elektroporatie. Ten eerste, zou de voorraad monster van organisch gemerkt eiwit bevatten nog steeds een klein percentage van de vrije kleurstof. Gratis dye moleculen zijn veel kleiner dan eiwitten en kan daarom bij voorkeur te worden geïnternaliseerd. Om de overgrote meerderheid van de waargenomen geïnternaliseerde fluorescerende moleculen overeen met het eiwit van interesse, moet de initiële eiwitmonster minder dan ~ 2% bevatten vrije kleurstof (Figuur 5) ^22. De overmaat van niet-geïnternaliseerde gelabelde eiwitten kunnen ook vasthouden aan de buitenste celmembraan na elektroporatie; Dit fenomeen eiwit specifiek en moet worden gecontroleerd bij elke nieuwe eiwit. Wij stellen verschillende opties die de verwijdering van niet-geïnternaliseerde eiwitten van de geladen celmonster mogelijk maakt (zie PROTOCOL: 3.3.3).

Tenslotte worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in een klein volume fosfaatbuffer en gepipetteerd op een agarose pad, zodat de weergave op een fluorescentie microscoop. Immobilisatie op agarose pads is een simple en efficiënte manier van beeldvorming van cellen op een dekglaasje zonder nadelige gevolgen voor hun integriteit. Het pad moet een low-fluorescentie kweekmedium bevatten.

Cell imaging kan worden uitgevoerd in groothoek, totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of met behulp van HILO (hoogst geneigde en gelamineerd Optical Blad) microscopie. In de HILO configuratie, de laserstraal dringt dieper in het monster dan in TIRF, maar niet het gehele monster voor groothoek verlichten, waardoor een grotere signaal-ruisverhouding ^23. Afhankelijk van het laservermogen en tijdsresolutie gebruikt, kan geïnternaliseerd biomoleculen worden geteld (met behulp van stapsgewijze fotobleken analyse, figuur 3), gelokaliseerde of bijgehouden ^24-28. Internalisatie van dubbel gemerkte constructen met een FRET paar fluoroforen maakt de kwantificering van FRET zowel eencellige of single-molecule niveaus (Figuur 6).

Verschillende parameters kunnen worden gevarieerdafhankelijk van de gewenste uitvoer en het biologische systeem bestudeerd. Ten eerste kan de hoeveelheid materiaal per cel geïnternaliseerd worden afgestemd door veranderen van de concentratie van gemerkte biomoleculen aan de cellen toegevoegd vóór elektroporatie (figuur 2). Elektroporatie veldsterkte zal ook zowel het laden efficiency en levensvatbaarheid van de cellen te beïnvloeden; zoals verwacht, terwijl de beladingsgraad toeneemt met toenemende veldsterkte, de levensvatbaarheid van geëlektroporeerde cellen afneemt (figuur 4A). Beide parameters kunnen worden gekwantificeerd door het opnemen van het percentage van geladen en delende cellen na elektroporatie. Dit levensvatbaarheid test in combinatie met fluorescentie beeldvorming controleert ook de waarneming van geïnternaliseerde biomoleculen in levende cellen en laten continue observatie over meerdere generaties (Figuur 4B).

Kortom, dit protocol maakt de internalisering van fluorescent gelabelde DNA en eiwitmoleculen inE. coli of S. Cerevisiae ^26. Individuele moleculen gelabeld met organische fluoforen kan worden gevolgd met een hoge tijdruimtelijk resolutie voor tijdschalen een orde van grootte meer dan KP's. Tenslotte is deze werkwijze geschikt groothoek, TIRF en confocale detectie en gepulste excitatie's, zoals ALEX (afwisselende laser excitatie ^28,29).

Protocol

1. celpreparaat

1. Voorbereiding van-lab gemaakt elektrocompetente bacteriën
   1. Bereid een 5-10 ml 's nachts precultuur van een enkele kolonie van de E.coli-stam van belang in een lage fluorescentie medium zoals M9 of EZ Rich gedefinieerd medium.
   2. In de ochtend, te enten een nieuwe 400 ml cultuur met de overnight precultuur zodanig dat OD _{600 nm} begint om 0.02. Voeg toe aan de 400 ml lage fluorescentie medium 2,5 ml 1 M _MgSO4 en 2,5 ml 1 M _MgCl2.
   3. Kweek bij 37 ° C en 250 rpm tot OD _{600 nm} bereikt 0,4 tot 0,6.
   4. Stop de groei door het koelen van de cultuur in een ijs-waterbad gedurende 10-15 min.
      Opmerking: Van nu af aan, het uitvoeren van alle stappen bij 4 ° C (op ijs).
   5. Centrifugeer de cultuur 15 min bij 1000 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 250 ml gekoelde en steriel gedestilleerd _H2O
   6. Herhaal het centrifugeren en resuspensie stappen tWice, verkleinen van de hoeveelheid water tot 100 ml en 50 ml.
   7. Centrifugeer de cultuur 10 min bij 1000 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 25 ml gekoelde en steriel gedestilleerd _H2O + 10% glycerol.
   8. Herhaal de centrifugatie en resuspensie stappen drie maal, verminderen het volume van 10% glycerol oplossing 10 ml, 5 ml en tenslotte 500 pl.
   9. Aliquot de cellen in aliquots van 20 pi elk kort vriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.
2. Commercieel elektrocompetente bacteriële cellen
   1. Verdun een commerciële cel monster 1: 1 met steriel gekoeld gedestilleerd water. Maak 20 ul porties en bewaar bij -80 ° C.
3. Het voorbereiden electrocompetente gist
   Opmerking: Elektrocompetente S. cerevisiae cellen bereid voor elke elektroporatie experiment en niet bij -80 ° C worden opgeslagen als E. coli.
   1. Om te beginnen, te enten 50 ml YPD medium met een enkele kolonie van de gewenste stam van belang.
   2. Incubeer bij 30 ° C en 250 rpm tot de _{OD600 nm} bereikt 0,6 tot 0,8.
   3. Centrifugeer cellen bij 1000 g gedurende 5 min bij 4 ° C.
   4. Resuspendeer de pellet in 25 ml gekoelde en steriel gedestilleerd _H2O
   5. Herhaal de wasstappen resuspenderen tweemaal in 25 ml water en tweemaal opnieuw suspenderen in 2 ml van een gekoelde oplossing van sorbitol 1 M.
   6. Resuspendeer de cellen in 250 ul van 1 M sorbitol en splitsing van de cellen in 50 ul aliquots.

2. Agarose pad voorbereiding

1. Achtergrondkleuren fluorescerende deeltjes te verwijderen, branden een dekglaasje in een oven bij 500 ° C gedurende 1 uur. "Schoon gebrand" dekglaasjes worden bewaard weken bij kamertemperatuur bedekt met aluminiumfolie.
   Opmerking: Andere gebruikelijke reinigingsmethoden zoals plasma reiniging of Piranha-oplossing kan net zo lang worden gebruikt als achtergrondfluorescentie van de gereinigde dia blijft quasi-nul.
2. Bereid een lage fluorescentie agarose oplossing door smelten in een magnetron een 2% agarose - gedestilleerd water oplossing (70 ° C). Voeg onmiddellijk 500 ul van de duidelijke 2% agarose-oplossing tot 500 ul van 2X lage fluorescentie kweekmedium en meng voorzichtig.
3. Voordat het afkoelt en verharden, prompt pipet dit agarose - medium oplossing op een microscoop dekglaasje (Geen 1.5 dikte) met het oog op een pad van ongeveer 2 cm diameter en een paar millimeter in hoogte te vormen. Vermijd bubbels en pop ze met een pipet tips als dat nodig is.
4. Vlak de pad met een tweede "verbrand" dekglaasje (Nee 1.5 dikte, zie figuur 1).
   Opmerking: Deze bovenste dekglaasje helpt vormen een vlakke homogene pad en beschermen tegen stof en drogen terwijl cellen zijn in voorbereiding. Minimaal medium zoals M9 of rijk medium zoals EZ Rich gedefinieerd medium zijn getest voor hun lage fluorescentie.

3. Electroporation

1. Incubatie
   1. Voeg tot 5 gl gelabelde moleculen opgeslagen in een lage zoutbuffer (<50 mM zout) en één monster van competente cellen (20 gl bacteriën of 50 pl gist) en incubeer 10 min op ijs.
      Opmerking: De concentratie van fluorescerend gelabelde moleculen in de voorraadoplossingen en dus de hoeveelheid gemerkte moleculen aan de cel toegevoegd vóór elektroporatie is direct gecorreleerd met beladingsgraad (fig 3 en discussie). Aangezien sommige eiwitten minder geschikt zoutarm stand kan de zoutconcentratie in de opslagbuffer worden verhoogd maar de hoeveelheid gemerkte moleculen aan de cellen toegevoegd voorafgaand elektroporatie moet dan worden verlaagd.
   2. Breng het mengsel van cellen en gemerkte biomoleculen in een vooraf gekoelde elektroporatie cuvette (0,1 en 0,2 cm tussenruimte voor bacteriën en gist, respectievelijk). Tik voorzichtig de cuvette op de bank om eventuele luchtbellen uit de oplossing te verwijderen.
   3. Plaats de cuvette in de electroporator en een hoog-voltage elektrische puls van toepassing zijn op de oplossing (0,9-1,8 kV / cm, zie Overleg voor meer informatie over het kiezen van de spanning). Een dergelijke puls vormt tijdelijke poriën in celmembranen waardoor gemerkte biomoleculen te diffunderen in de cellen.
   4. Controleer dat de tijdconstante op het electroporator tussen 4-6 ms. Lagere tijdconstanten vaak door te hoge zoutconcentratie en / of de aanwezigheid van belletjes in de cuvette, en leiden tot zeer lage of geen belasting van de cellen.
2. Herstel
   1. Onmiddellijk na elektroporatie, voeg 500 pl rijk medium zoals SOC, EZ Rich gedefinieerd medium, YPD of rijk medium aan de cellen.
   2. Incubeer het monster bij 37 ° C voor bacteriën en 29 ° C voor gist gedurende 2 tot 10 minuten. Voor de levensvatbaarheid, waar de gebruiker wil het percentage cellen groeien en delen na elektroporatie evalueren, gebruik dan een langere hersteltijd (maximaal 1 uur) als we observeren dergelijke vertraging keer voor de eerste celdeling.
3. Wassen stappen
   1. Was de cellen aan een niet-geïnternaliseerde biomoleculen te verwijderen door te stoppen met draaien de cellen gedurende 1 minuut bij 3300 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 pi PBS.
      Opmerking: Voor elk monster, een negatieve controle cellen geïncubeerd met dezelfde hoeveelheid gemerkte biomoleculen maar niet geëlektroporeerd en gewassen op dezelfde manier als de hoofdmonster.
   2. Herhaal de voorgaande stappen 3 keer.
   3. Bij eiwit internalisatie, optimaliseren het wassen, afhankelijk van de eigenschappen en het gedrag van het gemerkte eiwit van interesse. De volgende stappen zijn voorbeeld van mogelijke optimalisaties:
      1. Voer de eerste 3 wasbeurten met PBS dat 100 mM NaCl en 0,005% Triton X100 op niet geïnternaliseerde eiwitten die kunnen kleven aan het buitenste celmembraan ^{22 verwijderen,} 26.
         1. Filter de geëlektroporeerde cellen met een 0,22 urn poriegrootte filter in een 1,5 ml microcentrifugebuis geplaatst door pipetteren de geëlektroporeerde cellen in de filter. Spin gedurende 3 min bij 800 xg en 4 ° C. Gooi de doorstroom. Voeg 500 ul nieuwe PBS over de cellen en draaien ze weer als voorheen en herhaal deze stappen eenmaal ^22.
      2. Voeg een kleine hoeveelheid protease K (10 ng in 500 pl PBS) gedurende de eerste wascyclus om de destructie van eventueel niet geïnternaliseerde proteïne mogelijk.
   4. Spin down van de cellen gedurende 1 minuut bij 3300 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 150 pl PBS.
   5. Verdeel het geladen celoplossing op agarose pad door het verwijderen van de bovenste dekglaasje en verspreiding 10 ul van de celsuspensie druppel door druppel. Vervang een ongebruikte schoon verbrande dekglaasje (Geen 1.5 dikte, passend bij de microscoop objectief specificatie) op thij de top van de pad en druk heel zachtjes op de dia.
   6. Bescherm de geëlektroporeerde cellen van licht door de opslag van de pads in een ondoorzichtige doos terwijl beeldvorming verschillende monsters.

4. Microscoop data-acquisitie

Opmerking: Single-cell en enkel-molecuul fluorescentie microscopie in levende micro-organismen kan worden uitgevoerd op elke geschikte fluorescentie microscoop (custom-built of commercieel).

1. Instellingen
   1. Groothoek of HILO verlichting
      1. Afbeelding monsters met eventuele TIRF / single-molecule microscoop.
         Opmerking: Als voorbeeld gebruiken we in het laboratorium een ​​aangepaste omgekeerde microscoop met een TIRF set-up. Balken van een 532 nm en 637 nm diodelaser en gecollimeerd alvorens zich op de achterkant brandvlak van het objectief. Fluorescentie van het monster wordt verzameld via hetzelfde doel, gescheiden van de excitatie licht met behulp van een lange pas en een notch filter, en opgesplitst in red en groene kanalen met behulp van een dichroïsche spiegel. De twee kanalen worden afgebeeld op aparte helften van de chip van een elektron vermenigvuldiging ladingsgekoppelde inrichting (EM-CCD) camera. Video's worden opgenomen met de kinetische modus. Wit licht beelden worden verkregen met een witte lamp en een condensator aan de microscoop als verlichtingsbron.
      2. Voor algemene single-molecule observatie, stelt u de belichting modus van de microscoop om TIRF of HILO ²³ (zie Overleg voor meer details over TIRF versus HILO imaging). Een HILO modus op TIRF microscoop ingesteld, enigszins afnemen de invalshoek van het excitatielicht naar het brandpunt iets boven het dekglaasje oppervlak (beeld naar de mobiele inrichting in plaats van het onderste membraan in contact met het dekglaasje zie 4.5.4 ).
      3. Voor cell-level analyse, lange single-molecule volgen experimenten of stapsgewijze photobleaching analyse, stelt u de belichting modus van de microscoop om een ​​groothoek modus ensuring de voortdurende aandacht van de gehele cel hoeveelheden hetgeen van geïnternaliseerde gelabelde moleculen.
   2. Typisch gebruik excitatievermogens ongeveer 0,5-3 mW (~ 50-400 W / ^cm2).
      Opmerking: Lagere laservermogens zijn nuttig om langlevende fluorescentie observatie en tracking (langer dan 1 minuut), terwijl hogere laservermogens nodig kan zijn voor een hogere tijdruimtelijk resolutie of stapsgewijze fotobleking analyse te bereiken.
   3. Gebruik belichtingstijden variërend van 15 ms voor het bijhouden van experimenten tot 100 ms voor meer algemene observatie en intensiteit kwantificering. Opmerking: andere frame rates en modi kunnen worden gebruikt, zoals stroboscopische verlichting, in het bijzonder voor het bestuderen snel diffunderende soort ^30.
   4. In de TIRF microscoop, registreren de fluorescentie kanaal op een elektron vermenigvuldiging CCD (EMCCD) camera bij een vergroting resulteert in een pixel lengte van ~ 100 nm / pixel. De TIRF setup is te beschrijven in meer detail in verwijzing ^26.
2. Data-acquisitie
   1. Schakel of blokkeren laser belichting tot de start van het experiment. Schakel de EMCCD camera winst af om schade aan de camera te voorkomen als gevolg van overbelichting.
   2. Plaats de agarose pad sandwich ondersteboven op de microscoop podium, met het cel bedekte zijde naar beneden, zodat de cel het doel te brengen. Stel de focus op de cellen in doorgelaten licht microscopie-modus ^28. Neem een ​​beeld van elke cel van mening onder wit licht beeldvorming om de cel lokaliseren schetst voor het uitschakelen van het witte licht.
   3. Bescherm het monster van het laboratorium omgevingslicht.
   4. Voor HILO excitatie modus, om de hoek van de excitatiebundel op elke maximum signaal-ruisverhouding door verlichten alleen het gedeelte van het monster nabij het dekglaasje oppervlak.
      1. Naar Hilo verlichting te bereiken, richten de laserstraal in de achterkant brandvlak van een 100x NA 1.4 objectief ²⁸ (hogere Numetrische openingen zoals de 1.45 of 1.49 zijn ook geschikt). Door het verschuiven van de focusseerlens loodrecht op de bundel, de focus verschuift van het doel midden, zodat de bundel verlaat het doel met een hoek.
      2. Pas de lenspositie om de signaal-ruisverhouding, intracellulaire fluorescentie intensiteit versus extracellulair achtergrondsignaal maximaliseren.
   5. Schakel de camera te krijgen en start data-acquisitie voor het inschakelen van de laser.
   6. Tijdens het opnemen van gegevens, het verwerven van een wit-licht beeld van elke FOV voor of na het opnemen van de fluorescentie gegevens; dit helpt om celgrenzen in de fluorescentie kanalen identificeren.
   7. Voor levensvatbaarheid schatting
      1. Gebruik een lage fluorescentie rijk medium in de agarose pad om cellen te groeien na elektroporatie.
      2. Equilibreer de microscoop op de optimale temperatuur voor de onderzochte micro-organisme (37 ° C voor E. coli, 29 ° C voor S. cerevisiae) Met een objectief verwarmingssysteem.
      3. Record zowel wit licht en fluorescentie beelden elke 30 minuten, zorg ervoor dat op precies hetzelfde gezichtsveld te blijven gedurende de gehele gegevensregistratie. Een vertraging van ≈1 uur wordt meestal waargenomen voordat cellen beginnen te verdelen.
   8. Tellen van het aantal geïnternaliseerde biomoleculen per cel
      1. Stel het laservermogen te hoge waarden (2-3 mW) en lange belichtingstijd (100 ms).
      2. Stel de belichting in de stand groothoek om de volledige cel te verlichten.
      3. Neem films zoals beschreven in stap 4.2 en zorg ervoor dat na de voltooiing van de fluorescentie photobleaching extra frames (50-100 frames) op te nemen.

5. Data-analyse

1. Algemene analyse
   1. Analyseer de opgenomen beelden en films, zowel in wit licht en fluorescentie excitaties, met behulp van een imaging software, zoals de gratis software ImageJ.
      1. In ImageJ, opent u de foto's of films die op de microscoop (TIF-formaat) in Bestand> Openen> Uw locatie te zoeken.
      2. Om fluorescentie-intensiteiten kwalitatief te vergelijken op een computerscherm, zorg ervoor dat alle fluorescentie beelden worden weergegeven met dezelfde helderheid en contrast instellingen in Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast. Pas handmatig of automatisch de instellingen voor een geselecteerde afbeelding, druk op de "Set" knop en selecteer de "doorgeven aan alle andere beelden" optie.
      3. Stel het type informatie aan te pakken: Analyze> Set Metingen en selecteer (minstens) "Area", "Standaard deviatie", "Min & max grijswaarde" en "Mean grijswaarde".
      4. Naar cel fluorescentie-intensiteiten te vergelijken, selecteer het gebied s van belang het gebruik van de Freehand selectie knop van ImageJ en pak de cel intensiteiten in Analyze> Meet. De resulterende tabel bevat de meetwaarden enkunnen worden opgeslagen en / of gekopieerd naar andere software. De "gemiddelde" waarde is het gemiddelde intensiteit per pixel in het geselecteerde gebied en kan worden vergeleken tussen cellen en tussen cellen en de achtergrond.
      5. In een geëlektroporeerd celmonster, wordt geacht een cel geladen als de gemiddelde intensiteit per pixel groter is dan de gemiddelde intensiteit per pixel van de negatieve controle plus 3 maal de standaardafwijking (Av (I _{beladen cel)>} Av (I _-EP) + 3 * StdDev (I _-EP)).
   2. Build vals gekleurde fluorescentie overlay beelden en films om de kwaliteit en het laden van de monsters te beoordelen.
      1. In ImageJ, overlay beelden zoals het beeld wit licht en fluorescentie beeld overeenkomt met dezelfde FOV in Afbeelding> Kleuren> kanalen samenvoegen. Selecteer een kleur voor elk beeld (C4 (grijs) voor het witte licht, C1 (rood) voor het rode kanaal, C2 (groen voor groene kanaal ... enz.).
      2. Checkop overlay beeld dat de fluorescentie is gelegen binnen de cel grenzen (wit licht) en dat de achtergrond fluorescentie is laag en homogeen (geen lichtpuntjes buiten de cel grenzen).
      3. Voordat het analyseren van een groot aantal cellen, controleer kwalitatief de beelden die overeenkomen met de negatieve monster worden vergelijkbaar met de lege cel beelden en geven veel lagere intensiteit dan de geëlectroporeerd cellen.
   3. Voor levensvatbaarheid experimenten, tel handmatig de percentages van het verdelen, niet-delende maar zichtbaar intact (identieke) en beschadigde (dode) cellen van hetzelfde gezichtsveld groeiende loop van de tijd (zie 4.2.6).
   4. Evalueer de levensvatbaarheid van ten minste 200 cellen per monster (geëlektroporeerd, negatieve controle en lege cellen) om voldoende statistieken te verzamelen.
2. Celgebaseerde analyse
   1. Tellen van het aantal geïnternaliseerde biomoleculen per cel door stapsgewijze fotobleking analyse
      1. Segment cellen per selecting het gebied van belang met behulp van de Freehand selectie knop van ImageJ en teken een vorm rond precies de cel (gelijk aan membraan cel).
      2. Pak de cel intensiteiten in de tijd Image> Stapels> Plot Z-as profiel. De resulterende grafiek geeft de gemiddelde intensiteit per pixel voor het gebied binnen de celbegrenzing versus elk filmbeeld resulteert in een photobleaching curve voor die specifieke cel. Het bevat een eerste exponentiële afname van de cel intensiteit tot een onderste asymptoot (achtergrond fluorescentie). De meetwaarden en kunnen worden opgeslagen en / of gekopieerd naar andere software door te klikken op "Opslaan" of "Kopiëren".
      3. Kopieer en plak de bleken waarden in een spreadsheet-kolom (ik _rauw).
      4. Bereken het gemiddelde autofluorescence per pixel die overblijven na photobleaching (I _auto) door het gemiddelde van de I _ruwe waarden verkregen voor de laatste 50-100 frames (lagere asymptoot).
      5. Subtract de gemiddelde autofluorescence per pixel die overblijven na photobleaching voor die cel van de eerste photobleaching curve: Ik _bleken = I _{raw -} I _auto.
      6. Gebruik-basislijn afgetrokken fotobleken TimeTraces (I _bleekmiddel versus kader) geeft minder dan 10 gekwantiseerd stappen om de gemiddelde stapgrootte (unitaire fluorofoor intensiteit) beoordelen vanwege het bleken van een fluorofoor ^26.
      7. Evalueer het aantal geïnternaliseerde moleculen per cel door de initiële basislijn afgetrokken cel intensiteit (I _bleken bij t = 0) te delen door het unitaire fluorofoor intensiteit.
   2. Eencellige FRET efficiëntie
      1. Meet de gemiddelde intensiteit cellen per pixel in zowel de donor en acceptor emissie kanalen (bij donor excitatie) en binnen de celbegrenzing voor elk kanaal verklaren 5.1.1.4.
      2. Meet de gemiddelde pixelintensiteit voor de achtergrond in iedere lAnnel uit een leeg gebied van de dia.
      3. Trek deze achtergrond intensiteit van de gemiddelde intensiteit per pixel. Gebruik deze-achtergrond afgetrokken fluorescentie-intensiteiten te FRET te berekenen voor elke cel door het berekenen van de achtergrond afgetrokken acceptor intensiteit gedeeld door de totale (acceptor + donor)-achtergrond afgetrokken intensiteit op donor excitatie: Ik _acceptor / (I _acceptor + I _donor)
3. Single-molecule analyse
   1. Single-molecule tracking en diffusie-analyse
      Opmerking: Het protocol voor het volgen diffunderen fluorescerende moleculen in levende cellen en hun schijnbare diffusiecoëfficiënt evalueren beschreven ^{26 28.}
      1. Kort gezegd, passen de beelden van enkele fluoroforen in elk frame door een 2D elliptische Gauss. Link gelokaliseerde moleculen om een ​​track als ze verschenen in opeenvolgende frames binnen een venster van 5-7 pixels (0,48-0,67 micrometer). Gebruik een Memory parameter van 1 beeld om rekening te houden met de voorbijgaande verdwijning van een fluorofoor te wijten aan het knipperen of gemiste lokalisatie.
   2. In vivo smFRET analyse
      1. Handmatig te identificeren gelokaliseerde moleculen in cellen van films door te gaan door middel van een film in ImageJ en identificeren van immobiele (of vrij immobiel) moleculen in de FRET (acceptor) kanaal.
      2. Om de intensiteiten in de acceptor en donor-kanaal dat overeenkomt met een immobiele molecuul te halen, selecteert u het gebied rond de molecule in elk kanaal met behulp van de "Oval" selectieknop van ImageJ (cirkel rond elke afzonderlijke fluorofor, met behulp van een straal ~ 3-pixel) en pak het molecuul intensiteiten in Analyze> Meet. De resulterende tabel bevat de meetwaarden en kunnen worden opgeslagen en / of gekopieerd naar andere software.
      3. Bereken achtergrondwaarden per kanaal van de gemiddelde pixelintensiteit van een cirkel van dezelfde grootte in een leeg gebied van de schuif alle frames geanalyseerd.
      4. Gebruik-achtergrond afgetrokken fluorescentie waarden in de donor en acceptor kanalen (op donor excitatie) voor de fluorescentie en FRET tijd sporen, zoals in de single-cell FRET geval (zie 5.2.1.7).
         Opmerking: Geautomatiseerde en robuuste analyse en algoritmen zijn beschreven in de referenties ^{26-28, 31.}

Resultaten

Monstervoorbereiding

De verschillende stappen van het protocol worden als schema in figuur 1. Als voorbeeld vertegenwoordigen de belading van bacteriën dubbel gelabeld (donor en acceptor kleurstoffen) DNA-fragmenten. Representatieve resultaten voor DNA internalisering worden getoond in Figuur 2. Voor elke geëlektroporeerde monster werden gegevens voor lege cellen en niet-geëlektroporeerde cellen ook opgenomen (figuur 2). "Lege cellen" komen overeen met cellen noch geïncubeerd met fluorescerende biomoleculen noch geëlectroporeerd electrocompetente; de intensiteit van de fluorescentie kanaal weerspiegelt de autofluorescentie niveau onder identieke experimentele condities (laservermogen, tijdsresolutie, temperatuur, etc.). "Non-geëlektroporeerde cellen" (ook genoemd -EP, dwz minus EP) corresponderen met een negatieve controle waarin electrocompetente cellen werden geïncubeerd met fluorescerende biomolecules maar niet geëlectroporeerd. Deze niet-geëlektroporeerde cellen moet fluorescentie niveau gelijk aan de autofluorescentie van de lege cellen en significant lager dan de fluorescentie-intensiteit weergegeven loaded geëlektroporeerde cellen vertonen. Dit bevestigt de verwijdering van alle niet-geïnternaliseerde gelabelde biomoleculen die zouden hebben gehandeld op grond van de buitenste celmembraan.

Figuur 2: Representatieve resultaten voor de internalisering van dsDNA gelabeld met verschillende fluoroforen in verschillende concentraties in bacteriën (AE) en gist (F) Van links naar rechts:. Wit-licht, fluorescentie en overlay afbeeldingen. - / + EP geeft incubatie met / zonder elektroporatie. Schaalbalken: 3 micrometer. A. Cy3B dsDNA, 10 pmol, E. coli. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol, E. coli. C. Alexa647 dsDNA, 5 pmol, E. coli. D. Cy3B dsDNA, 100 pmol, E. coli. E. ATTO647N dsDNA, 100 pmol, E. coli. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol, gist. Dit cijfer is aangepast uit referentie 26. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Tellen van het aantal geïnternaliseerde biomoleculen per cel

De procedure voor het schatten van het aantal geïnternaliseerde gelabelde biomoleculen per cel met fotobleken analyse wordt getoond in Figuur 3 en aanvullende film 2, samen met representatieve resultaten verkregen met verschillende concentraties gelabeld DNA. Cel laden efficiency toeneemt met het oorspronkelijke bedrag van bebroede gemerkt DNA, waardoor de gebruiker af te stemmen het aantal gelabelde moleculen per cel van een "single-molecule" niveau (<10, Aanvullende Movie 2B) tot een "ensemble" niveau (> 10 , Aanvullende Movie 2A). Een robuuste manier van het schatten van het percentage van de beladen cellen is to tel het aantal geëlektroporeerde cellen die een cel intensiteit boven de gemiddelde cel intensiteit van niet geëlektroporeerde cellen plus 3 maal de standaardafwijking (dwz Av (I-EP) + 3 * StdDev (I-EP) waarin Av = gemiddeld I = intensiteit per pixel, Std. Dev. = standaardafwijking en -EP = niet geëlektroporeerd) zoals getoond in figuur 3.

Figuur 3:. Het tellen van het aantal geïnternaliseerde moleculen met behulp van photobleaching analyse (A) Single-cell fotobleking analyse. Voorbeelden van fluorescentie-intensiteit TimeTraces (blauw: de ruwe gegevens; rood: fit;-openingen: WL en fluorescentie beelden van E. coli geladen met-ATTO647N gelabeld dsDNA voor en na het bleken). Top: single-step bleken evenement. Midden: cel met ± 3 moleculen tonen blekenen het knipperen. Onder: cel met> 10 stappen met ten minste 10 moleculen (B) Histogram van éénfasige hoogte intensiteiten vanuit een geautomatiseerde stappen fitting algoritme van 57 cellen met minder dan 6 onderscheiden stappen.. Single-Gauss fit is gecentreerd op 11 ± 3 au, wat overeenkomt met een unitaire fluorfoor intensiteit van 8100 fotonen per seconde. Het sterretje geeft de bak verzamelen van alle stappen hoogten boven of gelijk 50 au (C) Histogram geïnternaliseerde moleculen per cel geëlektroporeerd met verschillende hoeveelheden ATTO647N dsDNA, berekend na de eerste fluorescentie-intensiteit te delen door het unitaire fluorofoor intensiteit. Van boven naar beneden: lege cellen (dat wil zeggen, niet geïncubeerd met fluorescerende moleculen en niet geëlectroporeerd), niet-geëlektroporeerde (maar geïncubeerd met fluorescerende moleculen, genaamd -EP), en geëlectroporeerd cellen geïncubeerd met 10 en 100 pmol dsDNA (naam + EP). Lege en niet-geëlektroporeerde cellen overeenkomenom autofluorescentie, terwijl geëlectroporeerd cellen vertonen een brede spreiding van geïnternaliseerde moleculen, met een hoger aandeel van zeer beladen cellen op 100 pmol (≥ 4 moleculen, zie-sterretje gemarkeerde bin). Internalisatie efficiëntie (fractie van cellen met Int.> Betekenen + 3x Std. Dev. Van niet -EP monster) voor de 10 en 100 pmol monsters was 94% en 90%, respectievelijk. Gemiddeld aantal geïnternaliseerd moleculen per cel: 121 ± 106 moleculen voor 10 pmol dsDNA, en 176 ± 187 moleculen voor 100 pmol dsDNA. Instellingen: 100 ms belichting, groothoek verlichting. Schaalbalken: 1 urn. Dit cijfer is aangepast uit referentie ^26. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Cel laden en levensvatbaarheid

Naast het veranderen van de hoeveelheid gemerkte biomoleculen aan de cellen toegevoegd voorafgaand aan elektroporatie, degebruiker kan afstemmen van de hoeveelheid geïnternaliseerd moleculen door te kiezen voor verschillende veldsterktes tijdens elektroporatie (Figuur 4, Aanvullende Film 1). Hogere sterktes veld leiden tot een grotere internalisatie efficiëntie, maar leiden tot een lichte daling van de levensvatbaarheid van de cellen. Voor eiwit internalisatie, kan het gebruik van een filtratie stap helpen bij het verwijderen van niet-geïnternaliseerde gelabelde eiwitten (zie 3.3.3.1.1). In dergelijke gevallen cel filtratie zorgt waargenomen fluorescente proteïnen inderdaad geïnternaliseerd in het bacteriële cytoplasma; We merken echter op dat de filtratie heeft ook een negatief effect op de levensvatbaarheid van de cellen (voor meer details, zie ref ^22).

Figuur 4: Invloed van elektroporatie spanning op cel laden en levensvatbaarheid (A) Bar grafiek vertegenwoordigen van het effect van elektroporatie veldsterkte op laden effic.iency (rode balken) en de levensvatbaarheid van de cellen (groene balken). 84 ± 8% van de niet-geëlektroporeerde cellen (0 kV / cm) delen na 1 uur op een agarose pad bij 37 ° C. Onder dezelfde omstandigheden, 78 ± 3% en 49 ± 3% van de cellen geëlektroporeerd bij 0,9 kV / cm en 1,8 kV / cm respectievelijk delen na 1 uur. Voor beladingsrendement, 73 ± 8% van de cellen zijn geplaatst 0,9 kV / cm, terwijl 92 ± 6% van de cellen bij 1,8 kV / cm geladen. De fout balken geven de standaard afwijking van drie onafhankelijke metingen; meer dan 200 cellen werden geanalyseerd voor elk monster en elke herhaling. Gemiddelde beladingsrendement toeneemt met elektroporatie spanning aan de lichte koste van cellevensvatbaarheid. (B) celgebaseerde fluorescentiemetingen over meerdere generaties blijkt dat de totale fluorescentie-intensiteit evenredig is verdeelt tussen beide dochtercellen. Cell 1 en 2 verwijst naar het aantal cellen in het witte licht (links) en het fluorescentie bij t = 0. Scalebar: 1 micrometer). Dit cijfer is aangepast uit referentie 26.

Eiwit internalisatie

Representatieve resultaten voor eiwit internalisatie zijn in de figuren 5A & B. Het is bijzonder belangrijk om zoveel mogelijk van de resterende vrije (niet omgezette) kleurstof uit het eiwit monster net vóór elektroporatie. In de voorbeelden in figuren 5A en B, de Cy3b gemerkte Klenow Fragment monster (Cy3b-KF, waarbij KF is het Klenow fragment van E. coli DNA polymerase I, 66 kDa) bevat 1% vrije verven; dergelijke kleurstof bijdrage aan de totale celbelasting verwaarloosbaar. Vergelijkingen van de geëlektroporeerde monster van belang met zowel de niet-geëlektroporeerde cellen (geïncubeerd met dezelfde hoeveelheid gemerkt eiwit) alsook cellen geëlektroporeerd met de equivalente hoeveelheid vrije kleurstof vormen twee vereiste controles om te zorgen dat de waargenomen fluorescente moleculeninderdaad geïnternaliseerd gelabelde eiwitten.

Figuur 5: Eiwit internalisatie in levende bacteriën (A) Vertegenwoordiger fluorescentie overlay gebied van uitzicht.. Cellen geëlektroporeerd bij 1,4 kV voltage met 50 pmol RNAP ω subeenheid van een eiwit voorraadoplossing dat slechts 1% vrij Cy3b kleurstof bevatte. Niet-geëlektroporeerde (niet -EP) en lege cellen worden gedefinieerd als voorheen. Vrije kleurstof werd geïnternaliseerd in dezelfde concentratie als in de RNAP ω geëlektroporeerd monster. Imaging in breed modus, 532-nm excitatie bij 1 mW, 50 ms belichting. (B) Verspreiding van gecorrigeerde cellen gemiddelde intensiteiten monsters (A), gezien in verhouding tot de totale celtelling. Meer dan 400 cellen per monster werden gesegmenteerd. Dit cijfer is aangepast uit referentie ^22. (C) internalisering van unlaBeled T7 RNA polymerase (T7 RNAP, 98 kDa) in elektrocompetente DH5a die de pRSET-EmGFP plasmide coderend Emerald GFP (EmGFP) onder controle van een T7 promoter. Links: Schematische assay. Midden: fluorescentie overlay. Rechts: histogrammen van cel-gebaseerde fluorescentie-intensiteiten voor de niet-geëlektroporeerde monster (boven) en cellen geïncubeerd en geëlectroporeerd met T7 RNAP (bodem); ongeveer 11% van de geëlektroporeerde cellen vertonen een hoge fluorescentie-intensiteit (fractie van cellen met Int.> betekenen + 3x Std. Dev. van niet -EP monster) aangeeft uitdrukking van EmGFP. De sterretjes geven bakken verzamelen van alle intensiteiten boven of gelijk 1.100 au Schaalbalk: 3 micrometer. Dit cijfer is aangepast uit referentie ^26.

Figuur 5C toont een andere toepassing van eiwit elektroporatie. Hier, de geëlektroporeerde eiwit ongelabeld, maar zijn internalisatie veroorzaakt een waarneembare fluorescent respons. Dit experiment bevestigt de presence en functionaliteit van geëlektroporeerd eiwitten in het cytoplasma. Ongelabeld T7 RNA polymerase (98 kDa) werd geïnternaliseerd in E. coli stam DH5a met een plasmide dat codeert voor fluorescerend eiwit EmGFP onder de controle van een T7 promoter ^26. Als het gen voor T7 RNA polymerase ontbreekt in DH5a, EmGFP expressie in onze experimenten vereist dat functionele T7 RNA polymerase in de cellen geïntroduceerd door elektroporatie (Figuur 5C). Na elektroporatie met 1 pmol T7 RNAP,> 11% van de cellen (blauwe balk figuur 5C) vertoonde fluorescentie hoger dan de negatieve controle (geïncubeerd met dezelfde hoeveelheid T7 RNAP, maar niet geëlektroporeerd). Dit resultaat wordt dat een deel van het T7 RNAP moleculen geïnternaliseerd door elektroporatie behouden hun integriteit in vivo en hun beoogde functies in de cel cytoplasma.

In vivo FRET op de single-moleculeen single-cell niveau

Tenslotte wordt de opname en analyse van dubbel gemerkte moleculen in levende bacteriën getoond in Figuur 6 en aanvullende Film 3. fluorescent eiwit fusies zijn niet ideaal voor in vivo smFRET studies, de mogelijkheid om dubbel gelabelde biomoleculen leveren in levende cellen via elektroporatie is een van de grote troeven van deze methode. Figuur 6A presenteert eencellige FRET analyse van bacteriën geladen met verschillende FRET DNA-normen (met behulp van Cy3B en Atto647N fluoroforen als donor-acceptor FRET paar). De cellen worden geëlektroporeerd met 20 pmol van drie korte dubbel gelabelde dsDNA FRET normen schijnbare FRET efficiënties (E *) van 0.17, 0.48 en 0.86 in vitro (vooraf bepaalde ^26). Alle DNA in cellen kan efficiënt (Figuur 6A, links) en de belangrijkste piek van elke single-cell E * distributie komt goed overeen met de in vitro resultaten (Figuur 6A, Rechts). In de tussen- en hoge FRET monsters celpopulaties met lagere E * dan verwacht worden waargenomen, waarschijnlijk door een combinatie van acceptor bleken en fotofysische inactiviteit variabele celbelading (dus variabel signaal-ruisverhouding) en DNA degradatie .

Figuur 6:.. Representatieve resultaten eencellige en single-molecule FRET observatie in levende bacteriën Ensemble en smFRET studies in enkele bacteriën (A) Analyse van cellen geladen met 20 pmol elk van de drie DNA FRET normen vertonen laag (~ 0,17) tussenproduct (~ 0,48), en een hoog (~ 0,86) FRET (zoals gemeten met behulp van in vitro enkel-molecuul metingen; zie REF 26). Links: wit licht en groen / rood (FRET) fluorescentie overlay-beelden (Schaal bar: 3 micrometer). Voorbeelden van FRET waarden uit verschillende cellen worden aangegeven (wit). Tuig ht (boven naar beneden):. ongecorrigeerde cel-gebaseerde FRET (E *) histogrammen voor donor alleen (donkergroen), laag (lichtgroen), tussenproduct (geel), en hoog (rood) FRET DNA-normen (B-D) In vivo smFRET. Cellen worden geladen met 0,25 pmol intermediaire FRET DNA (paneel B), 0,25 pmol high-FRET DNA (paneel C) en 5 pmol dubbel-gemerkte KF (paneel D). Linker kolom: groen / rode fluorescentie overlay van één frame voor en na de acceptor fotobleking. Middenkolom: tijd sporen overeenkomen met de molecule in de gele cirkel. FRET efficiëntie, donor emissie-intensiteiten, en acceptor emissie-intensiteiten zijn weergegeven in blauw, groen en rood, respectievelijk. Rechter kolom: FRET histogrammen van de donor alleen moleculen (groen) en donor-acceptor-moleculen (geel, rood en grijs) van 20 keer de sporen voor elk monster. Schaalbalken: 3 urn voor A, 1 urn voor B-D. Dit cijfer is aangepast uit referentie ^26.208fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om smFRET observeren in vivo voor DNA of eiwit monsters, kleine hoeveelheden (0,25 pmol) van intermediaire en hoge FRET DNA-normen (figuur 6B, C) ​​of 5 pmol van dubbel-gelabeld KF (Alexa647 / Cy3B fluoforen als FRET paar, figuur 6D) worden geëlektroporeerd in E. coli. Dergelijke concentraties tot vele cellen opgeladen met weinig (n = 1-10) gemerkte moleculen, die rechtstreeks lokalisatie, tracking en FRET controleren op afzonderlijke moleculen. Sommige diffunderen vrij, terwijl anderen immobiel verschijnen of verspreiden langzaam (Aanvullende Movie 3). TimeTraces van geïmmobiliseerde dubbel-gemerkte biomoleculen (figuur 6, midden) duren 1 tot 30 s en tonen de kenmerken van smFRET: anticorrelated veranderingen in de donor en acceptor fluorescentie bleken bij acceptor (bijvoorbeeld, t ~ 16 sec Figuur 6B middle ), gevolgd door enkelvoudigetweestaps donor bleken (bijvoorbeeld t ~, 19 sec Figuur 6B). FRET distributies gegenereerd uit dergelijke TimeTraces (Figuur 6, rechts) resulteren in een gemiddelde waarde, dat is in uitstekende overeenkomst met gepubliceerd in vitro studies ^26,31,32. Deze resultaten vast te stellen de mogelijkheden voor kwantitatieve smFRET studies over geïnternaliseerde DNA en eiwitten, en suggereren dat eiwitten behouden hun integriteit en de structuur van elektroporatie en internalisatie (zoals ondersteund door de T7 RNAP internalisatie experimenten).

Aanvullende Film 1:. Cellevensvatbaarheid Links: Wit licht beelden. Rechts: fluorescentie beelden. Geanimeerde GIF animatiefilm waarin de divisie na elektroporatie (1,8 kV / cm) van bacteriën geladen met 10 pmol Atto647 gelabelde DNA. Het totale schijnbare afname van fluorescentie door verdunning van gemerkt DNA op celdeling en ook gedeeltelijk het fotobleken die tijdens elkemeting.

Aanvullende Movie 2: Cel-gebaseerde fotobleking studies A.. Representatief voorbeeld van een zwaar beladen cel (die> 100 Atto647N gelabelde DNA moleculen). Wit licht beeld van de cel van belang (rode rechthoek) linksboven. Rechtsboven, film van de beladen cellen waaruit hun fluorescentievervaltijd gedurende enkele minuten. Bottom, tijd spoor van de totale fluorescentie-intensiteit verval van de cel van belang. Organische fluoroforen kunnen vertonen photobleaching levens 2 ordes van grootte hoger dan KP's (hier, ~ 41 sec voor Atto647N). B. Representatieve voorbeeld van een cel geladen met minder dan 10 gemerkte moleculen (3 in dit geval). Top, hetzelfde als het paneel A. Bottom, tijd spoor van de totale fluorescentie-intensiteit van de cel van belang tonen van enkele stap bleken en / of knipperende overeenkomt met enkele organische fluoroforen. De gemiddelde hoogte van deze stappen komt overeen met de single-molecule unitaire intensiteit (hier ~12 au) gebruikt voor het schatten van het oorspronkelijke aantal geïnternaliseerd moleculen per cel. Films onder continue rode laser excitatie bij 300 uW vermogen en 100 msec per frame.

Aanvullende Movie 3: I n vivo single-molecule FRET Top:. Cellen geladen met 0,25 pmol high-FRET DNA (zoals in figuur 6C) voortdurend gecontroleerd op 50 ms per frame onder nTIRF verlichting met behulp van 1 mW groen (532 nm) laser. Elk frame is een groen / rood (FRET) fluorescentie overlay van elk kanaal. Verspreiding en immobiele rood (intact) en groene (enkelvoudig actief label) DNA-moleculen kunnen worden waargenomen. Onder: Tijd trace correspondeert met het molecuul in de gele cirkel. FRET efficiëntie, donor emissie-intensiteiten, en acceptor emissie-intensiteiten zijn weergegeven in blauw, groen en rood, respectievelijk. Anti-gecorreleerde acceptor bleken evenement (rood-voor-groen overgangen) komt overeen met de handtekening van de single-molecule FRET.

Discussie

Veel parameters kunnen worden gevarieerd tijdens cell elektroporatie en data acquisitie afhankelijk van het biologisch systeem van belang en de precieze aard van het experiment (celniveau of single-molecule analyse). Wanneer bijvoorbeeld electroporating DNA in bacteriën, 0,25-5 pmol gelabelde dsDNA fragmenten leidt tot een lage internalisatie efficiëntie, die rechtstreeks werkende moleculen detectie (bijv., Zonder fotobleken vooraf). Boven 5 pmol dsDNA, cellen hebben de neiging om zwaar worden geladen, een regime beter geschikt voor single-cell analyse. Alle gelabelde DNAs ook eerder gel gezuiverd om elk spoor van vrije kleurstof te verwijderen (niet-gereageerde fluorofoor) vanaf het DNA voorraadoplossing. Trouwens, mogelijke problemen met DNA degradatie, met name voor smFRET experimenten, kunnen worden aangepakt met behulp van DNA's met onnatuurlijke nucleïnezuren, of motieven die exonuclease-toegankelijke termini te beschermen, zoals haarspeld lussen.

Een andere adjustable parameter elektroporatie is de veldsterkte toegepast tijdens elektroporatie. Lage veldsterkte (~ 1 kV / cm) leidt tot een lage beladingsgraad geschikt voor single-molecule studies. Hogere sterktes veld (tot 1,8 kV / cm) zal het laden efficiëntie te verhogen; echter, er een omgekeerde correlatie tussen veldsterkte en levensvatbaarheid van de cellen na elektroporatie (zie figuur 4). Ter referentie, een normale veldsterkte voor bacteriën en gist elektroporatie is -1,5 kV / cm. De tijdconstante vertegenwoordigt de lengte van het verval, is een handige parameter te volgen, omdat de tijdconstante daalt zodra er vonken verschijnsel optreedt in de cuvette. Onder normale instellingen, moet de tijdconstante van meer dan 4 ms; lagere waarden zal leiden tot een lage beladingsgraad of zelfs niet-geladen beschadigde cellen. De meeste electroporators bieden andere vrijheidsgraden (zoals "pulse truncatie" of "pulsvorm"), die kan worden aangepast om af te stemmen beidecel laden en levensvatbaarheid. We pasten deze methode zowel bacteriën en gisten, maar soortgelijke procedures ook de internalisatie van gelabelde biomoleculen in zoogdiercellen mogelijk met geschikte electroporator instellingen omdat hun membraan eigenlijk minder complex (enkele lipide dubbellaag) en aangezien elektroporatie is al gebruikt met dergelijke cellen ^21.

Wanneer internaliserend gemerkte eiwitten, heeft al vrij kleurstof uit het gemerkte eiwit stock oplossing vóór elektroporatie worden verwijderd. Vrije kleurstofmoleculen, vanwege hun kleinere afmetingen, kunnen worden geïnternaliseerd voorkeur de eiwitten van belang en zijn moeilijk te onderscheiden tijdens de data-analyse (ondanks hun verwachte snellere diffusie). Als richtlijn voor een monster van biologisch gelabeld eiwit geschikt voor elektroporatie, moet de hoeveelheid resterende vrije kleurstof minder dan 2% (gedetecteerd met fluorescentie scanning van een SDS-PAGE) ^22. Dit proces is bijzonder belangrijk,zoals sommige moleculen kunnen kleven aan de buitenste membranen van geëlektroporeerd bacteriën of gist. In dit verband moet het negatieve controlemonster fluorescentie-intensiteit per cel duidelijk onder geëlektroporeerde cellen, idealiter zo laag als de autofluorescentie niveau van lege cellen (cellen die niet zijn geïncubeerd met elk fluorescent gelabelde biomoleculen of elektroporatie, figuur 2) weergegeven.

Zoals met dsDNA, wordt de internalisatie efficiëntie van gelabelde eiwitten gekoppeld aan de hoogte van biomoleculen aan de cellen toegevoegd voorafgaand aan elektroporatie. Echter, andere parameters, zoals de grootte en lading, een rol spelen in internalisatie. Kleine eiwitten vertonen een hoge internalisatie efficiëntie, terwijl grotere eiwitten (tot 98 kDa) kunnen vervolgens worden geïnternaliseerd, maar met een lagere efficiëntie (figuur 5) ^26. De isolelectric punt van het proteïne, potentiële interacties met de celmembraan en andere fysico-chemische parameters ookinvloed cel laden tijdens elektroporatie. Dientengevolge moeten gebruikers experimenten optimaliseren hun eigen systeem wetenschap dat een hoge beginconcentratie van gemerkt eiwit (> 50 uM) de beste kans op succes geladen geven. Elektroporatie biedt ook een nieuwe tool te verstoren en te analyseren cellulaire functie door de invoering van eiwitten en andere biomoleculen in cellen (ofwel gemerkte of niet-gemerkte). De T7 RNA polymerase experimenten (Figuur 5C) aanwezig zo'n voorbeeld van een experiment waarbij we een biomolecule die genexpressie veranderen in vivo middels elektroporatie kunnen introduceren.

Bij het uitvoeren van enkel-molecuul fluorescentie experimenten wordt TIR belichting meestal de voorkeur boven andere verlichtingsmodi omdat daarmee de beste signaal-ruisverhouding prikkelen slechts fluoroforen binnen een dunne gedeelte boven het dekglaasje oppervlak (~ 100 nm). Maar beeldvorming gelabelde biomoleculen te diffunderen in levende micro-organismen kunnen rekatern dieper verlichting (tot 0,8 micrometer voor E. coli). Dieper verlichting wordt bereikt HILO modus toch een hoge signaal-ruisverhouding. Anderzijds, breed beeldveld is bijzonder belangrijk voor stapsgewijs fotobleken analyse, waarbij de gebruiker het schatten van het aantal geïnternaliseerde moleculen door fotobleken een volledig geladen cel met hoog laservermogen en de initiële cel fluorescentie-intensiteit te delen door het unitaire intensiteit geproduceerd door een enkel molecuul (één fotobleken stap, figuur 3). Widefield beeldvorming is ook vereist voor langdurige molecuul volgen om de diffunderende moleculen van interesse lokaliseren zelfs als de trajecten de gehele cell volume.

In dit protocol presenteren we hoe elektroporatie, een standaardtechniek voor biologen en biochemici voor het afleveren van nucleïnezuren in cellen, is een eenvoudige werkwijze voor het afleveren fluorescerende biomoleculen in verschillende celtypen. This nieuw, high-throughput techniek biedt een unieke tool om gelabelde moleculen te observeren in hun eigen omgeving. Bovendien biomoleculen gemerkt met fluoroforen die een breed golflengtegebied, elektroporatie kunnen moleculen gemodificeerd met vele chemische groepen, zoals onnatuurlijke nucleotiden en aminozuren, metaal chelatoren, crosslinkers en kooien groepen leveren. Als het biologische systeem van belang is niet essentieel voor de celontwikkeling, kan het gen dat codeert voor het doeleiwit worden verwijderd (of aangereden), zodat de waargenomen na internalisatie eiwitten vertegenwoordigen alle (of de meeste) van het intracellulaire eiwit- . In wezen kan elektroporatie "transplantatie" de flexibiliteit van in vitro biologische conjugaten in levende cellen ten voordele inspanningen synthetische biologie, systeembiologie en in vivo single-molecule detectie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells	Invitrogen	11319-019	of een andere commerciële of laboratorium electrocompetente bacteriën of gist.
EZ Rich Defined Madia	Teknova	M2105	media met lage fluorescentie en rijke voedingsstoffen
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100	of een klassieke elektroporator voor transformatie van micro-organismen
Certified Molecular Biology agarose	Biorad	161-3100	agarose met lage fluorescentie voor agarose pad
Microscope coverslips No 1.5 dikte	Menzel	BB024060SC	verwijder achtergronddeeltjes door de dia's 1 uur lang in een oven op 500 °C te verwarmen
Single-molecule fluorescentiemicroscoop	Zelfgebouwd		beschreven in REFs
Lokalisatiesoftware	Op maat gemaakt, online beschikbaar		MATLAB en C++ softwarepakket dat kan worden aangepast voor lokalisatie-analyse.
Trackingsoftware	Online beschikbaar		MATLAB implementatie door Blair en Dufresne.