Methodenartikel

Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle In Situ Met behulp van de TUNEL Methode

16K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52211

⸱

16 december 2014

 , 
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Deze video beschrijft dissectie, weefselverwerking, sectioenering en op fluorescentie gebaseerde TUNEL-labeling van muis skeletspier. Het beschrijft ook een methode voor semi-geautomatiseerde analyse van TUNEL-labeling.

Samenvatting

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridinetrifosfaat (dUTP) nick-end labeling (TUNEL) is de methode om het TdT-enzym te gebruiken om covalent een gemerkte vorm van dUTP te hechten aan 3’-uiteinden van dubbel- en enkelstrengs DNA-breuken in cellen. Het is een betrouwbare en nuttige methode om DNA-schade en celdood in situ te detecteren. Deze video beschrijft dissectie, weefselverwerking, sectiëring en op fluorescentie gebaseerde TUNEL-labeling van muisskeletspier. Het beschrijft ook een methode voor semi-automatische TUNEL-signaalkwantificering. Inherente normale weefselkenmerken en weefselverwerkingscondities beïnvloeden de mogelijkheid van het TdT-enzym om DNA efficiënt te labelen. Weefselverwerking kan ook ongewenste autofluorescentie toevoegen die de detectie van TUNEL-signalen zal verstoren. Daarom is het belangrijk om empirisch weefselverwerkings- en TUNEL-labelingmethoden te bepalen die het optimale signaal-ruisverhouding zullen opleveren voor daaropvolgende kwantificering. De hier beschreven fluorescentiegebaseerde assay biedt een manier om autofluorescente signalen uit te sluiten door digitale kanaalsubtraksie. De TUNEL-assay, gebruikt met geschikte weefselverwerkingstechnieken en controles, is een relatief snelle, reproduceerbare, kwantitatieve methode voor het detecteren van apoptose in weefsel. Het kan worden gebruikt om DNA-schade en apoptose te bevestigen als pathologische mechanismen, om aangetaste celtypen te identificeren en om de werkzaamheid van therapeutische behandelingen in vivo te beoordelen.

Inleiding

Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) dUTP nick end labeling (TUNEL) is het proces van het gebruik van de TdT enzym om dUTP tot 3 hechten 'einden van de dubbele en enkelstrengs DNA breekt 12,23. De TUNEL methode voor de detectie van apoptose en DNA schade werd voor het eerst 20 jaar geleden door Gavrieli et al. 1,12,24. Het is sindsdien geëvalueerd en geoptimaliseerd in verschillende weefselpreparaten 7,23,27,40. TUNEL is gebruikt om ischemie geïnduceerde celdood van neuronen 6,14,29 en 43,44 cardiomyocyten, excitotoxische neuronale celdood 30,31 bestuderen, en als biomarker in artritisbehandeling 39. Er is ook gebruikt als een prognostische factor en tumorcel marker in verschillende menselijke kankers 2,3,15,32,37,38,42.

Alternatieve methoden bestaan ​​voor DNA schade en celdood detectie, maar ze hebben technische uitdagingen en restricties. Southern blotting kan worden gebruikt quantify DNA schade in zijn geheel weefsel lysaten 7,9-11, maar deze methode biedt geen cellulair niveau resolutie en is moeilijk te kwantificeren. De komeettest is een alternatief cel-gebaseerde methode die vereist extraheren bewaarde kernen van cellen 4,20,28,36. Hoewel de comet assay werkt goed op gekweekte geïsoleerde cellen, is het veel moeilijker om intacte kernen bereiden van skeletspierweefsel 8,21. Zoals met Southern blot, ofwel de comet assay niet celtype-specifieke informatie van een hele spierweefsel homogenaat verschaffen. Een ander alternatief voor de TUNEL methode immunohistochemie met antilichamen tegen enkelstrengs DNA 25,33,41 of tegen eiwitten die deelnemen DNA schade respons en celdood routes (bijvoorbeeld p53, H2AX en caspasen) 13,17,22,40. Dergelijke antilichaam gebaseerde methoden vereisen grondige karakterisatie van antilichamen en uitstekende antilichaamspecificiteit een hoge signaal-achtergrond verhouding oplevert. Zelfs wanneer specific antilichamen bestaan, kunnen zij denatureren van het doeleiwit door antigen retrieval procedure 34,35 vereisen. Zoals we hier bespreken, antigen retrieval in spierweefsel leidt tot onaanvaardbaar hoge autofluorescence. In tegenstelling tot de alternatieve methoden, TUNEL behaalt DNA-schade detectie met een hoge signaal en lage achtergrond, uitstekende specificiteit die getest kunnen worden met eenvoudige positieve en negatieve controles, goede weefselpenetratie dat antigen retrieval niet vereist, en cellulair niveau resolutie. Bovendien neemt de TUNEL methode ongeveer 4 uur in beslag, terwijl alternatieve overnacht incubatie vereisen meestal.

We bestuderen skeletspier celdood in een muismodel van spinale musculaire atrofie (SMA) 10 die is gegenereerd door Hsieh-Li en collega 16. Apoptotische cellen te kwantificeren in de spier, hebben wij een werkwijze weefselpreparaat, kleuring en kwantificering die robuust werkt in verschillende skele ontwikkeldTal spiergroepen op verschillende ontwikkelingsstoornissen tijdstippen bij muizen. We maken gebruik van een in de handel verkrijgbaar TUNEL-labeling kit en in de handel verkrijgbare software voor beeldanalyse. We hebben ook met succes gebruikt de TUNEL assay in combinatie met immunofluorescente kleuring in het ruggenmerg 10.

De hier beschreven methoden zijn nuttig voor onderzoekers die willen weefselpathologie mechanismen van ziekten, mechanismen van veroudering en ontwikkelingsstoornissen (pre- en postnatale) celdood in de skeletspier. De TUNEL-techniek is bijzonder nuttig voor studies van DNA schade en herstel en celdood in modelsystemen waar slechts een subset van cellen beïnvloed en celniveau resolutie noodzakelijk.

Deze video beschrijft dissectie, weefsel verwerking, snijden, en fluorescentie gebaseerde TUNEL etikettering van de muis skeletspieren. Het beschrijft ook een werkwijze voor semi-automatische TUNEL signaal kwantificering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Alle dierlijke procedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health 26 uitgevoerd. Het protocol (MO13M391) werd goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite.

1. Neonatale Mouse Sacrifice, Dissection en Fixatie

  1. Offeren een neonatale muis door CO 2 inademing.
  2. Onmiddellijk afgesneden van de achterbeen boven de knie. Tot ongeveer postnatale dag 7, de botten zijn zacht genoeg om door te snijden met een groot laboratorium schaar of een scherp mes en om vervolgens deel aan een cryostaat.
  3. Plaats het achterbeen in 10 ml ijskoude 4% paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een 15 ml buis.
  4. Onderdompeling fix het achterbeen in paraformaldehyde voor 4-24 uur bij 4 ° C. Embryonaal weefsel vereist slechts een aantal uurs van fixatie.
    1. Vermijd fixatie langer dan 24 uur, omdat dit TUNEL assay efficiëntie kan verminderen.
  5. Cryoprotect het achterbeen door onderdompeling in sucrose-oplossing.
    1. Paraformaldehyde tot 10% sucrose in PBS wijzigen op dezelfde 15 ml buis, incubeer overnacht bij 4 ° C.
    2. Wijziging 30% sucrose in PBS, incubeer overnacht bij 4 ° C of totdat de achterpoot zinkt naar de bodem van de buis. Weefsel kan worden achtergelaten in 30% sucrose gedurende een langere periode, mits de sucrose steriel gefiltreerd is.

2. Tissue Embedding

  1. Vul een gelabelde inbedding mal helft met inbeddingsmedium.
  2. Plaats achterbeen bovenop het inbeddingmedium met de snijkant zo dicht mogelijk bij één wand van de matrijs. Markeer de oriëntatie van het achterbeen aan de buitenzijde van de matrijs.
    1. Meerdere achterpoten insluiten en snijd in hetzelfde blok. Het is echter belangrijk dat alle hindlimbs in het blok evenwijdig aan elkaar secties krijgen op overeenkomen niveaus langs de as van de ledemaat.
  3. Bedek achterpoten met inbeddingsmedium. Als achterpoten verschuiven tijdens het gieten het medium, heroriënteren ze met stompe getipt tang of een tandenstoker.
  4. Laat inbeddingmedium de weefsels infiltreren bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min.
  5. Plaats mallen direct op droog ijs of in isopentaan op droog ijs te bevriezen inbedmedium. Zorg ervoor dat de mallen niveau te allen tijde te houden en het verschuiven van de ingebed weefsel te voorkomen.
  6. Bewaar bevroren schimmels bij -80 ° C tot klaar te snijden, tot enkele maanden.

3. cryosectioning Embedded Ledematen

  1. Stel cryostaatkamer temperatuur tot -20 ° C, object temperatuur tot -18 ° C; passen temperatuur object af als dat nodig is.
  2. Evenwicht het weefsel blok in de cryostaatkamer gedurende ten minste 30 min. Juiste blok temperature is van cruciaal belang voor de afdeling kwaliteit.
  3. Snijd dwarsdoorsneden bij een dikte van 10 urn of minder. Dikkere secties zullen niet volledig worden gepenetreerd door TUNEL reagentia. Gebruik de anti-roll plaat, messen, en bladhoek (typisch 5 °) aanbevolen voor de cryostaat.
  4. Verzamel secties op gelatine of vectabond beklede glasplaatjes bij kamertemperatuur. Direct te plaatsen in een dia doos op droog ijs. Bewaar de doos dia in een aparte bak met droog ijs geplaatst in de buurt van de cryostaat binnen handbereik.
    1. Snijd dwars seriecoupes door de lange as van de ledematen, sla 100-200 urn. Vang minimaal 3 aangrenzende secties bij elke seriële niveau.

4. TUNEL Assay op achterbeen Secties Met behulp van een los verkrijgbare kit (alle stappen bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld)

  1. Ontdooien dia's met secties tot kamertemperatuur en droog 's nachts of in het weekend.
  2. Rehydrateren secties door immersing objectglaasjes in PBS gedurende 2 x 10 min in een Coplin jar. Droog met een lab te vegen, het verwijderen van zoveel vloeistof rond de sectie mogelijk.
  3. Permeabilize secties
    1. Gebruik een niet-proteolytisch, saponine gebaseerde commerciële reagens of 0,5% Tween 20 en 0,05% Triton X100 in PBS.
    2. Plaats de dia in een vochtige kamer. Een eenvoudige vochtige kamer een lege pipet tip doos met een strakke deksel, met net genoeg water toegevoegd aan de bodem van de doos bedekken.
    3. Pipet genoeg reagens op de dia ter dekking van de sectie (50 ul is voldoende voor neonatale muis ledematen). Niet direct pipet op de afdeling, zoals herhaalde agitatie de sectie kan veroorzaken op te heffen van de dia.
    4. Met behulp van stompe getipt tang, plaats een kleine rechthoek van parafilm op de top van de sectie te spreiden de druppel reagens en volledig bedekken de sectie. Eventuele luchtbellen te vormen onder de parafilm, til het uit, droog, en opnieuw toe te passen.
    5. Incubeer dia's met permeabilisatie reagens gedurende 1 uur in een overdekte vochtige kamer. Indien delen beginnen opstijgen van de glijbaan kan permeabilisatie worden teruggebracht tot 30 minuten.
    6. Was de dia's in PBS in een Coplin pot 2 x 5 min. De parafilm rechthoeken zullen zweven naar de top en kan dan worden verwijderd en weggegooid.
    7. Met behulp van een lab doekje, droog zoveel vloeistof rond de secties mogelijk.
  4. TdT-gemedieerde DNA-etikettering break
    1. Volg de instructies van de kit om 1x TdT- etikettering buffer, pipet genoeg etikettering buffer te maken op de dia om weefselcoupe dekken (50 ul is voldoende voor neonatale muis ledematen). Incubeer in de vochtige kamer gedurende 5 min. Als alternatief, dompel de dia in TdT etikettering buffer in een Coplin pot.
    2. Volg kit instructies om TdT- etikettering mix te maken. De kit bevat kobalt, magnesium en mangaan kationen; het mangaankation werkt goed op een verscheidenheid van weefsels, zoals skeletspier, zenuwstelsel tissUE, lever, huid en botten.
    3. Voor een positieve controle, voeg DNase (gemerkt 'nuclease "in de kit) aan de TdT labeling mix. Alternatief vooraf reinigen positieve controle gedeelte met DNase in nuclease buffer gedurende 1 uur bij 37 ° C, volgens de kit instructies. Houd DNase oplossing en DNase behandeld secties uit de buurt van andere experimentele secties om kruisbesmetting te voorkomen.
    4. Voor een negatieve controle, weglaten TdT enzym uit de etikettering mix.
    5. Gebruik een lab doekje om zoveel TdT- etikettering buffer van de glijbaan mogelijk te verwijderen. Pipetteer TdT labeling mix op de schuif (50 ul per groep), bedekken met een nieuwe rechthoek parafilm en incubeer in de vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    6. Volg de instructies van de kit om 1x stop buffer te maken. Gebruik een lab doekje om TdT labeling mix van de glijbaan verwijderen en voeg 200-300 pi stopbuffer de weefselsectie bedekken en incubeer in de vochtige kamer gedurende 5 min. Al ternatively, dompel de dia in stop buffer in een Coplin pot.
    7. Was de dia 2 x 2 min in PBS. Gebruik een lab doekje om zo veel PBS te verwijderen uit de dia mogelijk.
  5. Fluorescentielabelling
    1. Volg kit instructies om fluoresceïne etikettering oplossing voor te bereiden om dNTPs etiketteren DNA-breuken. Pipet oplossing op de glijbaan (50 ul per sectie), dek af met een nieuwe rechthoek van parafilm en incubeer in de vochtige kamer gedurende 20 minuten.
    2. Wash glijbaan voor 2 min in PBS in een Coplin pot. Gebruik een lab doekje om zoveel PBS verwijderen mogelijk van de glijbaan.
    3. Verdun Hoechst 33258 nucleaire vlek 1 ug / ml in PBS en pipet op de slede (100-200 gl voldoende punt dekken). Incubeer in de vochtige kamer gedurende 5 min.
    4. Was 3x gedurende 5 minuten in PBS.
    5. Dekglaasje met antifade fluorescentie montage media en verzegelen randen met nagellak.
jove_title "> 5. Digital Image Acquisition

  1. Acquire beelden met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop met DAPI, FITC en Texas Red filters (of gelijkwaardig). Gebruik een hogere doelstelling vergroting (20X of 40X) om te controleren of de etikettering was succesvol en kernen (intact of gefragmenteerd) werden bestempeld. Een 10X objectief is voldoende voor kwantificering van TUNEL-positieve puncta.
  2. Verzamel beelden van de Hoechst kleuring, TUNEL kleuring, en autofluorescente signaal als drie afzonderlijke valse kleuren kanalen gecombineerd in één afbeelding. Als de TUNEL fluorofoor label is groen, afbeelding autofluorescente signaal in de rode filter, en vise versa.
    1. Houd alle beeldvormende instellingen gelijkwaardig tussen dia's voor volgende drempeling en kwantificering. Voor elk filter, preset en blootstelling opnemen tijden, winst, en binning (geen binning is het beste); denk automatische belichting of gain-instellingen niet gebruiken.
    2. Gebruik trial-and-error om de blootstelling en de gain-instellingen die het beste het bereik van inten zal vangen vindensiteiten in alle gekleurde coupes. Zorg ervoor dat er geen verzadigde pixels in de verkregen beelden, omdat dit vooroordeel kwantificatie.
  3. Neem foto's van het hele spiergroep van belang. Dit kan meerdere afbeeldingen moeten worden "gestikt" samen.

6. beeldanalyse

  1. Gebruik in de handel verkrijgbaar beeldanalyse programma om digitale beelden van TUNEL kleuring te analyseren. Analyse met behulp van commerciële software is hier te zien. Als alternatief kan de gratis software ImageJ van NIH worden gebruikt om TUNEL kleuring te analyseren.
  2. Stain een deel grenst aan het-TUNEL gekleurd gedeelte met hematoxyline en eosine (H & E) en neem een ​​digitale afbeelding op ware gedeelte met een conventionele helderveld microscoop. Met dit beeld H & E in combinatie met een anatomische atlas 5,18,19 om de anatomische structuren te kwantificeren sporen.
  3. Met de TUNEL kanaal uitgeschakeld, handmatig de omtrek van het gebied op te sporen moeten worden gekwantificeerd, met behulpHoechst en autofluorescence kanalen voor begeleiding. Zetten de getraceerd gebied in een masker (een set van geselecteerde pixelcoördinaten te analyseren).
  4. Zet de TUNEL kanaal. Met behulp van de intensiteit drempelen functie in de beeldanalyse programma, zet de lagere drempel om alle autofluorescence signaal uit te sluiten.
  5. Pas dezelfde drempel instelling voor alle beelden in de studie set. Omzetten thresholded selecties in maskers.
  6. Voor elk beeld, combineer de spier gebied masker en de TUNEL masker. De nieuwe combinatie masker zal TUNEL signaal binnen de getraceerd spieren enige gebied te vertegenwoordigen.
  7. Voeren masker kwantificatie van de combinatie masker om aantal objecten te bepalen en object oppervlakte van de TUNEL signaal binnen de getraceerd spier gebied. Voer deze met behulp van de Particle Analyzer functie in ImageJ.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met succesvolle kleuring, moet TUNEL-positief signaal helder genoeg om te isoleren van autofluorescentie door het instellen van de intensiteit drempels zijn. TUNEL-positieve objecten bij een lage vergroting kan verschijnen als lichte onregelmatige fragmenten in de skeletspier (Figuur 1A). Bij hogere vergroting, sommige TUNEL-positieve objecten met klassieke apoptotische morfologie worden waargenomen als het type celdood betrokken is apoptose (Figuur 1B). De positieve controle (DNase toe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een methode voor het opsporen en kwantitatief analyseren van DNA-schade die apoptose in muis skeletspieren wordt beschreven. De procedure omvat weefsel oogsten, TUNEL kleuring, digitaal beeld acquisitie, en beeldanalyse. Gemeenschappelijke histologische leveringen en gereedschappen nodig, en een bijzondere economische TUNEL kit noodzakelijk. De essentiële grote apparatuur items die nodig zijn een cryostaat, epifluorescerende microscoop met digitaal beeld vermogen, en een computer systeem voor beeldanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH-NINDS-subsidie RO1-NS065895 en NIH-NINDS-subsidie 5-F31-NS076250-02.

We danken de JHU SOM-microscoopfaciliteit voor het gebruik van de cryostaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% Paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossingElectron Microscopy Sciences19202Voor hier beschreven procedures werd 4% oplossing vers bereid uit poeder. Paraformaldehyde van elke leverancier mag worden gebruikt. Bereide formaldehyde-oplossing moet worden bewaard bij 4 °C en mag niet worden gebruikt na de vervaldatum (tot enkele maanden). Paraformaldehyde is een carcinogeen en een toxine bij inademing en huidcontact. Volg de in het MSDS gespecificeerde voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van paraformaldehyde.
SucroseSigmaS0389Gebruikt voor het cryobeschermen van weefsel voor het invriezen. Sucrose van elke leverancier mag worden gebruikt.
O.C.T. compoundTissue-Tek4583Inbeddingsmedium voor cryosectio.
CryostatLeicaCM 3050SEen Leica CM3050S cryostat werd gebruikt voor de hier beschreven preparaten. Elke cryostat die in staat is om secties van 10 µm te snijden, mag worden gebruikt.
Glazen plaatjes, 25 x 75 x 1 mmFisher12-552-3Plaatjes van elke leverancier mogen worden gebruikt.
GelatineSigmaG-9391Gelatine wordt gebruikt om de adhesie van weefselsecties op glazen plaatjes te bevorderen. Om glazen plaatjes met gelatine te coaten, lost u 2,75 g gelatine en 0,275 g chroomaluin op in 500 ml gedistilleerd water, verwarmt tot 60 °C, doopt de plaatjes enkele seconden en laat drogen. Gelatine van elke leverancier mag worden gebruikt. Als alternatief kunnen gelatine-voorgecoate plaatjes worden gekocht.
Chroom(III) kaliumsulfaat dodecahydraat (chroomaluin)Sigma243361Chroomaluin wordt toegevoegd aan gelatine-oplossing om de weefsel adhesie op glazen plaatjes te bevorderen. Het is een mogelijk carcinogeen en een toxine bij inademing en huidcontact. Volg de in het MSDS gespecificeerde voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van chroomaluin.
Vectabond weefsel adhesie reagensVector LabsSP-1800Optioneel substraat voor betere weefsel adhesie op glazen plaatjes; gelatine-gecoate plaatjes kunnen ook worden gebruikt.
Tween20SigmaP9416Een detergent gebruikt om weefsel permeabel te maken. Tween20 van elke leverancier mag worden gebruikt.
Triton X100SigmaT8787Een detergent gebruikt om weefsel permeabel te maken. Triton X100 van elke leverancier mag worden gebruikt.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptose detectiekitTrevigen4812-30-KCommerciële kit voor fluorescens-gebaseerde TUNEL-labeling.
DNase/nucleaseTrevigen4812-30-K(meegeleverd met kit)
DNase/nuclease bufferTrevigen4812-30-K(meegeleverd met kit)
10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4Amresco780Maak 1x PBS voor wasbeurten en verdunning. PBS van elke leverancier mag worden gebruikt.
DNase-vrij waterQuality Biologicals351-029-131Water van elke leverancier mag worden gebruikt.
Hoechst 33258Sigma94403Kernkleur. Elke blauwe fluorescente nucleaire kleurstof mag worden gebruikt. Als DNA-bindende kleurstof is Hoechst een vermoedelijke carcinogeen en moet met beschermende uitrusting worden gehanteerd om huidcontact te minimaliseren.
Parafilm Mmeerdere807Elke andere hydrofobe film of dekglas mag worden gebruikt. Beschikbaar bij meerdere leveranciers.
Fluorescentiemicroscoop met digitale camera -- --Elke fluorescentiemicroscoop die in staat is om rood, groen en blauw fluorescens in afzonderlijke kanalen digitaal vast te leggen, mag worden gebruikt.
Vectashield antifade mediaVector LabsH-1000Antifade media van elke leverancier mag worden gebruikt.
glasdekglazen, dikte No.1Brain Research Labs2222-1Dekglazen van elke leverancier mogen worden gebruikt. De kleinste maat van 22 x 22 mm is voldoende voor neonatale muisbeensecties.
NailpolishTed Pella114-8Gebruikt om dekglazen af te sluiten. Nagellak van elke leverancier (inclusief reguliere retailers) mag worden gebruikt. Vermijd het gebruik van nagellak met kleur of additieven die licht kunnen reflecteren tijdens fluorescentiebeeldvorming.

Referenties

  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83(2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van DNA schadeweefselverwerkingfluorescentielabelingsignaalkwantificeringaftrek van autofluorescentiedetectie van apoptoseanalyse van celdoodin situ analyse

Gerelateerde artikelen