Deze video beschrijft dissectie, weefselverwerking, sectioenering en op fluorescentie gebaseerde TUNEL-labeling van muis skeletspier. Het beschrijft ook een methode voor semi-geautomatiseerde analyse van TUNEL-labeling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle In Situ Met behulp van de TUNEL Methode
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridinetrifosfaat (dUTP) nick-end labeling (TUNEL) is de methode om het TdT-enzym te gebruiken om covalent een gemerkte vorm van dUTP te hechten aan 3’-uiteinden van dubbel- en enkelstrengs DNA-breuken in cellen. Het is een betrouwbare en nuttige methode om DNA-schade en celdood in situ te detecteren. Deze video beschrijft dissectie, weefselverwerking, sectiëring en op fluorescentie gebaseerde TUNEL-labeling van muisskeletspier. Het beschrijft ook een methode voor semi-automatische TUNEL-signaalkwantificering. Inherente normale weefselkenmerken en weefselverwerkingscondities beïnvloeden de mogelijkheid van het TdT-enzym om DNA efficiënt te labelen. Weefselverwerking kan ook ongewenste autofluorescentie toevoegen die de detectie van TUNEL-signalen zal verstoren. Daarom is het belangrijk om empirisch weefselverwerkings- en TUNEL-labelingmethoden te bepalen die het optimale signaal-ruisverhouding zullen opleveren voor daaropvolgende kwantificering. De hier beschreven fluorescentiegebaseerde assay biedt een manier om autofluorescente signalen uit te sluiten door digitale kanaalsubtraksie. De TUNEL-assay, gebruikt met geschikte weefselverwerkingstechnieken en controles, is een relatief snelle, reproduceerbare, kwantitatieve methode voor het detecteren van apoptose in weefsel. Het kan worden gebruikt om DNA-schade en apoptose te bevestigen als pathologische mechanismen, om aangetaste celtypen te identificeren en om de werkzaamheid van therapeutische behandelingen in vivo te beoordelen.
Inleiding
Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) dUTP nick end labeling (TUNEL) is het proces van het gebruik van de TdT enzym om dUTP tot 3 hechten 'einden van de dubbele en enkelstrengs DNA breekt 12,23. De TUNEL methode voor de detectie van apoptose en DNA schade werd voor het eerst 20 jaar geleden door Gavrieli et al. 1,12,24. Het is sindsdien geëvalueerd en geoptimaliseerd in verschillende weefselpreparaten 7,23,27,40. TUNEL is gebruikt om ischemie geïnduceerde celdood van neuronen 6,14,29 en 43,44 cardiomyocyten, excitotoxische neuronale celdood 30,31 bestuderen, en als biomarker in artrit....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle dierlijke procedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health 26 uitgevoerd. Het protocol (MO13M391) werd goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite.
1. Neonatale Mouse Sacrifice, Dissection en Fixatie
- Offeren een neonatale muis door CO 2 inademing.
- Onmiddellijk afgesneden van de achterbeen boven de knie. Tot ongeveer postnatale dag 7, de botten zijn zacht genoeg om door te snijden met een groot labo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met succesvolle kleuring, moet TUNEL-positief signaal helder genoeg om te isoleren van autofluorescentie door het instellen van de intensiteit drempels zijn. TUNEL-positieve objecten bij een lage vergroting kan verschijnen als lichte onregelmatige fragmenten in de skeletspier (Figuur 1A). Bij hogere vergroting, sommige TUNEL-positieve objecten met klassieke apoptotische morfologie worden waargenomen als het type celdood betrokken is apoptose (Figuur 1B). De positieve controle (DNase toe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een methode voor het opsporen en kwantitatief analyseren van DNA-schade die apoptose in muis skeletspieren wordt beschreven. De procedure omvat weefsel oogsten, TUNEL kleuring, digitaal beeld acquisitie, en beeldanalyse. Gemeenschappelijke histologische leveringen en gereedschappen nodig, en een bijzondere economische TUNEL kit noodzakelijk. De essentiële grote apparatuur items die nodig zijn een cryostaat, epifluorescerende microscoop met digitaal beeld vermogen, en een computer systeem voor beeldanalyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH-NINDS-subsidie RO1-NS065895 en NIH-NINDS-subsidie 5-F31-NS076250-02.
We danken de JHU SOM-microscoopfaciliteit voor het gebruik van de cryostaat.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing | Electron Microscopy Sciences | 19202 | Voor hier beschreven procedures werd 4% oplossing vers bereid uit poeder. Paraformaldehyde van elke leverancier mag worden gebruikt. Bereide formaldehyde-oplossing moet worden bewaard bij 4 °C en mag niet worden gebruikt na de vervaldatum (tot enkele maanden). Paraformaldehyde is een carcinogeen en een toxine bij inademing en huidcontact. Volg de in het MSDS gespecificeerde voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Gebruikt voor het cryobeschermen van weefsel voor het invriezen. Sucrose van elke leverancier mag worden gebruikt. |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | Inbeddingsmedium voor cryosectio. |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | Een Leica CM3050S cryostat werd gebruikt voor de hier beschreven preparaten. Elke cryostat die in staat is om secties van 10 µm te snijden, mag worden gebruikt. |
| Glazen plaatjes, 25 x 75 x 1 mm | Fisher | 12-552-3 | Plaatjes van elke leverancier mogen worden gebruikt. |
| Gelatine | Sigma | G-9391 | Gelatine wordt gebruikt om de adhesie van weefselsecties op glazen plaatjes te bevorderen. Om glazen plaatjes met gelatine te coaten, lost u 2,75 g gelatine en 0,275 g chroomaluin op in 500 ml gedistilleerd water, verwarmt tot 60 °C, doopt de plaatjes enkele seconden en laat drogen. Gelatine van elke leverancier mag worden gebruikt. Als alternatief kunnen gelatine-voorgecoate plaatjes worden gekocht. |
| Chroom(III) kaliumsulfaat dodecahydraat (chroomaluin) | Sigma | 243361 | Chroomaluin wordt toegevoegd aan gelatine-oplossing om de weefsel adhesie op glazen plaatjes te bevorderen. Het is een mogelijk carcinogeen en een toxine bij inademing en huidcontact. Volg de in het MSDS gespecificeerde voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van chroomaluin. |
| Vectabond weefsel adhesie reagens | Vector Labs | SP-1800 | Optioneel substraat voor betere weefsel adhesie op glazen plaatjes; gelatine-gecoate plaatjes kunnen ook worden gebruikt. |
| Tween20 | Sigma | P9416 | Een detergent gebruikt om weefsel permeabel te maken. Tween20 van elke leverancier mag worden gebruikt. |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | Een detergent gebruikt om weefsel permeabel te maken. Triton X100 van elke leverancier mag worden gebruikt. |
| TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptose detectiekit | Trevigen | 4812-30-K | Commerciële kit voor fluorescens-gebaseerde TUNEL-labeling. |
| DNase/nuclease | Trevigen | 4812-30-K | (meegeleverd met kit) |
| DNase/nuclease buffer | Trevigen | 4812-30-K | (meegeleverd met kit) |
| 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4 | Amresco | 780 | Maak 1x PBS voor wasbeurten en verdunning. PBS van elke leverancier mag worden gebruikt. |
| DNase-vrij water | Quality Biologicals | 351-029-131 | Water van elke leverancier mag worden gebruikt. |
| Hoechst 33258 | Sigma | 94403 | Kernkleur. Elke blauwe fluorescente nucleaire kleurstof mag worden gebruikt. Als DNA-bindende kleurstof is Hoechst een vermoedelijke carcinogeen en moet met beschermende uitrusting worden gehanteerd om huidcontact te minimaliseren. |
| Parafilm M | meerdere | 807 | Elke andere hydrofobe film of dekglas mag worden gebruikt. Beschikbaar bij meerdere leveranciers. |
| Fluorescentiemicroscoop met digitale camera | -- | -- | Elke fluorescentiemicroscoop die in staat is om rood, groen en blauw fluorescens in afzonderlijke kanalen digitaal vast te leggen, mag worden gebruikt. |
| Vectashield antifade media | Vector Labs | H-1000 | Antifade media van elke leverancier mag worden gebruikt. |
| glasdekglazen, dikte No.1 | Brain Research Labs | 2222-1 | Dekglazen van elke leverancier mogen worden gebruikt. De kleinste maat van 22 x 22 mm is voldoende voor neonatale muisbeensecties. |
| Nailpolish | Ted Pella | 114-8 | Gebruikt om dekglazen af te sluiten. Nagellak van elke leverancier (inclusief reguliere retailers) mag worden gebruikt. Vermijd het gebruik van nagellak met kleur of additieven die licht kunnen reflecteren tijdens fluorescentiebeeldvorming. |
Referenties
- Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
- Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
