Beoordeling van de levensvatbaarheid van menselijk vet Injectie in Naakt Muizen met Micro-Computed Tomography

Samenvatting

Vettransplantatie is een essentiële techniek voor het reconstrueren van tekorten in zacht weefsel. Het blijft echter een onvoorspelbare procedure, gekenmerkt door variabele overleving van het transplantaat. Ons doel was om een muismodel te ontwikkelen dat een nieuwe beeldvormingsmethode gebruikt om volumeretentie te vergelijken tussen verschillende technieken van vettransplantaatvoorbereiding en -toediening.

Samenvatting

Lipotransfer een essentieel instrument in armamentarium de chirurg voor de behandeling van stoornissen zachte weefsel van het hele lichaam. Vet is het ideale zacht weefsel vulstof is gemakkelijk beschikbaar, gemakkelijk te verkrijgen, goedkoop en inherent biocompatibel. ¹ Ondanks de groeiende populariteit, wordt vet enten gehinderd door onvoorspelbare resultaten en variabele transplantaatoverleving, met gepubliceerde retentie ergens van 10 -80%. ^1-3

Onderzoeken op vet enten vergemakkelijken, hebben we daarom ontwikkelde een diermodel dat maakt real-time analyse van geïnjecteerde vet retentie volume. In het kort wordt een kleine snede gemaakt in de hoofdhuid van een CD-1 naakt muis en 200-400 pl verwerkte lipoaspirate wordt op de schedel geplaatst. De hoofdhuid wordt gekozen als de ontvanger plaats vanwege de afwezigheid van natief onderhuids vet, en vanwege de uitstekende achtergrond contrast door het calvarium, die helpthet analyseproces. Micro-computertomografie (micro-CT) wordt gebruikt om het transplantaat bij basislijn en elke twee weken daarna gescand. De CT-beelden worden gereconstrueerd, en een beeldverwerkingsprogramma wordt gebruikt om transplantaat volumes kwantificeren.

Traditioneel technieken om vet transplantaat volume beoordelen noodzakelijk hebben euthanizing de studie dier om slechts een enkele beoordeling van de graft gewicht en volume te bieden door fysieke meting ex vivo. Biochemische en histologische vergelijkingen die hebben ook vereist de studie dier te worden gedood. Deze beschreven beeldvormingstechniek biedt het voordeel visualiseren en kwantificeren objectief volume op verschillende tijdstippen na de eerste enting zonder de studie dier offeren. De techniek wordt beperkt door de grootte van het implantaat kan worden geïnjecteerd als grotere enten risico huid en vet necrose. Deze methode heeft een hulpprogramma voor alle studies die vet levensvatbaarheid graft en retentie volume. Het is bijzonder goed geschikt om'S DIEng een visuele weergave van vet transplantaten en volgende volumeveranderingen tijd.

Inleiding

Weefseldefecten in zachte weefsels ontstaan door verschillende oorzaken, waaronder trauma, tumorresectie, veroudering en aangeboren afwijkingen. Ze kunnen invaliderend zijn voor patiënten en vertegenwoordigen een van de meest voorkomende, maar uitdagende problemen voor reconstructieve chirurgen. Er bestaan veel methoden om weefseltegoeden in zachte weefsels aan te pakken, zoals lokale en vrije flappen, collageeninjecties en synthetische fillers.^4-8 Sinds het eerst gedocumenteerde gebruik door Neuber in 1893¹ is echter autoloog vettransplantatie de gulden standaard gebleven voor het herstellen van deficiënties in zachte weefsels, omdat het direct beschikbaar is, gemakkelijk en veilig te verzamelen is en natuurlijk compatibel is.^1,2

Ondanks deze voordelen lijden autologe vettransplantaties aan onvoorspelbare en variabele overleving, met retentiepercentages die variëren van 10-80% in de loop van de tijd.^1-3,9 Om rekening te houden met dit verwachte verlies van volume en symmetrie, moeten chirurgen vaak overcorrigeren bij het vullen van weefseltegoeden in zachte weefsels, of meerdere follow-up procedures uitvoeren.

Slecht gevasculariseerde graftbedden zijn deels verantwoordelijk voor deze weefselreabsorptie. Bovendien kan het ontbreken van een benchmarkanalysemethode om de overleving van grafts te vergelijken ook bijdragen aan de inconsistentie in gerapporteerde resultaten. Een nauwkeurige methode voor het meten van het graftvolume zou de meetfout bij het evalueren van retentiepercentages verminderen. Dit zou op zijn beurt onderzoekers helpen de oorzakelijke factoren die de graftoverleving beïnvloeden nauwkeuriger te identificeren. Hoewel veel laboratoriumdierenmodellen zowel kwantitatieve als kwalitatieve beoordeling van de overleving van menselijke vettransplantaties hebben vergemakkelijkt, zijn de meeste gebaseerd op histologische en biochemische middelen en vereisen het opofferen van het onderzoeksdier om een enkele meting te verkrijgen.^3,10-12 Er is weinig gemeld over het gebruik van beeldvormingstechnieken om het retentiepercentage van vettransplantaties in vivo te bepalen.

Een aantal klinische onderzoeken hebben effectievere meettechnieken met beeldvorming aangetoond. Magnetische Resonantie Beeldvorming (MRI) werd gebruikt door Hörl et al. om de overleving van vettransplantaties te meten¹³, en CT werd gebruikt door Har-Shai et al. en Fontdevila et al. in hun analyses van volumeretentie na transplantatie bij patiënten die leden aan HIV.^14,15 Met behulp van driedimensionale (3D) beeldvormingssoftware meetten Meier et al. de volumeretentie bij mensen na autologe vettransplantatie door afbeeldingen uit de pre- en postoperatieve periode te vergelijken.¹⁶

Toch ontbreekt een gestandaardiseerde methode die beeldvorming gebruikt om de overleving van vettransplantaties te meten in fundamenteel wetenschappelijk onderzoek. Een benadering van hoge resolutie beeldvorming voor het beoordelen van de volumes van vettransplantaties zou niet alleen nauwkeurige en reproduceerbare volumemetingen mogelijk maken, maar ook herhaalde metingen om de evolutie van de overleving van vettransplantaties in real time te visualiseren.

Protocol

OPMERKING: Experimentele protocollen en toestemming van de patiënt vormen voor het verkrijgen van vet werden beoordeeld en door de Stanford University Institutional Review Board (Protocol # 2188) goedgekeurd. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Stanford administratieve Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) onder Protocol # 9999. Alle experimenten werden uitgevoerd met een strikte naleving van de veiligheid dierlijke en humane richtlijnen zorg.

1. Vet Oogsten

1. De Coleman procedure ^17-19 verkrijgen humaan vetweefsel van de buik, flank, en / of dij gebieden van gezonde vrouwelijke patiënten die een electieve liposuctie.
2. Om de lipoaspirate voor enting te verwerken, te beginnen doordat het vet te regelen voor 30 min.
3. Lipoaspirate regelt typisch in drie lagen, olie bovenaan vet in het midden, en bloed onderaan. Zuig en gooi de bovenste olielaag en de onderste bloed te laag.
4. Om verder te verwijderen eventuele resterende tumescent vloeistof of celresten, centrifugeer het vet gedurende 5 min bij 350 xg en 4 ° C, en zuig de onderste waterlaag.
5. Bereken de hoeveelheid vet nodig voor enten, waardoor 20% leveringsfout, en breng de gewenste hoeveelheid vet 50 ml conische (s). Vermenigvuldig 400 door het aantal muizen in de studie microliter vet nodig voor enten verkrijgen.
6. Op dit punt, als het uitvoeren van de Cel Assisted Lipotransfer ^20,21, plaats volume van vet voor het enten op ijs. Dan oogst-adipose afgeleide stromale cellen (ASC) van het achtergebleven vet met de standaardtechniek beschreven door Zuk et al ^22.

2. Vet enten

1. Verkrijgen vrouwelijke, homozygote CD-1 naakt muizen voor de experimentele studie. Kies muizen tussen 8-12 weken.
2. Anesthesie, plaats de muis te induceren in een knock-down doos met 2,5% isofluraan / zuurstof mengsel bij 2 L / min gedurende ongeveer 10 min. Houdt u er rekening mee dat de aanbevolen ISOFlurane dosis varieert met de muis stam.
3. Wanneer de ademfrequentie van de muis is vertraagd, bevestigen voldoende sedatie met een teen knijpen. Breng veterinaire smerende oogzalf beide ogen van de muis.
4. Als de muis niet terugdeinzen als reactie op teen knijpen, dit bevestigt een voldoende vlak van anesthesie. Plaats de neus van de muis in een neuskegel leveren van 2,5% isofluraan / zuurstof mengsel bij 1-2 l / min. Als de muis trekt uit teen knijpen, terug naar knock-down doos en hertest na 5 min.
5. Stel steriele veld onder de muis en vervolgens steriliseren hoofdhuid met 2,5% povidon-jood, gevolgd door 70% ethanoloplossing. Herhaal dit nog twee keer.
6. Plaats chirurgische gordijnen over de muis en wees voorzichtig om steriele veld te behouden. Steriele instrumenten, handschoenen, en PBM moet worden gebruikt op alle tijden.
7. Als de hoeveelheid vet te worden geënt was eerder op ijs geplaatst, zodat vet om eerst aan te passen aan RT voor aflevering.
8. Backload een 1 ml luerlockspuit met 1 mlvet.
9. Sluit een 14 G, 8 cm lang vet enten canule aan het einde van de injectiespuit.
10. Prime-systeem door het indrukken van de zuiger tot tussen de 200 en 400 ul van vet in de spuit. Terwijl het indrukken van de zuiger van de spuit te bevestigen dat de canule volledig is gevuld met vet door het observeren van vet de distale canule gat verlaten.
11. Met behulp van fijne tang, til de dorsale huid in de middellijn bovenop de caudale meest aspect van de schedel. Maak een 1,5 mm snijden in de huid met behulp van fijne schaar.
12. Plaats een 6-0 nylon hechtdraad door midden gesneden die later zal worden gebruikt om breng de wondranden tezamen na de transplantatie uitgevoerd. Niet bind de hechtdraad.
13. Een subcutane pocket via schedel door inbrengen van de canule door de huid incisie en langs de canule heen en weer in een waaiervormig patroon over de schedel elke bindweefsel bijlagen aan de overliggende huid bevrijden.
14. Zodra de zak is gemaakt, plaatst u de cAnnula in de middellijn van de muis direct over de schedel tot aan de punt ligt aan de rostrale-meest aspect van de zak die moet net achter een lijn getrokken tussen de ogen. (Figuur 1A)
15. Injecteer langzaam het vet in een retrograde mode, het bevorderen van de plunjer terwijl u de canule terug. Met behulp van een tang, breng de wondranden bij elkaar en verhef hen tot geen vet te houden van lekken uit de zak.
16. Bind de hechtdraad die eerder werd geplaatst, om ervoor te zorgen dat de eerste knoop ligt lichtjes tegen de huid. Bind drie vierkante knopen en snijd de hechtdraad met een 3 mm staart. (Figuur 1B)
17. Bevestig met visualisatie en manuele palpatie dat de zak niet te vol is en de huid bovenop de pocket is niet gespannen. Als de zak is te vol, snijd de hechtdraad en verwijder alle vet van binnen de zak. Was de zak met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 en opnieuw injecteren kleiner volume vet.
18. Verwijder de muis uit eennesthesia en leg ze op haar rug of zij in een schone kooi op zich. Bewaak het dier voor regelmatige ademhaling, normale bewegingen, afwezigheid van bloeden, en tekenen van pijn of ongemak. Dien buprenorfine 0,1 mg / kg subcutaan elke 6 uur gedurende maximaal 48 uur indien het dier pijn.
19. Zorg ervoor dat het dier voldoende is wakker geworden om borstligging onderhouden voordat u deze achterlaat. Plaats geen dier in een kooi met andere dieren totdat deze volledig is hersteld.
20. Na 4 uur, ervoor te zorgen dat het dier in staat is om te eten en te drinken, bewegen en normaal te ademen en dat er geen bloeden uit de operatieve plaats. Breng het terug naar het dier zorginstelling.

3. Micro-CT

1. Scan muizen voor baseline volume per post-operatieve dag 3, en herhaal scans bij postoperatieve Weken 2, 4, 6 en 8.
2. Wanneer de beeldvorming van de muizen op elk tijdstip, volgen pre- en post-procedurele sedatie en verzorging van dieren richtlijnen zoals eerder beschreven in STEPs 2,2-2,4 en 2,17-2,19.
3. Voer scans op een micro-CT-scanner met een reconstructie voxel van 100 pm of beter.
4. Met een piek X-ray kilovoltage van 80 kVp en een anode stroom van 450 uA, beheren een rantsoen dosis van ongeveer 5 centiGy tijdens een 9 min scan om elke muis. Let op: deze waarden variëren afhankelijk van de scanprotocol.
5. Voorafgaand aan het uitvoeren van de eerste scan, kalibreren micro-CT met een imaging fantoom dat onderscheid maakt tussen lucht, water, en bot intensiteit.
6. Plaats vier muizen in de scanner in het ventrale positie met twee muizen aan de bovenkant en twee aan de onderzijde. Een scanning bed kan gemakkelijk worden geconstrueerd met 60 ml spuiten om de muis lichaam en 10 ml spuiten als neuskegels houden. ²³
7. Onderhouden muizen onder narcose met een 2,5% isofluraan / zuurstof mengsel bij 1-2 L per min.
8. Bevestig afbeelding scout met dat de hele schedel van de muis, van neus tot de eerste halswervel, en vanaf de top van de schedel naar de basis van skull, zullen worden afgebeeld.

4. Micro-CT Analyse

1. Open de gereconstrueerde beelden met een micro-CT-beeldvorming analyse software dat de oprichting van de Regio's of Interest maakt (ROI's) door het selecteren van voxels met behulp van drempels voor pixel intensiteit. Software maakt het ook mogelijk maken van 3D-oppervlakken door de interpolatie van geselecteerde voxels, en voor volume analyse.
2. Begin met het laden van de gereconstrueerde CT-beelden in tweedimensionale (2D) coronale, axiale en sagittale uitzicht. (Figuur 2A)
3. De axiale plak als gids, ga naar de sagittale segment dat overeenkomt met de meest linkse aspect van het vet transplantaat. Selecteer een boven- en ondergrens voor pixel intensiteit alle voxels die overeenkomt met het vet transplantaat vangt, maar sluit het omringende weefsel en bot. (Figuur 2B)
4. Definieer een ROI in het sagittaal beeld dat overeenkomt met het vet transplantaat basis van voorafgaande pixel intensiteit drempels. Repeat, herhaal deze procedure iedere vijfde sagittale slice navigeren tot de meest rechtse aspect van het implantaat is bereikt. (Figuur 2C)
5. Interpoleren gekozen voxels van alle 2D ROI's in een enkel, gecombineerd 3D ROI. (Figuur 2D)
6. Neem ROI volume berekend door de software.
7. Render de 3D isosurface naar de finale vet transplantaat volume te visualiseren. (Figuur 2E)
8. In de daaropvolgende analyses, moet u de maximale pixelintensiteit en minimale drempelwaarden dezelfde als die gebruikt worden voor de baseline-analyse te houden.

5. Vet Harvest

1. Na muizen zijn gescand voor de week 8 ^24,25 tijdstip, verdoven de muizen zoals eerder hierboven in de stappen 2,2-2,4 en 2,17-2,19 beschreven.
2. Volgende APLAC richtlijnen, euthanaseren de muizen door het scheiden van hun wervelkolom.
3. Plaats de muis in operatiegebied. Met behulp van tenotomie schaar, open voorzichtig de zak en ontleden thij bovenliggende huid en bindweefsel bijlagen uit het vet transplantaat.
4. Op dit punt, kan het helpen om een ​​patch van de bovenliggende dorsale huid te snijden om te helpen bij extractie van het transplantaat. (Figuur 3A)
5. Licht te houden tractie op het transplantaat met een tang en draai graft van links naar rechts om opeenvolgende punten van de spanning die moeten worden vrijgegeven met een schaar te visualiseren.
6. Blijf zo dicht bij het transplantaat mogelijk bij het uitsnijden van het bindweefsel genomen met het transplantaat te beperken. (Figuur 3B)
7. Na het uitsnijden van transplantaat, te meten massa op een getarreerde schaal die nauwkeurig tot op ten minste 0,01 gram is.
8. Bereken het volume van het vet transplantaat met de gemeten massa en de gemiddelde dichtheid van menselijk vet (0,9 g / ml) als een succespercentage.
9. Vergelijk berekende hoeveelheid vet graft met die verkregen met behulp van micro-CT.
10. Vet transplantaten kunnen worden verwerkt voor histologie en verdere analyse indien nodig.

Resultaten

Vet grafts geleidelijk kleiner in volume over de studie, resulterend in 62,2% gemiddelde overlevingstijd in week 8 (figuur 4A) ²⁴ Na afloop van de Week 8 scan werd elk vet transplantaat geëxtraheerd uit één stuk. Een Wilcoxan rank sum test werd gebruikt om het verschil tussen volumemetingen vet transplantaten verkregen met elk micro-CT of berekend uit fysieke massa vergelijken. Er werd geen significant verschil gevonden tussen deze twee methoden (tweezijdige p-waarde = 0,9362).

Discussie

Tot nu toe zijn de meeste onderzoekers zich op niet-beeldvormende modaliteiten om de lange-termijn overleving van vet enten te kwantificeren, maar deze methoden vereisen het offer van de studie van dieren en de opbrengst slechts een enkele meting. ^3,10-12 Onze studie vertegenwoordigt een verbeterde analysemethode die doelstelling, real-time kwantificering van vet transplantaat overleving maakt in een muismodel.

Kritische in dit proces zorgen dat voldoende immuungecompromitteerde m...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SAL lipoaspirate
Centrifuge	Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA
50 ml conische buisjes	BD Biosciences, San Jose, CA
CD-1 nude muizen (Crl:CD1-Foxn1nu)	Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA
Isofluraan	Henry Schein, Dublin, OH
2,5% Betadine	Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT
70% ethanoloplossing	Gold Shield, Hayward, CA
1cc luer-lock spuit	BD Biosciences, San Jose, CA
14 gauge canule	Shippert Medical, Centennial, CO
Pincet	Fine Science Tools, Heidelberg, Duitsland
Tenotomie schaar	Fine Science Tools, Heidelberg, Duitsland
6-0 nylon hechtdraad	Ethicon, Blue Ash, OH
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Gibco, Carlsbad, CA
micro-CT scanner	Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Phantom	TriFoil Imaging, Northridge, CA
Beeldanalysesoftware	IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Weegschaal	Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH