Do's en Don'ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Samenvatting

Cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) omvat het snel invriezen van een dunne laag monster op een drager, en vervolgens het visualiseren van het monster in zijn bevroren gehydrateerde toestand door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Dit kan worden bereikt met een zeer lage hoeveelheid eiwit en in de buffer naar keuze, zonder het gebruik van enige kleurstof, wat zeer nuttig is om structuur-functiecorrelaties van macromoleculen te bepalen. Wanneer gecombineerd met beeldverwerking van enkele deeltjes, heeft de techniek een brede toepassing gevonden voor 3D-structurele bepaling van gezuiverde macromoleculen.

Het hier gepresente protocol legt uit hoe cryoEM moet worden uitgevoerd en onderzoekt de oorzaken van de meest voorkomende problemen voor rationeel probleemoplossen; het volgen van al deze stappen zou moeten leiden tot de verwerving van hoogwaardige cryoEM-beelden. De techniek vereist toegang tot het elektronenmicroscoop-instrument en een vitrificatie-apparaat. Kennis van de 3D-reconstructieconcepten en software is ook nodig voor gecomputeriseerde beeldverwerking. Belangrijk is dat hoge kwaliteit resultaten afhankelijk zijn van het vinden van de juiste zuiveringscondities die leiden tot een uniforme populatie van structureel intacte macromoleculen.

Het vermogen van cryoEM om macromoleculen te visualiseren, gecombineerd met de veelzijdigheid van beeldverwerking van enkele deeltjes, heeft zich zeer succesvol bewezen voor structurele bepaling van grote eiwitten en macromoleculaire machines in hun bijna-natuurlijke toestand, identificatie van hun meerdere componenten door 3D-verschilkartering en het creëren van pseudo-atomaire structuren door docking van röntgenstructuren. De onophoudelijke ontwikkeling van cryoEM-instrumentatie en beeldverwerkingstechnieken gedurende de afgelopen 30 jaar heeft geresulteerd in de mogelijkheid om de novo 3D-reconstructies op atomair resolutieniveau te genereren.

Inleiding

Het doel van cryoEM is om elektronen microscopische beelden van macromoleculen te verkrijgen in hun moedertaal gehydrateerde toestand. Op grond van het inbedden van het macromolecuul in verglaasde water, kan een bevroren gehydrateerde monster rechtstreeks worden ingevoerd en gevisualiseerd in de TEM-instrument. Verglazing, bereikt door flits bevriezen (10.000 ^o C / sec), bevriest het monster zonder water kristallisatie en zorgt ervoor dat de moleculaire herschikkingen tijdens bevriezing te verwaarlozen is. De overmaat elektron verstrooiing van het monster ten opzichte van de omringende buffer heeft een kleine maar voldoende contrast om het macromolecuul te zien in afwezigheid van vlek ^1. Geautomatiseerde beeldverwerking kan vervolgens worden gebruikt om het macromolecuul 3D structuur opnieuw. Grote macromoleculen in de ~ 500 kDa- meerdere MDa gamma zijn ideaal monsters voor cryoEM (goed voor meer dan 80% van de Electron Microscopy Data Bank (EMDB) inschrijvingen); Deze omvatten eiwitten, eiwitcomplexen, eiwit-nucleïnezuur complexes en membraaneiwitten ingebed in een bilaag. Deze macromoleculen zijn minder waarschijnlijk te kristalliseren (minder dan 2% instroom in het VOB database) Dit is echter wel zo dat kleinere stukken opgelost door x-ray kristallografie of NMR worden gedokt in de 3D omhulling door cryoEM. Anderzijds, enkele grootste structuren opgelost cryoEM identificeerbaar zijn binnen het volledige cel door dunne-sectie TEM ^2. Zo cryoEM effectief overbrugt de grootte en resolutie kloof tussen subcellulaire en atomaire structuren.

CryoEM weerspiegelt beter natieve structuur het macromolecuul is dan de meer klassieke methode van negatieve kleuring (NS), waarbij het ​​macromolecuul is uitgedroogd en omgeven door een laag van heavy metal vlek waarbij een sterk contrast 'negatieve' imago ³ de regio vlek uitsluiting creëert. In beide gevallen levert de elektronenbundel 2D projectiebeelden van de macromoleculen, genaamd deeltjes, waarbij de sHAPE afhankelijk van de oriëntatie van het macromolecuul ten opzichte van de elektronenbundel. Veel deeltjes, tenminste ~ 1000 en zonder bovengrens kan worden geanalyseerd op de computer "deeltje analyse" (SPA) software om de signaal-ruisverhouding (SNR) hoewel middeling vergroten en ruimtelijke oriëntatie parameters van het deeltje vinden die nodig zijn om het macromolecuul's 3D-structuur door terug projectie ^4-7 recreëren. NS, met hogere SNR wordt gebruikt om voorafgaande monster karakterisering en een de novo 3D reconstructie te genereren; zijn resolutie zelden meer dan 20 A, die wordt opgelegd door de uitdroging en de grootte van het zware metaal graan. In het algemeen, voor cryoEM 3D structurele vastberadenheid, een lage resolutie 3D-reconstructie wordt eerst verkregen van NS en dan cryoEM wordt gebruikt voor het verfijnen van deze lage resolutie aanvankelijke plan om verder te studeren het macromolecuul in zijn inheemse gehydrateerde toestand, om de interne structuur te zien, en om de resolutie te verhogen. Geente dat als de NS-model werd vervormd (de meest voorkomende voorbeeld is het afvlakken als gevolg van uitdroging ⁸⁾ en de cryoEM deeltjes hadden lage SNR, daarna de vervorming kon dragen in de cryoEM model (het model-vooringenomenheid artefact, die gebruikelijk is in lage SNR datasets ^9). Structurele vervorming zou resulteren in een mismatch tussen de NS en cryoEM ruwe deeltjes en tussen de ruwe cryoEM deeltjes en bijbehorende projecties van het 3D-model loodrecht op de afvlakking richting. Model vertekening kunnen oplossen door zich als de 3D-model ondergaat opeenvolgende verfijning cycli. Indien deze niet voorkomen, die zou worden gedetecteerd als een gebrek aan overeenstemming tussen ruwe cryoEM deeltjes en corresponderende projecties van het 3D-model, dan een de novo model wordt opgebouwd uit de cryoEM gegevens. Een goede aanpak kan zijn om de hoekige reconstructie algoritme ^10, waarin verscheidene mogelijke 3D-volumes kunnen leveren gebruiken, en gebruik vervolgens de NS 3D-model om de best mogelijke cryoEM model te selecterendie verder worden verfijnd ^11. Een nog betere strategie is om de SNR van de cryoEM dataset te verhogen (zie specifieke paragraaf in de discussie).

De biochemische kwaliteit van het gezuiverde macromolecuul heeft een uiterst invloed op het eindresultaat. Het macromolecuul, gezuiverd uit weefsel of expressie in heterologe systemen moet een hoge graad van zuiverheid hebben en structureel intact. Het moet niet te vormen aggregaten en mag ook niet van elkaar te scheiden. Om een ​​bepaalde conformatie te definiëren, moet de voorbereiding voorwaarden een uniforme conformationele toestand te bevorderen. Om complexen studie, het optimaal dat de _Kd in het nM, anders fixeermiddelen zijn met succes gebruikt om lagere affiniteit interacties ^12,13 stabiliseren.

Onverwerkte cryoEM beelden opleveren waardevolle informatie over de afmetingen, grote lijnen, aggregatietoestand / multimerisatie-, homogeniteit en interne structuur van de macromolecule. Niettemin is de potentiaal van de techniek enorm verbeterd met beeldverwerking. Een 3D-structuur onthult algemene architectuur van het macromolecuul, 3D plaats van liganden en subeenheden, conformationele veranderingen, en maakt docking van atoomstructuren bepaald door x-ray kristallografie of NMR. De hoeveelheid gegevens van een 3D reconstructie toe stapsgewijs als de resolutie verhoogd: algemeen 15-20 resolutie is eenduidige docking atomaire structuren op 9-10 Å alfa-helices zichtbaar staafjes, 5 A is het mogelijk te onderscheiden beta sheets en een resolutie van 3,5 A en beter is het mogelijk om een atomaire model ¹⁴ bouwen.

De mogelijkheid om informatieve afbeeldingen en een 3D reconstructie met SPA van betrekkelijk kleine hoeveelheden van het monster te cryoEM een aantrekkelijke techniek te verkrijgen, zoals 3-5 ul van ten minste 0,05 mg / ml is voldoende om een ​​TEM rooster bereiden. De minimale instrumentale eisenvoor cryoEM zijn een zelfgemaakte of commerciële cryo-zuiger, een elektronenmicroscoop met ultra hoog vacuüm, beeldopname media en een lage dosis kit, een cryo-houder met haar gemaal, een gloedlossing apparaat, en een verdamper. Niet-essentiële maar verder gewenst functies op de TEM zijn CCD-camera (aanwezig in alle moderne TEM) of een directe elektron detector, veldemissie pistool (FEG), energie filtering en high throughput dataverzameling software. Deze software in principe maakt het verzamelen tienduizenden deeltjes in één cryoEM zitting ^15, maar het verhoogde opslagbehoeften en daarop toezicht nabewerking tijd moeten in aanmerking worden genomen. FEG gecombineerd met contrast transfer functie (CTF) correctie ten grondslag ligt aan de meeste 3D-reconstructies die resolutie voldoende om alfahelices visualiseren bereikt. Op dat moment, het niveau van de resolutie is ook sample-afhankelijk: het bereiken van 10 Å resolutie is minder vaak voor membraaneiwitten terwijl alshoge orde van symmetrie aanwezig is dan atomaire resolutie is meer haalbaar. De recente ontwikkeling van elektronenbundel detectoren atomaire resolutie ingeschakeld zelfs voor macromoleculen met lage (4x) of geen symmetrie, waarbij de kwaliteit van de cryoEM elektronendichtheid kaarten past de afgeleide van x-ray diffractie data ^16,17.

Praktische voorbeelden ter illustratie van de mogelijkheden van de techniek worden hier gegeven voor vier belangrijke soorten macromoleculen waar cryoEM heeft een voortdurende chief rol in hun structurele vastberadenheid. (I) Met hun icosahedrale symmetrie die de dataset met 60-voudige en hun grote omvang die trouw en reproduceerbare uitlijning maakt verhoogt, hebben de structuren van verschillende icosahedrale virussen zijn opgelost tot bijna-atomaire resolutie door cryoEM gevolgd door SPA ^18. We tonen een voorbeeld van een klasse van icosahedral virussen, het adeno-geassocieerde virussen (AAV), die bijna atomaire structuren cryoEM en cryoEM / x-ray hybrid methoden bestaan ^​​19,20. (Ii) macromoleculen met helixstructuur zijn microtubules, filamenten en virussen. De herhalende eenheden langs de spiraalvormige as kan worden geanalyseerd door een complexere versie van SPA aangepast aan de spiraalvormige geometrie ^21. In het voorbeeld tonen wij tabakmozaïekvirus (TMV), een RNA virus dat werd opgelost tot atomaire resolutie van cryoEM ^22. (Iii) Large oplosbare eiwitten zijn uitvoerig bestudeerd. Onder deze, macromoleculen vormen symmetrische multimère cilinders vormen een terugkerend architectuur vaak opgelost op subnanometer resolutie ^23,24. Hier laten we beelden van KLH, een ongewervelde zuurstofdrager, waar een hybride moleculair model is ontstaan ​​uit cryoEM / x-ray kristallografie hybride methoden ^25. (Iv) membraan eiwitten zijn een belangrijke klasse van eiwitten; zij vormen ongeveer 1/3 van de eiwitten gecodeerd door het humane genoom maar zijn moeilijk structureel karakteriseren vanwege complexiteit van de transmembrane domein stabilisatie ^26, die minder dan 1,5% van de structuren opgelost door structurele techniek gecombineerd. De rol van cryoEM en 3D wederopbouw na structuurbepaling wordt toegelicht met de ryanodine receptor (RyR), een grote eukaryote intracellulair Ca2 ⁺ kanaal belang spieren en hersenen signalering. De hoogste resolutie cryoEM structuren tot nu toe, met 10 een resolutie, onthullen secundaire structuur ^27.

Protocol

1. Cryo-houder Voorbereiding en onderhoud

OPMERKING: De droge pompstation, bestaande uit een turbo pompstation en een of meer koude fase controllers, wordt vooral gebruikt voor drie doeleinden: a) Het is een veilige plek om de cryo houders te slaan wanneer ze niet worden gebruikt. De juiste manier om de houders opgeslagen is worden achtergelaten in het station onder vacuüm. b) de vorst en vochtigheid opbouw die optreedt wanneer de vloeibare stikstof wordt verwijderd uit het Dewar en de tip van de cryo houder blootgesteld verdampen; Dit wordt bereikt met de warming-up cyclus. c) het zeoliet droogmiddel regenereren, en een hoog vacuüm in de cryoholder dewars bereiken. Dit is nodig om met een constante temperatuur bij het doen cryo elektronenmicroscopie.

1. Warm-up Cycle.
   1. Plaats de cryo houder in een van de pompen poorten van het pompstation. Sluit een van de evacuatie buizen het metaal afzet onder de vacuümklep van de houder. Makendat alle kleppen van het station (V1, V2 en V3) en het cryo houder gesloten.
   2. Zet de koude fase controller en sluit deze aan op de houder door de controle snoer. Zet de stroomschakelaar van de turbo gemaal.
   3. Start de Warm-up cyclus optie in de koude fase controller. Wanneer het vacuüm in de turbo gemaal leest 10 ^-3 Torr of beter, opent de vlinderklep V2, wacht tot het vacuüm stabiliseert, en open vervolgens de vlinderklep V1.
   4. Voer de opwarming cyclus ongeveer 30 minuten totdat de temperatuur van de houder stabiel boven 20 ° C. Sluiten V1, en dan stoppen de cyclus.
2. Zeoliet cyclus. Voer het Zeoliet Cycle Tussen 4 uur en O / N Voor een CryoEM Session, en eenmaal per week als niet in gebruik.
   1. Start de optie zeoliet cyclus en selecteer de benodigde tijd om een goede vacuüm bereiken in het bereik van 1-2 x 10 ^-4 Torr, en dus lange bewaartijd. Wanneer het vacuüm bereikt 10 ^-3Torr, open de dewar evacuatie ventiel, V3. Het gemaal zal dan evacueren de lijn naar de houder; wacht tot het vacuüm stabiliseert.
   2. Open de klep op de cryo houder. Wanneer de cyclus is voltooid, sluit de kleppen in de omgekeerde volgorde waarin zij werden geopend: de klep op de houder, dan V3, V2, en tenslotte V1. Schakel de turbo gemaal en de koude fase controller, en koppel de cryo houder van de koude fase controller en de turbo pompstation.

2. Grid Voorbereiding

1. Schoonmaken.
   OPMERKING: Bij gebruik van commerciële essen grids, wordt aanbevolen om ze schoon vóór gebruik, om eventuele resterende polymeer dat werd gebruikt in het fabricageproces verwijderen. Doe dit in een glazen petrischaal met 5 lagen filterpapier gelegd onderaan.
   1. Plaats de roosters op het filter papier met de essen carbon zijde naar boven.
   2. Met behulp van een glas Pasteur pipet, nat het papier met enkele druppels of chloroform rond de roosters tot ze net beginnen zweven.
   3. Dek de petrischaal met het deksel een beetje open in een zuurkast O / N.
2. OPMERKING: de dunne koolstofdrager (stappen 2.2-2.3) kan worden weggelaten als de ijslaag direct worden gevormd in de kleine openingen in de holey carbon rooster.
   1. Met een pincet, splitsen een stuk mica twee nieuwe oppervlakken bloot. Plaats de nieuwe blootgestelde oppervlakken van mica face-up op een wit stuk papier in een petrischaal.
   2. Plaats de petrischaal in de stolp van een carbon verdamper. Start de pomp omlaag volgorde totdat vacuüm is dan 2 x 10 ^-6 Torr. Om verontreinigingen op het oppervlak van de koolstof staaf verdampen, het uitvoeren van een pre-verdamping met petrischaal bedekt. Lucht dan de stolp en verwijder het deksel van de petrischaal.
   3. Voer de pomp beneden volgorde, totdat het vacuüm onder 10 ^-6 Torr en vacht van de mica met een dunne laag (~ 5 nm) van koolstof. Gebruik oogbescherming tijdens koolstofverdamping. Controleer de dikte van de koolstof film van de resulterende donker op het papier, die overeenkomstig de mica lakens geplaatst.
3. Breng de Dunne Carbon aan de TEM-Grid.
   1. Snijd een 0,5 x 1 cm stuk gecoat mica en drijven de koolstof uit op het platte vlak van gefilterd, gedeïoniseerd water. Gebruik optische lens papier om een ​​vlakke wateroppervlak te krijgen. Met behulp van de pincet, zet de essen carbon kant van het net in contact met het bovenste oppervlak van het drijvende koolstof laag en pak het op.
   2. Herhaal stap 2.3.1 en 2.3.2, totdat een voldoende aantal roosters worden bereid.
4. Gloedlossing.
   OPMERKING: De gloedlossing zet de van nature hydrofoob koolstof-coating laag van de roosters in hydrofiel. Deze stap is optioneel.
   1. Plaats de roosters met de koolstof zijde naar boven op een 7,5 x 2,5 cm glasplaatje bedekt met Parafilm. Plaats deze in de kamer van de glow-ontlading apparatuur en sluit de kamer.
   2. Pompde stolp en glow-kwijting voor 20 sec bij 25 mA en 7 x 10 ^-2 mbar.
      OPMERKING: Gedurende deze tijd een lichte paarse gloed zichtbaar wordt. Verwijder het glaasje met de roosters en gebruik ze binnen 1 uur, anders zal ze moeten zijn gloed weer ontladen.

3. Steekproef Plunge-invriezen

OPMERKING: Gebruik een veiligheidsbril en geschikt schoeisel voor het gebruik van dit instrument te beschermen tegen vloeibare stikstof en ethaan spatten.

1. Zet de-duik bevriezing apparaat. Vul bevochtiger met gedestilleerd water. Stel de gewenste temperatuur, relatieve vochtigheid en kelderen voorwaarden voor vlek tijd, dep kracht en adsorptie tijd (22 ° C, 95%, 2 sec, 2 en 40 sec in het voorbeeld hier gepresenteerde). Plaats nieuwe blotting papieren filter.
2. Koel de houder ethaan door het vullen van de buitenste reservoir met vloeibare stikstof tot stabiliteit wordt bereikt (ongeveer 10 min). Zodra de vloeibare stikstof stopt boiling Plaats het uiteinde van de buis uit de ethaan tank in de binnenkamer en opent de afsluiter langzaam. Vloeibaar ethaan in de binnenkamer en vul tot 1 mm van de bovenkant. Vermijd het bevriezen van de ethaan. LET OP: ethaan is uiterst brandbaar en explosief.
3. Zorg ervoor dat een pincet worden uitgelijnd binnen de sprong bevriezing apparaat.
4. Schakel luchtvochtigheid. Plaats een rooster op de pincet en plaats 3-5 ul van het monster op de koolstof oppervlak (doffe kant) van de holey net. Wacht tot het monster te adsorberen op het net en voer de blot een dunne vloeistoflaag bereiken.
5. Flash-vries het rooster door kelderen het in de vloeibare ethaan. Verwijder de pincet-grid assemblage van de vloeibare ethaan met de pincet gestaag, en overbrengen naar de buitenste kamer met vloeibare stikstof. Breng de grid naar een klein raster doos ondergedompeld in de vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat u de verglaasd monster in vloeibare stikstof de hele tijd tijdens het overzetten naar ofwel de opslagtank te houdenof om de cryo houder.
   OPMERKING: Grid dozen kunnen in een grote capaciteit (35-50 L) vloeibare stikstof Dewar worden bewaard gedurende ten minste 1 jaar. Voor gemakkelijke opslag zij in een 50 ml Falcon buis kan worden gebracht met twee gaten aan de bovenkant en een vislijn aan de dop die kunnen worden getrokken uit de mond van de Dewar.

4. Breng de Cryo-grid aan de TEM

1. Steek de cryo houder in de cryo-overdracht werkstation. Zorg ervoor dat u het uiteinde van de houder beschadigen tijdens het inbrengen. Controleer de aanwezigheid van kleine vezels en stof op de staaf en de O-ring van de cryo houder met een loep, als er een verwijderen optische lens papier.
2. Vul de Dewar van de cryo houder en het werkstation vat met vloeibare stikstof. Morsen van de vloeibare stikstof met behulp van de gevangen trechter die wordt geleverd met het werkstation.
3. Sluit de cryo houder aan de koude fase controller te controleren van de temperatuur, en houd het toevoegen van vloeibare stikstof & #160, totdat de temperatuur stabiliseert op ongeveer -194 ° C. Zorg ervoor dat het niveau van vloeibare stikstof is onder het niveau van de vacuümverpakking zowel het werkstation vat en het cryo houder Dewar. Pre-koelen de grid pincet, de clip ring en het stompe einde van de clip ring tool op het werkstation. Ook pre-koelen een reeks grote pincet en een schroevendraaier in een andere dewar gevuld met vloeibare stikstof.
4. Snel overbrengen het raster doos cryo met daarin de bevroren gehydrateerd roosters aan de vloeibare stikstof in het werkstation met behulp van de grote pincet. Open het rooster doos cryo met de schroevendraaier, neem de bevroren gehydrateerd rooster en plaats deze in de monsterhouder sleuf.
5. Plaats de klem ring aan de bovenzijde van het rooster en druk hem voorzichtig met de stompe einde van de clip ring hulpmiddel tot deze stevig vastzit. Sluit de cryo-sluiter. Verwijder de doos gereedschappen en cryo raster van het werkstation.
6. Beweeg de hele werkstation met houder en raster om de microscoop console om minimaliseren de transfer van het rooster in de kamer lucht.
7. Bovenop de TEM anti-contaminator met vloeibare stikstof, die eerder gevuld en afgekoeld gedurende tenminste 20 minuten. Pre-kantel de microscoop podium tot -60 °.
   LET OP: Dit zal het verlies van vloeibare stikstof te minimaliseren als de houder in de luchtsluis wordt geplaatst.
8. Beginnen met de pre-pomp luchtsluis cyclus op de microscoop. Zorg ervoor dat de klep het elektronenkanon is gesloten (vooral als het een FEG TEM). Wacht tot de pre-pomp luchtsluis sequentie (ongeveer 2 minuten) voltooien alvorens de cryo houder.
   LET OP: Dit wordt aangegeven door het rode lampje op het podium wordt gedoofd.
9. Plaats de houder in de luchtsluis en draai hem 90 ° met de klok mee; sluit de koude fase controller aan op de cryo houder om de temperatuur te controleren. Weer wachten tot het rode licht wordt gedoofd en draaien zowel het podium en de houder terug in de 0 ° positie om de houder te voegen in de TEM's high vacuümkolom.
10. Zorg ervoor dat de temperatuur gaat nooit boven de -160 ° C tot de vorming van kristallijn ijs te voorkomen.
11. Vul de Dewar van de cryo houder. Wacht 15-45 minuten, totdat de houder thermisch is in evenwicht gebracht en de TEM vacuüm is hersteld voordat het opnemen van beelden.
12. Als borrelen van de vloeibare stikstof wordt gedetecteerd, verandert de vloeibare stikstof vulhoogte, of zachtjes aanraken van de borrelende oorsprong met een wattenstaafje.

5. Een lage dosis Data Collection

OPMERKING: De lage dosis gegevensverzameling techniek wordt gebruikt om de schade elektronenstralingsbron het monster te minimaliseren door de blootstelling aan 20 elektronen / A ² te beperken. Dit wordt bereikt door afwisselend drie configuraties: "zoeken", met een lage vergroting (~ 5,000X) en breed gezichtsveld, "focus", met een sterke vergroting (~ 150,000X) en kleine gezichtsveld, en "exposure", met de gewenste uiteindelijke magnicatie en met het gebied van belang om te worden opgenomen. Leeg de balk in tussen modi.

1. Stel de TEM en de lage dosis Program
   1. Trek de cryo-sluiter en open de kolom kleppen.
   2. Centreer het podium en stel de eucentrische hoogte (Z) met de alpha wobbler op het podium rocken ± 15 °. Pas de Z-positie totdat er geen merkbare beweging terwijl het podium schommelt. Activeer de lage dosis programma en selecteer de detector voor elke modus.
   3. In belichtingsstand vinden een gebied van het raster dat er geen koolstof heeft, past de verlichting door het selecteren van de optimale condensor diafragma en de puntgrootte zo dat het gebied op te nemen volledig verlicht is. Zorg ervoor dat u de balk in de overcondensation richting verspreiden.
   4. In de zoekmodus, vinden een kleine functie die gemakkelijk herkenbaar bij hogere vergroting zal zijn. In belichtingsstand, centreren deze functie met de joystick (de xy podium controller). Begin bij lagere vergroting als de prestatieure is niet in het gezichtsveld.
   5. In de zoekmodus, breng deze functie om het midden van het veld met behulp van de lage dosis xy image shift controles. Ga naar belichting en beweeg de functie langs de schuine as met behulp van de joystick, totdat het uit het gebied dat moet worden opgenomen (0,5-3 micron). Ga naar de modus richten en centreren de functie met behulp van de xy beeldverschuivingsfunctie controles. Begin bij lagere vergroting als de functie is niet in het gezichtsveld.
   6. Houd de bundel midden op alle momenten.
2. Data Collection
   1. Trek de cryo-sluiter en open de kolom kleppen. Activeer de lage dosis programma.
   2. In de zoekmodus, identificeren een rooster plein met dunne, homogene ijs.
   3. Kies een geschikte gat en plaats het in het midden van het veld. Schakelen naar de focus en het beeld scherp. Dan underfocus het beeld tussen 0,5-4,5 micron.
   4. Schakelen naar de belichting en neem het beeld op.
   5. Schakelen naar de modus zoeken en herhaal de stappen 5.2.3-5.2.4.Beweeg over het rooster plein vermijden van pre-bloot goede gaten te worden opgenomen.
   6. Eindig het vierkant rooster en verplaatsen naar een andere goede.
   7. Bijstellen hoogte (Z) en verder het verzamelen van gegevens.

Resultaten

Zorgvuldige uitvoering van al het protocol stappen in figuur 1 maakt visualisatie van bevroren gehydrateerd, niet-gekleurd macromoleculen. Resultaten voor vier representatieve exemplaren met verschillende structurele kenmerken worden getoond. De microscopische beelden verkregen door de werkwijzen van NS en cryoEM worden vergeleken (figuur 2). (I) NS afbeeldingen AAV5 onthullen virusachtige partikels van ongeveer 130 Å diameter. Het naast elkaar bestaan ​​van volle en lege structuren komt overeen met gebroken en structureel intact capsids (die vlek toe te laten), respectievelijk. CryoEM toont uniform lege structuren; inderdaad deze virale deeltjes niet genetisch materiaal ²⁸ bevatten. NS toont overheersende ronde deeltjes terwijl cryoEM toont meestal zeshoekige deeltjes, als gevolg van hun icosahedrale vorm. (Ii) Beelden van de spiraalvormige TMV tonen staven van 180 een diameter en een variabele lengte, vaak langer dan 0,1 micrometer, met een spiraalvormige herhaling van 23 een zichtbare beidenin NS en in cryoEM. De 40 een centraal kanaal is gevuld met vlek in de NS afbeeldingen en leeg in de cryoEM beelden. (Iii) Inheems KLH, een didecamer van 8 MDa, assembleert in karakteristieke vaten van 350 een diameter en 400 een lengte. NS en cryoEM onthullen KLH's rechthoekige zij- en ronde end-on uitzicht. Beide technieken onthullen zes strepen loodrecht op de symmetrieas en de gelijke afstand morfologische eenheden binnen elke laag. CryoEM onthult een lege innerlijke structuur. (Iv) ryanodinereceptor, grote tetramere intracellulaire kanaalsysteem van 2,26 MDa, wordt beschouwd als een vierkant van 275 x 275 ^A2. Ingewikkelde oppervlakte-eigenschappen, zoals een centrale kruis en een centrale depressie manifesteren als vlek accumulatie van NS, en als lagere dichtheid regios cryoEM. Terwijl NS geeft zelfde contrast in alle vier geteste monsters vergelijking van de cryoEM panelen bloot lagere SNR (contrast) van RYR1 door de aanwezigheid van detergens dit membraaneiwit oplosbaar.

Typische voorbeelden van cryoEM artefacten getoond RYR1: kristallijn ijs, verontreiniging, astigmatisme en web-achtige structuren (figuur 3). Hun oorzaken en preventie worden verder beschreven in het hoofdstuk discussie.

SPA en 3D-reconstructie van bevroren gehydrateerd RYR1 onthult haar viervoudige symmetrische structuur, die homotetramere organisatie van het eiwit (Figuur 4A) weerspiegelt. De cytoplasmatische domein vormt een vierkant prisma van 275 x 275 x 120 A ³ en bevat een aantal reproduceerbare bolvormige domeinen vormen een steiger-achtige structuur. De transmembraan domein vormt een kleiner taps toelopende vierkante prisma met maximale afmetingen van 115 x 115 x 60 A ^3. Op 10 Å resolutie is het mogelijk om alfa-helices (Figuur 4B) te visualiseren. 3D verschil mapping kan de positie van belangrijke liganden openbaren, in dit geval het verschil 3D kaart van FKBP12, een 12 kD eiwit ontrode een subeenheid van RYR1 wordt bovenop RYR1 (figuur 4C) ^29. Tot slot, vormveranderingen zorgen voor een dynamische weergave van het macromolecuul. In dit geval RYR1 eerder gestabiliseerd in open of gesloten omstandigheden blijkt dat er een massa translocatie van de gesloten naar de open toestand (figuur 4D) ^27.

Figuur 1. Stroomdiagram van de cryo-elektronenmicroscopie techniek. Het schema worden de belangrijkste stappen van het protocol.

Figuur 2. Vergelijking van NS en cryoEM voor verschillende monsters. (A) AAV5, een icosahedraal virus. (B) TMV, een spiraalvormige virus. Inzetstukken tonen de spiraalvormige herhaling, van 23 Å. (C) Inheems KLH. (D) RYR1; de standpunten representatief zijn gemarkeerd (f, viervoudig uitzicht en s, zijaanzicht). Alle monsters worden afgebeeld onder lage doseringen en bij dezelfde vergroting van 50.000 maal een onder een versnellingsspanning van 200 kV. Schaalbalken, 10 nm. Alle NS monsters zijn op koolstof-ondersteuning, cryoEM monsters A, C, D zijn op dunne koolstof dan quantifoil en cryoEM monster B is direct over quantifoil gaten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Galerij van beelden tonen van gemeenschappelijke cryoEM artefacten op een RYR1 cryoEM monster. (A) Kristallijn ijs. (B) Ice contaminatie (pijlen). (C) Astigmatisme. RyR1s in de astigmatische afbeelding zijn nauwelijks zichtbaar. De inzet aan de rechterkant toont de kracht SPECTrum van het beeld met asymmetrische Thon ringen. De inzet op de linkerzijde toont het vermogensspectrum van niet-astigmatische afbeelding voor referentie a. (D) Web-achtige structuren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. CryoEM en 3D-reconstructie van de ryanodinereceptor. . (A) isosurface representatie (B) Docking van een kristalstructuur van RYR1 de N-terminus ³⁰ toont een goede overeenkomst tussen de atomaire coördinaten en de cryoEM envelop; pijlen wijzen naar twee alfa helices die uitsteken van de structuur. Pijlpunt geeft één van de vier helices die de poriën van het ionkanaal omringen. De stippellijnen geven de grenzen van het membraan. (C) RYR1 en 3D locatie van de FKBP12 ligand (oranje kleur). (D) Conformatieveranderingen van RYR1 in het gaan van de gesloten (oranje) naar de open (zwarte mesh) conformatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

TEM gevolgd door SPA heeft vele macromoleculaire 3D structuren bijgedragen bijna 2000 vermeldingen in de EMDB medio 2014 algemeen voor een bepaald macromolecuul, wordt een lage-resolutie 3D structuur eerst bepaald NS gegevens, eventueel gevolgd door een hoger- resolutie cryoEM 3D-structuur. Het hoge contrast van de moleculaire grenzen door NS, waarbij de eerste 3D reconstructie vergemakkelijkt wordt later verfijnd door cryoEM met zijn vermogen om de interne structuur van het macromolecuul kaart in de volledig gehydrateerde toestand, en de mogelijkheid om veel hogere resolutie te bereiken. Een ander voordeel van cryoEM is de eliminatie van uitdroging stress die kan leiden tot ineenstorting van het macromolecuul. Daarnaast bestaat de mogelijkheid om de koolstofdrager, hetgeen mogelijk zuiging effecten elimineert en toont de conformatie dat het macromolecuul aanneemt in oplossing laten. Cryo-negatieve kleuring, een combinatie van cryoEM en NS, levert hoog contrast in een volledig hydnominale exemplaar en kan ook leiden tot een 3D-reconstructie met behulp van SPA, maar het is minder vaak gebruikt, met minder dan 10 EMDB inzendingen, voor een deel omdat de vlek zelf kunnen interfereren met de integriteit van het macromolecuul ^31. Twee andere TEM technieken bevorderlijk zijn voor 3D-reconstructie zijn 2D elektron kristallografie en elektronenmicroscopie tomografie. 2D elektron kristallografie is een vlak of buisvormig kristal; het kristal van elektronen diffractie wordt gebruikt voor 3D-reconstructie kan leiden tot atomaire resolutie ^32. In tomografie verglaasd of traditioneel vaste monsters wordt een macromolecuul of subcellulaire component geroteerd in de TEM voor daaropvolgende tomografische reconstructie ^33, met als voordeel dat unieke objecten te reconstrueren; maar op dit moment heeft deze techniek een resolutiegrens van 40 tot 20 A ^34,35. Onder al deze moleculaire TEM technieken, heeft SPA van NS en cryoEM gegevens de meest geweestgebruikt. Het protocol hier afgebeelde is gewijd aan het verkrijgen van cryoEM beelden geschikt voor SPA-analyse; De meeste gebruikers van het protocol ook voor cryoEM 2D kristallen en tomografische monsters.

Een succesvolle cryoEM sessie hangt af van het gecombineerde succes van veel kritische stappen; belangrijke aspecten in gedachten te houden, verklaring van de meest cryoEM artefacten en hoe te voorkomen dat ze worden beschreven in de volgende paragrafen. Dit deel beschrijft ook richtlijnen verzamelen van gegevens om hoge kwaliteit 3D-reconstructies met behulp van de SPA-methode te verkrijgen.

Vermijd overgang naar ijs kristallijn. Een centraal aspect is dat het monster nodig om te verblijven in glasvocht staat vanaf het moment van cryo kelderen hele TEM observatie. Dus na dompelen van het monster in vloeibare ethaan alle volgende stappen worden uitgevoerd bij vloeibare stikstof (-196 ° C) of vloeibaar helium (-269 ° C) temperaturen. Verwarmen tot boven de -135 ° C transformeert glasvocht water inkristallijn water; dan macromoleculaire herschikkingen kunnen plaatsvinden en water kristallen domineren het beeld (figuur 3A); het monster moet worden weggegooid. Accidental monster warm-up zou kunnen gebeuren als cryo-kelderen, de overdracht van de bevroren rooster tussen containers (zelfs als beschermd door een gridbox), en / of cryo houder inbrengen in de TEM te langzaam zijn, of als de afhandeling pincet waren onvoldoende pre- gekoeld. Aanzienlijke onderdruk verslechtering van de TEM bij cryo-overdracht (de koude steekproef vallen warmere binnenkomende lucht) kan ook opwarmen het monster. Tenslotte over-bestraling van het monster kan ook leiden tot de overgang naar ijs kristallijn.

Minimaliseren ijs besmetting. Gezien de kleine steekproef volume (3-5 pi) toegepast op de TEM rooster, kon verdampen buffer componenten (zout, detergenten) te concentreren en dus van invloed op macromoleculaire integriteit, waaronder verlies van multimere staat. Een hoge relatieve vochtigheid (RV) micro-omgeving of kamer te omzeilens dit probleem. Als alternatief cryo-kelderen kan gedaan worden in een voldoende geventileerde milieu koude kamer. Na cryo storten RH moet zo laag mogelijk zijn om ijs verontreiniging of condensatie van luchtvochtigheid op de cryo-grid voorkomen als de cryo-grid zelf werkt als een koude val. Verontreiniging ijs bestaat uit deeltjes met een hoog contrast en geen onderbouw met een grootte variërend tussen ~ 5 nm en enkele microns die interfereren met of zelfs geheel te blokkeren het beeld. Vermijd tocht, praten / ademhaling naar de cryo-grid tijdens lucht overdracht en het verminderen van relatieve luchtvochtigheid. Open containers met vloeibare stikstof met gecondenseerde water (zichtbaar als witte zwevende deeltjes) moeten ook worden verwijderd.

Maximaliseren macromoleculaire oriëntaties / uitzicht. Voor monster-ondersteuning, een keuze worden gemaakt tussen echte holey rasters en dunne carbon dan holey roosters. Dit is afhankelijk van (i) de manier waarop het monster zich verspreidt over koolstof film versus de koolstof gaten, (ii) beschikbaar monster concentration, zoals kale gaten kan een concentratie 100x hoger dan koolstof ook voor soortgelijke deeltjesdichtheid op de afbeelding vereist (van ~ 0,02-2 uM), en (iii) hoe willekeurig de verdeling van macromolecuul oriëntaties. Merk op dat gloedlossing, waarvan de koolstof hydrofiele maakt, zal een belangrijk effect op alle drie aspecten hebben en dat dit monster-afhankelijk zal zijn. Wat betreft de oriëntatie van het macromolecuul, terwijl een terugkerende weergave wenselijk de initiële structuurbepaling door willekeurige conische reconstructie, willekeur van macromoleculaire standpunten is wenselijk wanneer het verfijnen van de 3D reconstructie hogere resoluties. In ons voorbeeld, RYR1 interageert met de koolstof met een favoriete 'viervoudig' view (figuur 2D) en vereist holey roosters voor willekeur van oriëntaties en hogere resolutie ^36.

Maximaliseren SNR. De beste strategie om SNR te verhogen is om de achtergrond bronnen van ruis te verminderen. Overmatige consumptiedikte en (indien aanwezig) koolstof filmdikte dan nodig te ondersteunen en verankeren het eiwit extra ruis toe. Zo moet ijsdikte tot het noodzakelijke minimum worden beperkt door het beheersen deppen tijd, druk, RH, en filterpapier kwaliteit. Voor carbon ondersteuning wordt een dunne (~ 5 nm) carbon folie gelaagd over de dikkere essen carbon film: de dikke essen carbon biedt mechanische weerstand terwijl de sample wordt afgebeeld op de dunne-carbon bedekt gat. Anderzijds, op dat extreem dun ijs en / of koolstof kan leiden tot een gemakkelijk gebroken steun die kan uitmonden in een web (Figuur 3D). Om SNR maximaliseren, moet onnodige buffercomponenten vermijden. Voor membraaneiwitten, het wasmiddel neemt een belangrijke tol op contrast (zie figuur 2D, rechter paneel). Bovendien doordat oppervlaktespanning wijzigt het detergens de wijze waarop het monster zich op de drager. Sommige membraaneiwitten vereisen de aanwezigheid van lipide naast detergent, die verder vermindert het contrast. Om dit het monster overwonnen kan worden verdund in een buffer met lagere detergensconcentratie en zonder lipide net voor cryo-kelderen ^37. Nieuwe alternatieve detergentia ¹⁶ en het gebruik van nanodisks ³⁸ het transmembraandomein component stabiliseren blijken succesvolle benaderingswijzen voor beeldvorming membraaneiwitten door cryoEM zijn.

Streven naar hoge kwaliteit foto's en voor te bereiden op de CTF correctie. Vitrified exemplaren vereisen een hoge defocuswaarden om voldoende image (fase) te genereren contrast waar de CTF, de functie die intensiteit betrekking heeft op de frequentie, heeft verschillende nul overgangen, op welk punt is er geen informatie. Terwijl CTF correctie niet noodzakelijk voor lage resolutie 3D reconstructie, bij het streven naar een hogere resolutie, een juiste weergave van het 3D-object herstellen afbeeldingen met verschillende defoci kunnen worden opgehaald zodat computationele CTF correctie kan worden uitgevoerd.CTF vastberadenheid en correctie is opgenomen in de grote SPA softwarepakketten ^4-7; details zijn elders ³⁹ te vinden. Voor een optimale CTF correctie, maken gebruik van verschillende defoci. Een goede strategie is om te wisselen tussen de 3-4 defocuswaarden. De waarden zijn afhankelijk van de grootte van het macromolecuul (grotere afmetingen vereisen minder defocus), ijs / carbon dikte (dunnere monster minder defocus vereist) en de spanning (lagere spanning vereist minder defocus). Voor 200 kV, een goed uitgangspunt bereik van waarden is 2,5, 3, 3,5 en 4 micrometer defocus. De CTF manifesteert als afwisselende ringen van hoge en lage intensiteit (Thon ringen ⁴⁰⁾ in de reciproke ruimte representatie, het vermogensspectrum. Het vermogensspectrum Display zal het potentieel voor resolutie te onthullen; de frequentie van de breedste zichtbare Thon ring het dichtst a priori schatting van de haalbare resolutie. Het vermogensspectrum moet periodiek worden gecontroleerd, en astigmatische (niet-cirkelvormige) Thon ringen (Figuur 3C) moet worden gecorrigeerd met als doel stigmator. Thon ringen moet zichtbaar zijn in ieder geval tot de gewenste resolutie.

Een cryoEM dataset met dit protocol kan direct worden verwerkt door SPA om een ​​3D reconstructie te genereren. Zelfs met een ideaal monster wordt de kwaliteit van de 3D reconstructie afhankelijk van de prestaties en specificaties van de TEM apparatuur en de beeldverwerking. Met de voortdurende verbeteringen op deze beide fronten, en met een speciale vermelding voor de recent ontwikkelde directe elektron detectoren, de mogelijkheid om 3D-reconstructies te verkrijgen op atomaire resolutie constanter is dichterbij dan het ooit is geweest.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ethane	Airgas	371745	99.99% zuiverheid is erg belangrijk, onzuiverheden kunnen leiden tot hoogcontrasterende verontreinigingen op de grid. LET OP: ontvlambaar
Vloeibare stikstof	Airgas	27135	99% zuiverheid. LET OP: het hanteren van vloeibare stikstof in een koude ruimte vormt een ernstig verstikkingsgevaar omdat stikstof zuurstof verdringt zonder enige waarschuwingssignalen.
Dumont nr. 5 Antimagnetische pincet	Ted Pella	5326
Micasam, 1 x 4 cm	Ted Pella	54
Grafietrodes, voorgeslepen maat 1/8” dia x 2 ¼” lange punt 0.039” dia hals type	Electron Microscopy Sciences	70220-45
350 ml cryo-dewars	Pope	8600
Cu 400 mesh gaten grids  Quantifoil	Quantifoil	Q10525
Cu 400 mesh gaten grids C-Flat	Protochips	CF-1.2/1.3-4C
Gloei-ontladingsapparaat	Electron Microscopy Sciences	Model E7620
Turbopompstation	Gatan	Model 655
Koolstofverdamper	Denton Vaccum	Model 502B
Freesduikpomp	FEI	Vitrobot Mark IV
Transmissie-elektronenmicroscoop 200 kV	FEI	Model Tecnai F20
CCD-camera 4k x 4k	Gatan	UltraScan 4000 UHS
Beeldverwerkingssoftware CTFFIND3/CTFTILT			http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Beeldverwerkingssoftware EMAN			http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Beeldverwerkingssoftware Spider			http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Beeldverwerkingssoftware Freealign			http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
3D visualisatiesoftware Chimera			http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanine	Biosyn