Method Article

Pluripotente menselijke stamcellen Gebaseerd Ontwikkelingstoxiciteit Testen voor Chemical Safety Screening and Systems Biology gegevens Generation

DOI:

10.3791/52333

⸱

June 17th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology, University of Cologne, 2Department of Biology, University of Konstanz, 3Department of Statistics, Technical University of Dortmund, 4Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors, Technical University of Dortmund

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De protocollen beschrijven twee in vitro ontwikkelingstoxiciteit testsystemen (UKK en UKN1) op basis van menselijke embryonale stamcellen en transcriptoom studies. De testsystemen voorspellen mens ontwikkelingsstoornissen giftigheidsgevaar, en kunnen bijdragen aan dierproeven, de kosten en de tijd die nodig is voor de chemische veiligheid testen te verminderen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efficiënte protocollen menselijke pluripotente stamcellen aan verschillende weefsels in combinatie onderscheiden met -omics technologieën opende nieuwe perspectieven voor in vitro testen van de toxiciteit van potentiële geneesmiddelen. Een solide wetenschappelijke basis voor dergelijke assays verschaffen, is het belangrijk om kwantitatieve informatie te verkrijgen over het tijdsverloop van de ontwikkeling en de onderliggende regulerende mechanismen systeembiologie benaderingen. Twee tests zijn daarom hier afgestemd op deze eisen. In het UKK testsysteem worden menselijke embryonale stamcellen (hESC) (of andere pluripotente cellen) links spontaan differentiëren 14 dagen in embryoid organen, opwekking van cellen van alle weefsels mogelijk. Dit systeem recapituleert belangrijkste stappen van vroege menselijke embryonale ontwikkeling, en kan voorspellen mensspecifieke vroege embryonale / teratogeniciteit, indien cellen worden blootgesteld aan chemicaliën tijdens differentiatie. Het UKN1 testsysteem is gebaseerd op hESC differentiëren naar een population van neuro-ectodermale progenitor (NEP) cellen gedurende 6 dagen. Dit systeem recapituleert vroege neurale ontwikkeling en voorspelt vroege ontwikkelingsneurotoxiciteit en epigenetische veranderingen veroorzaakt door chemicaliën. Beide systemen, in combinatie met transcriptoom microarray studies, zijn geschikt voor het identificeren van biomarkers toxiciteit. Bovendien kunnen zij worden gebruikt in combinatie om data systeembiologie analyse te genereren. Deze testsystemen hebben voordelen ten opzichte van de traditionele toxicologische studies waarbij grote hoeveelheden dieren. De test systemen kan bijdragen tot een vermindering van de kosten voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en chemische veiligheidsevaluatie. Hun combinatie belicht vooral op verbindingen die neurodevelopment specifiek kunnen beïnvloeden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen van humane embryonale stamcellen (hESC) te differentiëren tot verschillende typen cellen opende een nieuw tijdperk van in vitro toxiciteitsproeven 1, ziektemodel en regeneratieve geneeskunde 2. De stamcellen zijn begiftigd met de capaciteit om te repliceren, om hun pluripotente toestand in stand te houden en te differentiëren tot gespecialiseerde cellen 3,4. De eigenschappen van hESC (capaciteit om te differentiëren tot alle belangrijke celtypes) zijn ook gevonden in andere menselijke pluripotente stamcellen, zoals de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) of cellen die door nucleaire transfer 5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol werd uitgevoerd met behulp van menselijke embryonale stamcellen lijn (hESC) H9. Deze cellijn was routinematig gekweekt op mitotisch geïnactiveerde muis embryonale fibroblasten (MEF) in hESC cultuur media, aangevuld met bFGF en vervolgens gekweekt in stamcel media op 6 cm Petri platen bekleed met basaal membraan matrix zoals matrigel, om zich te ontdoen van MEF. De H9 cellen van> 80% confluente platen werden gebruikt voor verdere passage. H9 cellen gekweekt op basaal membraan matrix platen werden gebruikt voor de vorming van EBS. Alle in het volgende protocol genoemde procedures zijn uitgevoerd met behulp van standaard....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Methylkwik exposure in UKK testsysteem

De cytotoxiciteit bepaling werd uitgevoerd met H9 EBS een IC 10-waarde (vermindering van de levensvatbaarheid van 10%) voor de cytotoxiciteit van methylkwik (Fig 1) te verkrijgen. We voerden ook een microarray gebaseerde (Affymetrix platform) biomerker studie. De H9 EBS blootgesteld aan methylkwik (0,25 en 1 uM) gedurende 14 dagen. Op dag 14 zijn monsters gebruikt TRIzol verzameld en RNA werd geïsoleerd. Transcriptie profiler.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionele benaderingen voor toxicologische tests op uitgebreide dierstudies waardoor testen kostbaar en tijdrovend. Bovendien kan door de interspecies verschillen preklinisch veiligheid bij dieren niet altijd geldig toxische effecten van potentiële geneesmiddelen relevant voor de mens voorspellen. Hoewel niet-menselijke primaten zijn meest voorspelbare, nog steeds sterk ethische en socioeconomical eisen snel verhogen door de moderne samenlevingen voor het ontwikkelen van gevoelige en robuuste in vitro-test <.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We thank M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani and Cornelia Böttinger for excellent technical support. This work was supported by grants from the German Research Foundation (RTG 1331) and the German Ministry for Research (BMBF).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F-12Life Technologies11320082Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSRLife Technologies10828028Knockout Serum Replacement
GlutaMAXLife Technologies35050061GlutaMAX supplement
NEAALife Technologies11140050MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBSLife Technologies14190-0144Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR mediumStemcell Technologies5850
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
V bottom plateVWR734-0483Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lidVWR634-0011Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/StrepLife Technologies15140-122Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled WaterLife Technologies15230-089.Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF)MilliporeGF003AF-100UGFibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μmMilliporeSCGPU02REStericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM DisposablteInvitrogen23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified MatrixStemcell Technologies3542775 ml vial
DMSOSigmaD-2650
RNAlater Stabilization SolutionLife TechnologiesAM7020It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell StrainerBecton Dickinson352350Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tubeBecton Dickinson3522355 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tubeGreiner Bio-One22726150 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flaskGreiner Bio-One658175CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzolLife Technologies10296010
96 well optical bottom platesThermo Scientific165305
CellTiter-BluePromegaG8081
AccutasePAAL11-007
ApotransferinSigma-AldrichT-2036
DispaseWorthington BiochemicalsLS002104
DorsomorphinTocris Bioscience3093
EDTARoth8043.2
FBSPAAA15-101
FGF-2R&D Systems233-FB
GelatineSigma-AldrichG1890-100G
GlucoseSigma-AldrichG7021-100G
GlutaMAXGibco Invitrogen35050-038
HEPESGibco Invitrogen15630-056
InsulinSigma-AldrichI-6634
Knockout DMEMGibco Invitrogen10829-018
MatrigelBD Biosciences354234
NogginR&D Systems719-NG
PBSBiochrom AGL1825
ProgesteronSigma-AldrichP7556
PutrescineSigma-AldrichP-5780
ROCK inhibitor Y-27632Tocris Biosciences1254
SB431542Tocris Biosciences1614
SDSBio-Rad161-0416
SeleniumSigma-AldrichS-5261
β-MercaptoethanolGibco Invitrogen31350-010
[header]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain KitAffymetrix900721, 22, 23This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase SetQIAGEN79254
[header]
List of equipment
Inverted microscopeOlympusIX71
Genechip Hybridisation Oven - 645Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 GAffymetrix
Spectramax M5Molecular Devices
 
 
 
[header]
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation
DAVID
Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
  2. Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceut....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsDevelopmental Toxicity AssaysEmbryoid Body FormationNeuroectodermal Progenitor DifferentiationTranscriptome Microarray AnalysisChemical Safety ScreeningSystems Biology Data GenerationEarly Embryonic DevelopmentNeural Development ToxicityToxicity Biomarker Identification

Related Articles