Methodenartikel

Pluripotente menselijke stamcellen Gebaseerd Ontwikkelingstoxiciteit Testen voor Chemical Safety Screening and Systems Biology gegevens Generation

DOI:

10.3791/52333

⸱

17 juni 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology, University of Cologne, 2Department of Biology, University of Konstanz, 3Department of Statistics, Technical University of Dortmund, 4Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors, Technical University of Dortmund

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De protocollen beschrijven twee in vitro ontwikkelingstoxiciteit testsystemen (UKK en UKN1) op basis van menselijke embryonale stamcellen en transcriptoom studies. De testsystemen voorspellen mens ontwikkelingsstoornissen giftigheidsgevaar, en kunnen bijdragen aan dierproeven, de kosten en de tijd die nodig is voor de chemische veiligheid testen te verminderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efficiënte protocollen menselijke pluripotente stamcellen aan verschillende weefsels in combinatie onderscheiden met -omics technologieën opende nieuwe perspectieven voor in vitro testen van de toxiciteit van potentiële geneesmiddelen. Een solide wetenschappelijke basis voor dergelijke assays verschaffen, is het belangrijk om kwantitatieve informatie te verkrijgen over het tijdsverloop van de ontwikkeling en de onderliggende regulerende mechanismen systeembiologie benaderingen. Twee tests zijn daarom hier afgestemd op deze eisen. In het UKK testsysteem worden menselijke embryonale stamcellen (hESC) (of andere pluripotente cellen) links spontaan differentiëren 14 dagen in embryoid organen, opwekking van cellen van alle weefsels mogelijk. Dit systeem recapituleert belangrijkste stappen van vroege menselijke embryonale ontwikkeling, en kan voorspellen mensspecifieke vroege embryonale / teratogeniciteit, indien cellen worden blootgesteld aan chemicaliën tijdens differentiatie. Het UKN1 testsysteem is gebaseerd op hESC differentiëren naar een population van neuro-ectodermale progenitor (NEP) cellen gedurende 6 dagen. Dit systeem recapituleert vroege neurale ontwikkeling en voorspelt vroege ontwikkelingsneurotoxiciteit en epigenetische veranderingen veroorzaakt door chemicaliën. Beide systemen, in combinatie met transcriptoom microarray studies, zijn geschikt voor het identificeren van biomarkers toxiciteit. Bovendien kunnen zij worden gebruikt in combinatie om data systeembiologie analyse te genereren. Deze testsystemen hebben voordelen ten opzichte van de traditionele toxicologische studies waarbij grote hoeveelheden dieren. De test systemen kan bijdragen tot een vermindering van de kosten voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en chemische veiligheidsevaluatie. Hun combinatie belicht vooral op verbindingen die neurodevelopment specifiek kunnen beïnvloeden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen van humane embryonale stamcellen (hESC) te differentiëren tot verschillende typen cellen opende een nieuw tijdperk van in vitro toxiciteitsproeven 1, ziektemodel en regeneratieve geneeskunde 2. De stamcellen zijn begiftigd met de capaciteit om te repliceren, om hun pluripotente toestand in stand te houden en te differentiëren tot gespecialiseerde cellen 3,4. De eigenschappen van hESC (capaciteit om te differentiëren tot alle belangrijke celtypes) zijn ook gevonden in andere menselijke pluripotente stamcellen, zoals de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) of cellen die door nucleaire transfer 5. Zo hebben vele verschillende cellijnen gedifferentieerd tot neuronen 6, 7 niercellen, neurale cellen 8, cardiomyocyten 12/09 of hepatocyten achtige cellen 13,14. Bovendien kan hESC spontaan differentiëren in cellen van alle drie de kiem lagen 15-18 in embryoid lichamen (EBS) 19,20. Early embryonale ontwikkeling wordt gereguleerd door differentiële expressie van verschillende genen betrokken bij de verschillende kiem lagen die op mRNA-niveau is vastgelegd door transcriptomics behulp van microarray technologie 15. Deze inspanningen resulteerden in de oprichting van het orgaan specifiek toxicologisch modellen gebaseerd op hESC / iPSC en transcriptomics analyse (zie voor een overzicht 21,22). Deze modellen hebben voordelen ten opzichte van het traditionele gebruik van proefdieren voor toxicologische studies, zoals preklinische studies met proefdieren zijn niet altijd voorspellend voor de menselijke veiligheid. De drug geïnduceerde toxiciteit aangetroffen bij patiënten zijn vaak gerelateerd aan metabole of signalering processen die verschillen tussen mensen en proefdieren. Het verschil soort is de betrouwbare vroege opsporing van ontwikkelingsstoornissen voorkomen bij de mens, en bijvoorbeeld drugs zoals thalidomide 23,24 en 25,26 diethylstilbestrol werden uit de markt genomen vanwege teratogeniciteit. ThaliDomide heeft niet aangetoond geen ontwikkelingsstoornissen bij ratten of muizen. Milieuchemicaliën zoals methylkwik 27 resulteerde in prenatale ontwikkelingstoxiciteit opzichte van het zenuwstelsel in verscheidene species, maar menselijke manifestaties zijn moeilijk te modelleren bij dieren zijn. Om het probleem van soortspecificiteit kwesties aan te pakken, wetenschappers werken onder verschillende projecten op basis van stamcellen zoals reprotect, ESNATS, detective etc. zijn bezig met de ontwikkeling van verschillende modellen voor embryonale toxiciteit, neurotoxiciteit, cardiotoxiciteit, hepatotoxiciteit en nefrotoxiciteit met menselijke toxische stoffen verdacht invloed op de mens. Onder het Europese consortium project 'embryonale stamcel-gebaseerde roman van alternatieve testmethoden (ESNATS) hebben vijf testsystemen vastgesteld. Een testsysteem de zogenaamde UKK (U niversitäts k linikum K OLN) testsysteem gedeeltelijk vangt vroege humane embryonale ontwikkeling. In dit system menselijke embryonale H9 cellen worden gedifferentieerd tot drie kiembladen (ectoderm, endoderm en mesoderm) 15 en kiemlaag specifieke handtekeningen zijn gevangen genomen door transcriptomics profiel met de Affymetrix microarray platform. Verschillende ontwikkelings toxische stoffen zoals thalidomide 28, valproïnezuur, methylkwik 16,17 of cytosinearabinoside 15 werden getest in dit systeem en de toxische specifiek gen handtekeningen zijn verkregen. In een tweede test-systeem, de zogenaamde de UKN1 (U niversiteit van K onsta n z) testsysteem 1, wordt H9 cellen gedifferentieerd om neuroectodermale voorlopercellen (NEP) voor 6 dagen. Dit blijkt uit een hoge expressie van neurale gen merkers zoals PAX6 en OTX2. Tijdens de differentiatie gedurende 6 dagen, NEP-cellen blootgesteld aan ontwikkelingsstoornissen neuro-toxische stoffen zoals VPA, methylkwik. Giftige stof-specifieke-de gereguleerde transcriptomics profielen obtai geweestevenals ned met behulp van de Affymetrix microarray platform 16,29.

De nieuwe visie voor toxicologie van de 21e eeuw wordt ervan uitgegaan dat testsystemen niet alleen fenotypische beschrijvingen opleveren zoals histopathologie in vivo, of transcriptoom veranderingen aan het eind van de lange termijn giftige stof incubaties. Het eerder suggereert dat assays bieden mechanistische informatie 3, en dat deze informatie kan worden toegewezen aan de zogenaamde negatieve uitkomst paden (AOP), dat een wetenschappelijke rationale voor gevaarlijke effecten 30. Om dergelijke informatie te verstrekken, de toegepaste testsystemen moeten worden zeer kwaliteit gecontroleerd 31, zoals bijvoorbeeld gedocumenteerd door robuuste standaard operatie procedures. Bovendien moeten tijdsafhankelijke veranderingen in kaart te brengen met een hoge resolutie. Dit vereist testsystemen met gesynchroniseerde veranderingen 32. De hier beschreven UKN1 en UKK testsystemen zijn geoptimaliseerd voor deze eisen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol werd uitgevoerd met behulp van menselijke embryonale stamcellen lijn (hESC) H9. Deze cellijn was routinematig gekweekt op mitotisch geïnactiveerde muis embryonale fibroblasten (MEF) in hESC cultuur media, aangevuld met bFGF en vervolgens gekweekt in stamcel media op 6 cm Petri platen bekleed met basaal membraan matrix zoals matrigel, om zich te ontdoen van MEF. De H9 cellen van> 80% confluente platen werden gebruikt voor verdere passage. H9 cellen gekweekt op basaal membraan matrix platen werden gebruikt voor de vorming van EBS. Alle in het volgende protocol genoemde procedures zijn uitgevoerd met behulp van standaard methoden voor aseptische en goede celcultuur praktijken.

Deel 1. UKK-test System

1. menselijke embryonale stamcellen kweken

  1. Splitsing en onderhoud van H9 op voedingscellen
    1. Pipetteer 2 ml 0,1% gelatine in elk 6 cm plaat en incubeer gedurende 30 minuten in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2). Zuig gelatine-oplossing met een steriele Pasteur pipet.
    2. Voeg 2 ml MEF medium dat 0,1 x 10 6 MEF cellen / ml in beide gelatine beklede platen en incubeer ze in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) O / N.
    3. Op de volgende dag, verwijder de H9 cellen flesje uit de vloeibare stikstof opslagtank met behulp van een tang en ontdooien van de flacon in een 37 ° C waterbad met lange tang.
    4. Haal het flesje uit waterbad, bad met 70% ethanol, drogen in de bioveiligheid kast 15 tot 30 seconden en breng de cellen 15 ml Falcon buis.
    5. Voeg 9 ml H9 kweekmedium langzaam aan de binnenwand en centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 min.
    6. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 6 ml kweekmedium met ROCK-remmer (10 uM, Y27632) en voorzichtig pipet te mengen. Zuig MEF medium van de 6 cm plaat en voeg 3 ml celsuspensie in elke plaat. Verander het medium op day 3 en vervolgens om de andere dag. Subcultuur> 80% confluent plaat cellen met split verhouding 1: 3.
      Opmerking: Meestal in 5 tot 7 dagen plaat wordt confluent. Feeders gebruikt worden verkregen uit CF1 muizen embryo en geïnactiveerd door blootstelling aan straling γ.
  2. H9 cel kweken op basaal membraan matrix gecoate platen
    1. Thaw stamcel medium (5x) supplement bij RT en voeg 100 ml in 400 ml basismedium in bioveiligheid kast.
    2. Thaw basaal membraan matrix op ijs. Voeg stelde volume van basaal membraan matrix (zie certificaat van de analyse voor elke partij) in 24 ml gekoelde DMEM / F-12 basaal medium voor twaalf 6 cm platen. Meng door en neer te pipetteren.
    3. Voeg 2 ml in elk 6 cm plaat. Laat de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verwijder het medium en voeg 2 ml van stamcel medium.
    4. Neem vier confluent H9 platen op MEF. Verwijder de gedifferentieerde koloniën met 1 ml pipetpunt onder stereomicroscoop in bioveiligheid kast gehouden.
    5. Aspirerenhet medium en was de cellen met 4 ml PBS en voeg 2 ml stamcel medium in elke plaat. Snijd de ongedifferentieerde kolonies met 26 G naald in 6 tot 9 stuks elk.
    6. Voorzichtig het verzamelen van de cellen in 50 ml falcon buis. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
    7. Zuig het supernatant en resuspendeer in 12 ml stamcel medium. Tel de bosjes door de invoering van 20 ui op glas dia onder de microscoop en het volume voor 150 klonten per ml aan te passen. Voeg 2 ml suspensie in elke 6 cm plaat.
    8. Beweeg de platen heen en weer en side-to-side ontwerp gelijkmatige massa distributie en incubeer de platen in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2).
    9. Verwijder de gedifferentieerde koloniën en geef medium veranderen elke andere dag.

2. embryoiden Bodies (EBS) Formation

Voer alle hieronder genoemde als per aseptische voorzorgsmaatregelen en in de bioveiligheid kast procedure.

  1. Day 0 & #8212; Plating van H9 cellen op V bodemplaten
    1. Bereid 5% blokcopolymeer zoals Pluronic F-127 in PBS en filteren door middel van vacuüm gedreven filtratie-systeem met behulp van 0,22 pm steriel filter.
    2. Coat V bodem 96 putjes met 40 pl 5% blokcopolymeer per putje en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 45 min.
    3. Verwijder de samenvloeiing basaal membraan matrix borden met H9 cellen van incubator en verwijder de gedifferentieerde koloniën met 1 ml pipetpunt onder stereomicroscoop in bioveiligheid kast.
    4. Zuig het medium en spoelen van de cellen met 4 ml PBS. Voeg 2 ml willekeurige differentiatie medium (H9 kweekmedium zonder bFGF, RD gemiddeld) in elke plaat. Gebruik passage gereedschap en snijd de H9 celkolonies in groepjes van gelijke grootte en vorm door het observeren onder stereomicroscoop in bioveiligheid kast en dan zachtjes te schrapen met de cel schraper.
    5. Verzamel de klonten in 50 ml Falcon buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de cell in RD middellange tot 1.000 klonten per ml te krijgen.
    6. Zuig het blokcopolymeer van V bodemplaten. Giet de bosjes in steriele vierkante plaat en met behulp van meerkanaalspipet voeg 100 ul van schorsing aan elk putje van V bodemplaat.
    7. Voor de kracht aggregatie van klonten gecentrifugeerd met V bodem platen bij 4 ° C gedurende 4 min bij 400 x g. Incubeer de platen in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) gedurende vier dagen.
  2. Dag 4 - Het verzamelen van EBS
    1. Verzamel de EBS in de steriele vierkante plaat van V bodemplaten met meerkanaalspipet en wijde boring 200 pi tips.
    2. Verzamel de EBS uit steriele vierkante plaat in 15 ml falcon buis met 10 ml steriele serologische pipet. Laat EBS te regelen voor 2 min. Zuig het supernatant en was de EBS met 5 ml PBS.
    3. Laat EBS te regelen voor 2 min en zuig het supernatant. Re-schorten EBS in 5 ml RD medium.
    4. Pipet out 10 ml RD medium in 10 cmbacteriologische platen. Breng de EBS in 10 cm bacteriologische platen.
    5. Incubeer bacteriologische platen horizontaal schudapparaat (heen en weergaande beweging 50 / min) gehouden celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) voor de vereiste tijdsperiode. Geef medium verandering (15 ml RD gemiddeld) om de andere dag.
      Opmerking: Gentle hantering noodzakelijk is, terwijl het kweken hESCs. De grootte van EBS varieert op dag 4. Selecteer de uniforme grootte EBS (± 20%) door het observeren onder stereomicroscoop voor verdere experimenten. Ongeveer 50% EBS gevormd met deze werkwijze zijn van gelijke grootte. De overdracht van EBS op shaker resultaten in uniform vorm.

3. cytotoxiciteitstest voor IC 10 Bepaling

  1. Overdracht van EBS op optische bodemplaten
    1. Ontdooi 0,1% gelatine in een waterbad op 37 ° C gedurende 15 min en vacht optische bodemplaten met 50 pi 0,1% gelatine per putje gebruikt multichannel pipet. Incubeer de platen bij KT45 min. Na incubatie zuig het gelatine van optische bodemplaten.
    2. Neem de verzameld op dag 4 in 10 cm bacteriologische plaat met RD medium EBS.
    3. Houd optische bodemplaten in schuine positie in bioveiligheid kast. Transfer twee uniforme grootte van EBS in 100 ul RD medium per putje in optische bodem 96 wells plaat door het observeren onder stereomicroscoop. Houd 12 ste kolom leeg.
    4. Incubeer de platen in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) gedurende 24 uur.
  2. Blootstelling geneesmiddel van dag 5 tot dag 14
    1. Weeg de testverbinding en maak hoogste concentratie in bekende oplosmiddel.
    2. Voer half-logaritmische verdunning van de testverbinding tot 8 serie verdunningen in het oplosmiddel dat falcon buizen genummerd, waarbij A H, houden geen buis. I als vehikelcontrole, buis niet. J als negatieve controle (RD gemiddeld) en de buis niet. K als positief (70% ethanol) controle.
    3. Ontdooi de RD medium in een waterbad bij 37° C gedurende 15 min. Neem 5 ml RD medium elk in 11 steriele falcon buizen label van 1 tot 11.
    4. Overdracht 5 pi oplossing van buis tot buis A K op de buis 1-11 respectievelijk vortex de buizen. Neem de optische bodemplaat uit de incubator en de media verwijder voorzichtig met het gebruik van multichannel pipet.
    5. Voeg 200 ul van de media van de buis nummer 1-11 in de respectieve kolommen van de optische bodemplaat. Geef elke andere dag medium / drug verandering.
      Opmerking: Voor half-logaritmische verdunningen nemen 6,48 ul oplosmiddel in 7 tubes label van 2 tot 8. Van hoogste concentratie buis no.1 overdracht 3 ul aan de buis no.2, vortex en serieel overdragen 3 pi tot volgende buis. Houd buis no.9 voor controle over het voertuig en de buis no.10 voor negatieve controle. Tube no.11 is 70% ethanol.
  3. Dag 14: resazurine belichting en fluorescentiemeting
    1. Dooi RD medium in een waterbad op 37 ° C gedurende 15 min. Voer alle procedure mention hieronder in afwezigheid van licht in de bioveiligheid kast.
    2. Neem 10 ml RD medium in 15 ml buis (A) en voeg de aanbevolen hoeveelheid resazurin reagens en meng door pipetteren. Neem de optische bodemplaat uit de incubator en verwijder alle medium met een multichannel pipet.
    3. Voeg 100 ul van medium van de buis A in elk putje. Incubeer de plaat in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) gedurende 90 min.
    4. Meet de fluorescentie met behulp van spectrofotometer (560 Ex / 590 Em).
  4. IC 10 waarde bepalen
    1. Importeer de waarden in de grafiek pad prisma na het aftrekken van de blanco waarden. Set x-as als dosis en y-as als fluorescentie-eenheden.
    2. Normaliseren van de waarden percentage op het y-as te verkrijgen en te transformeren de waarden (x-as als log schaal). Bereken IC 50 waarde met sigmoïdale dosis-respons parameter (variabele helling). Bereken log IC 10 waarden met behulp van volgendevergelijking:
      F = 10 logEC 50 = logECF - (1 / hillslope) * log (F / (100-F))
      Y = + Bottom (Boven-Onder) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEC 50 -X) * hillslope))
    3. Bepaal de IC 10 waarden die moeten worden genomen voor verder onderzoek.

4. Biomarker studie op basis van Microarrays

  1. Dag 0 tot dag 5:
    1. Embryoid lichaam vorming en de transfer naar 10 cm bacteriologische platen - volg de in punt 2 voor embryoid lichaam formatie genoemde stappen.
      Opmerking: Gebruik drie biologische herhalingen voor elke studie. Verdeel elke biologische repliceren in twee delen - de behandeling op het IC 10 concentratie en controle over het voertuig Drug. Bereid drug concentratie van 10.000 voudige boven de IC 10-concentratie in het voertuig en van deze voeg 10 ul tot 100 ml RD medium met H9 cel klonten in 50 ml Eppendorf buisje goed mengen en zaad het op V bodemplaten. Volg dezelfde procedure voor het voertuig controle-groep.
  2. Voor de blootstelling aan het geneesmiddel op dag 5 tot 14, het verzamelen van de EB's en over te brengen in 10 cm bacteriologische platen op dag 4 volgens de in punt genoemde stappen 2. Breng de platen op horizontale shaker (heen en weer bewegende 50 / min) in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) gedurende 14 dagen. Geef elke andere dag medium verandering.
  3. Voor monstername, op dag 14, het verzamelen van de EBS van 10 cm platen in 15 ml falcon buis met een steriele serologische pipet. Laat EBS te regelen voor 2 min. Zuig het supernatant en was de EBS met 5 ml PBS. Laat EBS te regelen voor 2 min en zuig het supernatant. Resuspendeer EBS in 1 ml RNAlater oplossing of TRIzol reagens, vortex en bewaar het monster bij -80 ° C tot verdere verwerking.
    Opmerking: Voer alle procedure in bioveiligheid kast als per goede laboratorium praktijken. Draai de platen cirkelvormige beweging rond het midden naar alle EBS midden in het medium rondom met behulp van steriele glazen paštu brengen zuigenre pipet, voeg 15 ml RD medium en voeg 15 ul van drug / voertuig voor het desbetreffende groep.

5. RNA isolatie en betrouwbaarheidstoetsing

  1. RNA isolatie:
    Het merendeel van de onderstaande stappen zijn voor RNA-zuivering met gebruik van RNeasy Mini Kit volgens de handleiding wordt uitgevoerd. Gebruik altijd nuclease gratis buizen, pipetpunten en water. Tijdens het werken met TRIzol voeren alle procedure in de chemische veiligheid motorkap en draag beschermende bril evenals chemische beschermende handschoenen.
    1. Ontdooi de monsters op ijs. Indien monsters worden opgeslagen in RNAlater oplossing gecentrifugeerd buizen bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml TRIzol reagens.
    2. Vermaal de monsters met behulp van 24 G naald en 1 ml spuit. Ongeveer 15 maal tritureren voldoende was voor het breken van EBS, celwanden en plasmamembranen.
    3. Voeg 200 ul chloroform in elk monster. Vortex de inhoud uniform te mengen. Centrifugebij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder de RNeasy mini spin-kolommen, 1,5 ml buizen en label ze goed.
    4. Verzamel de bovenstaande vloeistof in 1,5 ml buizen (terwijl het verzamelen van bovenstaande niet de middelste of onderste laag niet storen). Voeg gelijke volume van gekoelde 70% ethanol. Meng de inhoud door zacht schudden.
    5. Breng 700 pi van de respectievelijke buizen tot mini spinkolommen en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 seconden bij KT. Voer alle verdere stappen bij KT.
    6. Werp het filtraat en de overblijvende oplossing toegepast op de respectieve kolommen en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 sec. Gooi het filtraat.
    7. Breng 350 ui buffer RW1 aan de kolom en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 sec. Werp het filtraat en 10 ul DNAse en 70 gl buffer RDD toepassing op de kolom.
    8. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Breng 350 ui buffer RW1 aan de kolom en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 sec. Gooi het filtraat. Breng 500 piRPE wasbuffer aan de kolom en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 sec. Gooi het filtraat. Opnieuw Breng 500 pi van RPE wasbuffer aan de kolom en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 2 min. Gooi het filtraat.
    9. Verschuiving van de kolommen om nieuwe 2 ml collectie buizen en centrifuge ze op 12.000 xg gedurende 1 minuut. Breng de kolommen gelabelde 1,5 ml collectie buis en 22 ul van nuclease gratis water toe te passen. Centrifugeer de buisjes bij 12.000 xg gedurende 1 min.
    10. Verwijder de collectie buis en leg ze op ijs. Kwantificeren RNA met behulp van geautomatiseerde elektroforese systeem.
  2. RNA-concentratie, zuiverheid en integriteit testen.
    Voor RNA zuiverheid en integriteit van het testen van het gebruik van geautomatiseerde elektroforese systeem en de bijbehorende kit 33.

6. Microarray Studies

  1. Voer transcriptie profiling met behulp van commerciële beschikbaar Human scala chips. Voor RNA-doelwit voorbereiding, fragmentatie, hybridisatie 34 en scalachip vlekken, wassen 35 gebruik in de handel verkrijgbare kits.
  2. Voer scala chip scannen en kwaliteitscontrole door het gebruik van standaard fluidics station, array scanners en standaard operationele software 36. Voor de analyse van genexpressie importeren gegenereerd uit scanners aan de standaard in de handel verkrijgbare software 37 bestanden, voeren achtergrond correctie, samenvatten en normalisatie met robuuste Multi-array analyse (RMA).
  3. Voor het verkrijgen van de lijst van differentieel tot expressie van genen (DEG's) voert u een ANOVA analyse. Uit deze lijst wegfilteren genen op basis van de veelvoudverandering (± 2) en FDR-gestuurde p-waarde (<0,05). Het verkrijgen van de Principal Component Analysis (PCA), Heat Map, etc. met behulp van deze software.

Deel 2. UKN 1 Test System

1. Onderhoud van hESC

  1. Zaaien van MEF
    1. Voor de differentiatie gebruik de NSCB # 8534 (H9) cellijn. Cultuur cells op muis embryonale fibroblasten (MEF) als voedingscellen. Coat T25 kolf met 4 ml 0,1% gelatine en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    2. Dooi MEFs in 37 ° C waterbad en breng de cellen in voorverwarmde DMEM / 10% FBS.
    3. Spin 3,5 min bij 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen tot 1 x 10 7 cellen / ml te verkrijgen. Plaat MEF 4 x 10 4 / cm 2 in T25 flessen op gelatine. Eventueel gebruikt de MEF de volgende twee dagen. Kwaliteit van MEF partijen zijn een zeer kritisch onderwerp voor hESC onderhoud. Daarom is het raadzaam om het beste bedrijf en bereidingswijze verhelderen van de H9 cellen. We gebruiken PMEF P3.
  2. Splitsen en onderhoud van H9
    1. Voeg 1 ml voorverwarmde dispase per T25 fles H9 en incubeer 9 min bij 37 ° C.
    2. Voeg 2 ml wasmedium te behandelen cellen en pipet 5 keer op en neer met een 5 ml pipet en transfercel oplossing voor een Falconbuis Dispase.
    3. Was de kolf met 9 ml wasmediumen cellen aan anderen. Spin 3,5 min bij 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 10 ml hESC medium.
    4. Spin 3,5 min bij 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 4 ml hESC medium. Voeg 0,5 ml celsuspensie en 4,5 ml hESC medium en plaat in een nieuwe (PBS gewassen) T25 fles met MEF. Verander elke dag volledige hESC medium (5 ml) van de kolf.

2. Differentiatie van hESC richting neuroectodermale Progenitor Cells (NEP)

  1. Bereid hESC medium en KCM medium. Coat een 10 cm schaal met gelatine (0,1% in PBS) per T25 fles en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Verwijder medium uit hESC toevoegen Accutase genoeg om de hele bodem van het vat (1 ml per T25 fles) te bedekken en incubeer 25-30 minuten bij 37 ° C.
  2. Bereid basaal membraan matrix gecoate platen tijdens Accutase incubatie. Voeg koude DMEM / F12 op bevroren basaal membraan matrix pellet en oplossen 01:20. Filter basaal membraan matrix solutie door een 40 um cel zeef. Toevoegen gefiltreerde oplossing aan de plaat, de gehele bodem bedekt moet worden (1 ml per 6 putjes vereist) en incubeer gedurende 2 uur bij KT.
  3. Na incubatietijd verwijder het basaal membraan matrix supernatant en zaad cellen op de beklede putjes. Na Accutase stap (2.1) stopt de reactie door toevoeging van 1,5 ml HES medium. Schraap cellen uit de kolf, voeg 8 ml hESC medium en produceren van een enkele cel oplossing door pipetteren met een 10 ml pipet grondig. Filter cellen door een 40 um cel zeef.
  4. Spin cellen 3 min met 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 10 ml van hESC. Spin cellen weer 3 min met 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in hESC met ROCK-remmer Y-27632 bij een uiteindelijke concentratie van 10 uM.
  5. Verwijder supernatant gelatine gecoate schaal. Plate celsuspensie op gelatine gecoate schotel naar de MEF te verwijderen en laat in de incubator voor exact 1 uur.
    LET OP: Tijdens deze stap van de MEF zal settle op de gelatine gecoate plaat, terwijl de hESC niet kan hechten aan gelatine. Daarom is dit cruciaal voor een feeder-vrije differentiatie te verkrijgen. Het is een cruciale stap als te lange incubatietijd resultaten in hESC klonten en te korte incubatie in inefficiënte verwijdering van MEF. Na 45 min incubatie de plaat moet worden onderzocht voor al geregeld MEF en hESC klonten.
  6. Wanneer de MEF hebben gehecht, voorzichtig te wassen niet-hechtende cellen (hESC) na incubatie met het medium reeds in de plaat. Als meerdere T25 werden gebruikt om meer cellen te krijgen, enkele cellen kunnen nu worden gecombineerd. Was plaat eenmaal met hESC medium.
  7. Spin cellen 3 min bij 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in ongeveer 4 ml KCM met 10 pM ROCK remmer Y-27632 en 10 ng / ml FGF-2.
  8. Tellen cellen in een hemocytometer met trypaanblauw. Plate 18 x 10 3 cellen / cm2 op basaal membraan matrix gecoate platen in KCM met 10 pM ROCK-remmer Y-27632 en10 ng / ml FGF-2 (voor 6 zowel gebruik 1,5 ml per putje). Het is cruciaal om de cellen in de juiste dichtheid plaat om ze succesvol differentiëren in NEPs.
  9. Na 24 uur, veranderen medium om verse KCM met 10 uM ROCK-remmer Y-27632 en 10 ng / ml FGF-2. Na nog eens 24 uur, veranderen medium om verse KCM met 10 ng / ml FGF2.
  10. 72 uur na het zaaien van de cellen, differentiatie begint met het medium verandering naar KSR medium. Dit tijdstip is aangeduid als dag 0 van differentiatie (DoD0). Toevoeging van teststoffen is nu mogelijk.
  11. Op DoD1 en DoD2 het medium is veranderd precies zoals op DoD0. Volgende medium verandering is op DoD4 met 25% N2-S en 75% KSR. Bij DoD6 de differentiatie gestopt en de cellen geoogst voor analyse.

3. Chromatine Immunoprecipitatie (chip) van hESC en NEP

  1. Bereiding van kernen
    1. Voeg 500 ul Accutase aan elk 6 vormt dat moet worden geanalyseerd en incubeer gedurende 25 tot 30 min. Count cellen in een Neubauer kamer met behulp van trypan blauw.
    2. Resuspendeer cellen in 1% formaldehyde in DMEM / F12 voor verknopen. Voeg Tris pH 7,5 tot een eindconcentratie van 125 mM na 10 minuten de verknoping te stoppen.
    3. Spin cellen 3 min bij 500 xg bij 4 ° C, verwijderen van supernatant en resuspendeer cellen in koude PBS.
    4. Spin cellen 3 min bij 500 xg bij 4 ° C, verwijderen van supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml buffer L1 / 1 x 10 6 cellen.
    5. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Spin 5 min bij 800 xg bij 4 ° C, verwijderen van supernatant en resuspendeer kernen in 1 ml L2- buffer / 2 x 10 6 cellen.
  2. Sonicatie en kwaliteitscontrole
    1. Ultrasone trillingen waardoor DNA fragmenten van 300-700 bp lengte gegenereerd. Spin 1 min bij 10.000 xg bij 4 ° C. Breng supernatant naar een nieuwe buis. De fragmenten moeten de juiste afmeting hebben, aangezien anders de immunoprecipitatie inefficiënte en de gevolgde qPCR zijn.
    2. Verwijder 50 ul eend mix met 50 ul L2 buffer om de efficiëntie van de sonificatie controleren door een agarosegel.
    3. Reverse verknopen door incubatie bij 65 ° C gedurende 4 uur en 500 rpm. Load monsters 1: 5 met Oranje G laadkleurstof op een 1,5% agarosegel en lopen 45 min bij 110 V in 1x TBE buffer. Controle fragmentgrootte (moet tussen 300-700 bp).
  3. Chromatine Immunoprecipitatie
    1. Verdunnen monsters 1: 5 in verdunningsbuffer en aliquot 1 ml per IP in gesiliconiseerde buizen.
    2. Verwijder 5% (volume) van verdunde chromatine monster (stap 3.3.1) en bewaar bij 4 ° C als "input".
    3. Incubeer monsters met antilichamen van uw keuze en met een niet-specifieke IgG O / N bij 4 ° C op een rotator.
    4. Voeg 50 ul Proteïne-A / G Sepharose beads aan elk monster na immunoprecipitatie. Incubeer de monsters 3 uur bij 4 ° C op een rotator. Spin 1 min met 1500 xg bij 4 ° C en verwijder supernatant.
    5. Wassen met 1 ml wassen kralen. Spin 1 min met 1500 xg bij4 ° C en verwijder supernatant. Herhaal stap g naar h. Wassen met 1 ml uiteindelijk wasbuffer. Tijdens de stappen die het wassen moet je niet verliest een van de parels, omdat deze verandert de hoeveelheid eluaat direct.
    6. Centrifuge 1 min met 1500 xg bij 4 ° C en verwijder supernatant. Voeg 125 ul elutiebuffer en incubeer 15 min bij 65 ° C bij 1000 rpm op een schudtafel.
    7. Spin 1 min bij 1.500 x g en breng supernatant naar een nieuwe buis Herhaal stap k en l. Voeg 200 pl elutiebuffer toe aan (3.3.2). Voeg Proteinase K en RNase aan elk monster en incubeer 30 min bij 37 ° C bij 500 rpm op een schudmachine en vervolgens 4 uur bij 65 ° C bij 500 rpm op een schudtafel.
      LET OP: Voor DNA-extractie gebruik commercieel verkrijgbaar ChIP DNA Schoon en Concentrator Kit 38.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Methylkwik exposure in UKK testsysteem

De cytotoxiciteit bepaling werd uitgevoerd met H9 EBS een IC 10-waarde (vermindering van de levensvatbaarheid van 10%) voor de cytotoxiciteit van methylkwik (Fig 1) te verkrijgen. We voerden ook een microarray gebaseerde (Affymetrix platform) biomerker studie. De H9 EBS blootgesteld aan methylkwik (0,25 en 1 uM) gedurende 14 dagen. Op dag 14 zijn monsters gebruikt TRIzol verzameld en RNA werd geïsoleerd. Transcriptie profiler...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionele benaderingen voor toxicologische tests op uitgebreide dierstudies waardoor testen kostbaar en tijdrovend. Bovendien kan door de interspecies verschillen preklinisch veiligheid bij dieren niet altijd geldig toxische effecten van potentiële geneesmiddelen relevant voor de mens voorspellen. Hoewel niet-menselijke primaten zijn meest voorspelbare, nog steeds sterk ethische en socioeconomical eisen snel verhogen door de moderne samenlevingen voor het ontwikkelen van gevoelige en robuuste in vitro-test <...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani en Cornelia Böttinger voor uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Duitse Onderzoeksstichting (RTG 1331) en het Duitse Ministerie voor Onderzoek (BMBF).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM/F-12Life Technologies11320082Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSRLife Technologies10828028Knockout Serum Replacement
GlutaMAXLife Technologies35050061GlutaMAX supplement
NEAALife Technologies11140050MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBSLife Technologies14190-0144Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR mediumStemcell Technologies5850
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
V bottom plateVWR734-0483Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lidVWR634-0011Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/StrepLife Technologies15140-122Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled WaterLife Technologies15230-089.Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF)MilliporeGF003AF-100UGFibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μmMilliporeSCGPU02REStericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM DisposablteInvitrogen23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified MatrixStemcell Technologies3542775 ml vial
DMSOSigmaD-2650
RNAlater Stabilization SolutionLife TechnologiesAM7020It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell StrainerBecton Dickinson352350Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tubeBecton Dickinson3522355 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tubeGreiner Bio-One22726150 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flaskGreiner Bio-One658175CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzolLife Technologies10296010
96 well optical bottom platesThermo Scientific165305
CellTiter-BluePromegaG8081
AccutasePAAL11-007
ApotransferinSigma-AldrichT-2036
DispaseWorthington BiochemicalsLS002104
DorsomorphinTocris Bioscience3093
EDTARoth8043.2
FBSPAAA15-101
FGF-2R&D Systems233-FB
GelatineSigma-AldrichG1890-100G
GlucoseSigma-AldrichG7021-100G
GlutaMAXGibco Invitrogen35050-038
HEPESGibco Invitrogen15630-056
InsulinSigma-AldrichI-6634
Knockout DMEMGibco Invitrogen10829-018
MatrigelBD Biosciences354234
NogginR&D Systems719-NG
PBSBiochrom AGL1825
ProgesteronSigma-AldrichP7556
PutrescineSigma-AldrichP-5780
ROCK inhibitor Y-27632Tocris Biosciences1254
SB431542Tocris Biosciences1614
SDSBio-Rad161-0416
SeleniumSigma-AldrichS-5261
β-MercaptoethanolGibco Invitrogen31350-010
[header]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain KitAffymetrix900721, 22, 23This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase SetQIAGEN79254
[header]
List of equipment
Inverted microscopeOlympusIX71
Genechip Hybridisation Oven - 645Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 GAffymetrix
Spectramax M5Molecular Devices
 
 
 
[header]
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation
DAVID
Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
  2. Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
  3. Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
  4. Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
  5. Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
  6. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  7. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
  8. Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
  9. Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
  10. Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
  11. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
  12. Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
  13. Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
  14. Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
  15. Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
  16. Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
  17. Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
  20. Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
  21. Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
  22. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
  23. Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
  24. Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
  25. Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
  26. Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
  27. Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
  28. Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
  29. Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
  30. Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
  31. Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
  32. Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
  33. Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
  34. Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
  35. Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
  36. Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
  37. Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
  38. ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
  39. Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Humane pluripotente stamcellenvorming van embryo de lichaampjesdifferentiatie van neuroectodermale progenitorcellentranscriptome microarray analysevroege embryonale ontwikkelingneurale ontwikkelingstoxiciteitidentificatie van toxiciteitsbiomarkers

Gerelateerde artikelen