Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.
Methodenartikel
Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Respirometrische profilering van geïsoleerde mitochondriën wordt vaak gebruikt om elektronen transportketen functie te onderzoeken. We beschrijven een methode voor het verkrijgen van monsters van menselijke Vastus lateralis, het isoleren van mitochondriën van minimale hoeveelheden van de skeletspier weefsel, en de plaat gebaseerd respirometrische profilering met behulp van een extracellulair flux (XF) analyser. Vergelijking van respirometrische profielen verkregen met 1,0, 2,5 en 5,0 ug mitochondria geven aan dat 1,0 ug voldoende is om ademhaling te meten en dat 5,0 ug levert gelijkmatig resultaat gebaseerd op vergelijking standaardfouten. Western blot analyse van geïsoleerde mitochondria voor mitochondriële marker COX IV en niet-mitochondriale weefselmarkeerder GAPDH geven dat er beperkte niet-mitochondriale verontreinigingen door dit protocol. De mogelijkheid om mitochondriale respirometry bestuderen in slechts 20 mg spierweefsel kunnen gebruikers individuele biopsieën voor meerdere eindpunten in klinische gebruikonderzoeksprojecten.
Inleiding
Mitochondriën zijn de primaire energieproductie sites in de cel een belangrijke rol bij veroudering en diverse leeftijd gerelateerde aandoeningen zoals cardiovasculaire aandoeningen, ziekte van Alzheimer, diabetes, kanker, en obesitas. Respirometrische profilering van geïsoleerde mitochondriën biedt een directe analyse van elektron transport keten (ETC) functie en heeft een belangrijke bijdrage geleverd aan ons begrip van mitochondriale biologie en haar rol in gezondheid en ziekte. Geïsoleerde mitochondria worden gebruikt om verschillende aspecten van bio-energetica zoals, substraattransport, ATP synthase activiteit, proton lek, etc. De in deze handschrift beschreven methode is geoptimaliseerd respirometrische analyse van mitochondria geïsoleerd uit skeletspier weefsel biopsieën verkregen bij proefpersonen toe te bestuderen. De biopsie protocol in dit manuscript beschreven werd gebruikt door onze medewerkers voor de afgelopen 12 jaar. Onze groep heeft uitgevoerd meer dan 700 procedures op volwassenen van verschillende leeftijden,tot 90 jaar oud, en verschillende chronische ziektetoestanden zonder nadelige veiligheid. Een belangrijk aspect van dit protocol is dat het specifiek is ontworpen om minimale hoeveelheden weefsel te gebruiken, waardoor het gebruik in klinische studies te vergemakkelijken.
Verschillende protocollen ontwikkeld voor het isoleren mitochondria. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 beschreef een werkwijze voor het isoleren mitochondriën uit verschillende rattenweefsels en gekweekte cellen. Garcia-Cazarin et al. 3 heeft een werkwijze voor het isoleren mitochondria uit skeletspieren van ratten en muizen gerapporteerd. Werkwijze voor het isoleren mitochondria uit rattenhersenen werd ook gerapporteerd door Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. Rapporteerde een 5 werkwijze voor het isoleren mitochondria met de barocycler en / of PCT shredder. Recentelijk Franko et al. 6 meldde een werkwijze voor het isoleren sterk verrijkt mitochondriën met anti-TOM22 Magnetische korrels.
Hoewel deze protocollen leveren uitstekende resultaten, weefsel grootte eisen zijn hoog in vergelijking met de in dit manuscript beschreven methode. Bijvoorbeeld, Gross et al. 5 gebruikt 1,5-1,8 g gastrocnemius en ongeveer 2 g van het nierweefsel. Evenzo Franco et al. 6 gebruikt 500 mg muis leverweefsel. Vanuit onze ervaring, typische opbrengsten die worden verwacht van percutane naaldbiopsie van de skeletspieren (vastus lateralis) range 100-200 mg. De mogelijkheid om mitochondriale functie getest 20-50 mg spierweefsel volgens de hieronder beschreven protocol laat gebruikers meerdere bepalingen uit te voeren per biopsie en opslaan monsters voor toekomstig gebruik in andere moleculaire biologische experimenten. Dit is een cruciale functie in klinisch onderzoek en andere studies die ijverig gebruik van samples nodig. Opgemerkt moet worden dat eerder bevroren mitochondria niet goed voor het bestuderen gekoppeld ademhaling door outer mitochondriale membraan schade en verlies van cytochroom C-activiteit. Onze werkwijze is aangepast en gewijzigd vanaf de methode gepubliceerd door Chappell en Perry 7.
Met behulp van de in dit manuscript beschreven methoden, hebben we onlangs gemeld dat de respirometrische profiel van mitochondriën geïsoleerd uit menselijke Vastus lateralis is direct gecorreleerd met fysieke vermogen, gemeten als loopsnelheid 8.
Protocol
OPMERKING: De beschreven werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van Wake Forest School of Medicine protocol. Geïnformeerde toestemming werd verkregen schriftelijk. Alle deelnemers waren gezonde oudere volwassenen (65-79 jaar) van beide geslachten, met BMIs variërend 23-35.
1. Skeletal spierbiopsie
- Zoals eerder beschreven, 9 voer alle biopsies in de vroege ochtend na een O / N fast. Vraag de onderwerpen afzien van aspirine, recept en over-the-counter niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen of andere verbindingen die bloeden, bloedplaatjes of kneuzingen kunnen beïnvloeden de week voor de biopsie. Vraag de deelnemers om ook onthouden van elke inspannende activiteit voor ten minste 36 uur voorafgaand aan de biopsie.
OPMERKING: Spier verkregen uit de vastus lateralis met de percutane naald biopsie techniek een percutane naald onder plaatselijke verdoving met 1% lidocaïne. Geen medische complicaties of other gemelde bijwerkingen van de procedure hebben voorgedaan in onze klinische onderzoekseenheid. - Opmerking: De beschreven biopsie procedure wordt aangepast van die van Bergstrom 10.
- In het kort, lokaal toe te dienen 1% lidocaïne verzorgen de spieren niet te infiltreren. Volg deze met een 10 minuten wachttijd om voldoende verdoving toe.
- Neem de biopten uit de buik van de spier (de middelste gebied van de spier tussen het inbrengen en herkomst) vermijden subfascial en myotendonous gebieden.
- Gebruik percutane naald (een zuig bijgestaan herbruikbare apparaat met een kant snijden raam en innerlijke snijden cilinder) en volgen een fasciaal "pop" of weerstand van de fascia als een gids.
- Schat de diepte van de anesthesie naald, dan weer het gevoel dat het met de smalle scalpel en maak een 4-5 mm incisie door de fascia. Vooraf de naald door de incisie totdat deze in de spier geplaatst.
- Verzamelenmeerdere monsters met het raam gedraaid in verschillende richtingen. Solliciteer continue zuigkracht met een 60 cc spuit en bevordert tegelijk of intrekking van spieren monsters in de percutane naald twee tot vier keer in verschillende richtingen. Staak de zuig- en verwijder de naald.
OPMERKING: Elke pas (inbrengen en verwijderen van de naald) dient minder dan een minuut duren. - Laat een helper van toepassing stevige druk op de bouwplaats te doorboren voor 5 min tot hemostase te vestigen. Koppel naald uit zuig slangen en verwijder voorzichtig de spieren monsters uit het raam en vat.
- Maak een tweede pas als er meer spieren nodig is door het proces te herhalen.
- Verwijder alle zichtbare bloedstolsels van de spier monster met behulp van een tang, weegt het monster, en meteen plaatsen in een buisje met ijskoude DPBS.
OPMERKING: De gemiddelde opbrengst met behulp van deze methode is 150 ± 20 mg.
2. Mitochondriale Isolatie
- Vers bereiden Chappel-Perry (CP) en mitochondriale testoplossing (MAS) buffers (tabel 1) op de dag van het experiment of monster en bewaar ze bij -20 ° C. Bereid de verbindingen in dimethylsulfoxide in een concentratie van 2,5 mM en de hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C. Gebruik de buffer en samengestelde monsters bewaard bij -20 ° C binnen de 2 maanden na de dag van de voorbereiding.
- Verwijder zichtbare bindweefsel van het monster met behulp van een scherpe schaar en pincet; indien nodig gebruik een dissectie microscoop voor deze stap. Grondig te wassen exemplaren 3-4 keer met ijskoude DPBS buffer om bloed te verwijderen. Houd de monsters op ijskoude DPBS en het proces zo snel mogelijk, het verzorgen meer dan 45 min van biopsie niet te overschrijden. Neem voorzorgsmaatregelen om elk pezen of vetweefsel verwijder voorzichtig uit de spier monster.
- Onmiddellijk Hak de spierweefsel in fijne stukjes met een steriele schaar en schorten in 500 pi tot 1 ml CPI met proteinase (Nagarse) bij een concentratie van 0,2 mg / g weefsel. Volg deze met een 5 min incubatie bij kamertemperatuur en vervolgens transfer naar het ijs.
- Homogeniseer gehakt weefsel behandeld met Nagarse een geautomatiseerd homogenisator. Houd het monster op het ijs in dit hele proces. Homogeniseer elk weefselmonster vier keer, telkens met een puls van 2 sec, de geautomatiseerde homogenisator bij een snelheid van 10.000 rpm. Was de sonde met 70% ethanol en vervolgens met gedestilleerd water tussen de weefsels.
- Was het gehomogeniseerde weefsel met een gelijk volume CP I (500 ui 1 ml) en 2x volume CP II (1 ml tot 2 ml), en de inhoud in een centrifugebuis en centrifugeer verzamelen bij 600 xg, 4 ° C 10 min. Passeren de bovenstaande vloeistof op een bevochtigd kaasdoek, het eluaat en gooi de pellet, waardoor het verwijderen van de meerderheid van de niet-mitochondriale fracties.
3. Het wassen van de mitochondriën
- Centrifugeer het supernatant van de bovenstaande stap 10,000 xg, 4 ° C gedurende 10 min. Suspendeer de pellet in 4 ml CP II buffer en verder centrifugeer bij 10.000 xg, 4 ° C gedurende 10 min.
LET OP: In zeldzame gevallen wordt een dunne pellet van bloed onder de mitochondriale pellet gevormd. In dat geval verwijdert u de mitochondriale pellet door behoedzame aspiratie met CPII buffer. Deze stap kan worden vermeden door grondig te wassen weg bloed bij stap 2. - Hang de pellet verkregen in 2 ml van CP I buffer. In dit stadium gebruik maken van een kleine hoeveelheid van deze suspensie voor eiwit schatting. Resuspendeer de resterende monster in CP I buffer en centrifuge zoals hierboven. Suspendeer de uiteindelijke pellet in een minimale hoeveelheid (200 ui) van Mitochondriale testoplossing (MAS).
OPMERKING: Eiwit wordt getest in dit stadium omdat CP-buffer geen BSA, terwijl MAS waarbij de monsters later opgeschort heeft BSA in.
4. Schatting van de mitochondriale inhoud van meten eiwitconcentratie met een BCA Protein Assay Kit
NB: Met deze concentratie de hoeveelheid mitochondriën voor het laden berekend op een 24-well microplaat voor respirometrische metingen of Western blot experimenten. Rekening houden met de verdunningsfactor (10) voor de berekening van de eiwitconcentratie.5. Voer de XF testen zoals beschreven door Rogers, GW, et al. 12
OPMERKING: Visualiseer de O 2 verbruik (OCR) in pMol O 2 / min, of absolute niveaus van O 2 en pH in de data-uitgang.
- Gebruik 1x MAS bereiden van verbindingen te injecteren. Voeg een 10x concentratie van de verbindingen om de poorten AD een eindconcentratie als volgt: poort A, ADP [Adenosine 5'-diphosphate, 2 mM, 50 gl]; poort B, oligomycin (2 uM, 55 pl); poort C, FCCP [carbonyl cyanide 4- (trifluormethoxy) fenylhydrazon, 6 uM, 60 gl]; en poort D, 2 uM antimycin-A (65 pl). Bereidenvoldoende volume van verbindingen voor het vereiste aantal putten.
- Bepaal de optimale hoeveelheid mitochondria door titratie. Bijvoorbeeld, lading 1,0 ug, 2,5 ug en 5,0 ug mitochondriën per putje in een 50 pl volume ijskoude 1x MAS substraat. De variabiliteit tussen de putten te minimaliseren, eerst verdunnen 10x mitochondriën in koud 1x MAS + substraat. Vervolgens leveren 50 ul van deze suspensie aan elk putje (behalve de achtergrond correctie putten).
- Centrifugeer de plaat bij 2000 xg, 20 min bij 4 ° C. Na centrifugeren zachtjes voeg 450 ul van 1 x MAS + succinaat (10 mM) en rotenon (2 uM) (beginwaarden; zie hieronder) aan elk putje. Bekijk de mitochondriën onder de microscoop om homogene naleving van de put voordat ervoor te zorgen dat de overdracht van de plaat om de XF analyser.
OPMERKING: De beginwaarden zal afhangen of de ademhaling wordt aangedreven door ofwel ETC complex I of complex II. Voor complexe-II gedreven ademhaling, gebruik succinate (10 mm) en rotenon (2 uM) als initiële condities. Rotenon blokken complex I en succinaat voorziet brandstof voor complexe II (succinaat dehydrogenase). Ademhaling aangedreven door complexe I studie Gebruik een pyruvaat en malaat, elk bij een eindconcentratie van 5 mM of glutamaat en malaat elk bij een eindconcentratie van 10 mM als beginwaarden. De laatste kan helpen bij het onderscheiden van disfunctie onder citroenzuurcyclus en transport substraat. Ademhaling gedreven door zowel complex I en complexe II studie, onder meer pyruvaat en succinaat zonder rotenon of malaat als beginvoorwaarden. Gebruik palmitoyl carnitine als substraat voor β-oxidatie. - Sequentieel meet de mitochondriale ademhaling in real time via de respirometer door het programmeren van het zoals eerder beschreven 12. Gebruik de instellingen voor de respirometer in Tabel 2.
OPMERKING: Een korte uitleg van de verschillende mitochondriale ademhaling toestanden zijn: - State 2 = gekoppelde toestand met substraat aanwezig; State 3 = fosforyleren ademhaling in aanwezigheid van verzadigende ADP; Staat 4 o = niet-fosforylerende ademhaling veroorzaakt door oligomycin; Staat 3u = maximale ontkoppeld ademhaling gestimuleerd door de ontkoppelrail FCCP; Resterend niet-mitochondriale ademhaling = respiratie van complex III remming door antimycin-A. Voorts zij opgemerkt dat de lengte van de OCR meting in combinatie met de mitochondriale concentratie de gegevens door uitputting zuurstof tijdens de meetperioden kunnen beïnvloeden.
6. Western Blot
OPMERKING: Bepaal de mitochondriale marker COX IV en hele weefsel GAPDH- door Western blotting aan verrijking van de mitochondriën te verzekeren in de uiteindelijke steekproef
- Scheid de geïsoleerde mitochondria en hele weefsel extract met 12% natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gels.
- Overdracht van de eiwitten op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan.
- Incubeer met COX IV antilichaam (1: 20.000), gevolgd door mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichamen. Voor GAPDH- vastberadenheid, strip de vlek en sonde met een GAPDH monoklonaal antilichaam (1: 2.000).
OPMERKING: Als de verschillen in ER verontreiniging van belang zijn, zijn onder andere ER markers zoals ERp72, calnexin, of calreticuline in de analyse.
Resultaten
Figuur 1 toont een gedetailleerd stroomdiagram van het gehele protocol.
Western blot profielen van COX IV / GAPDH (figuur 2) tonen de expressie van het mitochondriale eiwit, COX IV, en de niet-mitochondriale marker, GAPDH. Expressie van zowel COX IV en GAPDH zijn duidelijk in alle spieren lysaat. Na mitochondriën zijn geïsoleerd met behulp van de in dit protocol beschreven techniek, COX IV bands zijn nog steeds zichtbaar, terwijl GAPDH- afwezig is op dezelfde belichting. Langere blootstelling kan een zwakke GAPDH- band onthullen. Deze blots geven aan dat de geïsoleerde mitochondriën een minimale niet-mitochondriale besmetting. Bovendien COX IV expressie in geïsoleerde mitochondriën is consistent tussen de monsters.
Figuur 3 toont typische respirometrische profielen dankzij complex II (succinaat en rotenon) met 1,0 ug, 2,5 ug en 5,0 ug mitochondria. Zoals verwacht, is de algehele OCR verhoogd wi grotere hoeveelheden mitochondria. De berekende respiratoire controle ratio (RCR) voor deze test is 7,95, wat aangeeft dat de mitochondriale voorbereiding is van hoge kwaliteit. Verder staat 3u OCR is iets hoger dan die van de staat 3, bevestigt mitochondriale kwaliteit.
Ter vergelijking consistente resultaten bij profileren verschillende hoeveelheden mitochondria, voerden we ANOVA (variantieanalyse) en berekende de som van kwadraten (SS) als werkelijke waarden van de variantie met 1,0 ug, 2,5 ug en 5,0 ug per mitochondria geladen en (Figuur 4). SS wordt gepresenteerd voor toestand 2, staat 3, staat 3u, antimycin A, en RCR. Voor toestand 2 en 3 staat metingen een ANOVA was statistisch significant (p <0,01 en p <0,05, respectievelijk). Ook de ene ANOVA was statistisch significant voor antimycin en RCR (p <0,01 en p <0,0001, respectievelijk. Geen significant verschil werd gezien staat 3U tussen groepen. These resultaten geven aan dat 5,0 ug mitochondriën per putje gaf de laagste SS vergelijking met andere concentraties en is de optimale hoeveelheid te gebruiken in de XF 24 systeem onze bevolking deelnemers.
Figuur 5 is een leidraad te geven hoeveel mitochondriale eiwit worden verwacht op basis van de oorspronkelijke musculaire steekproef. Zoals verwacht is er een sterke correlatie tussen de hoeveelheid spier (mg) behandeld en het mitochondriale totale eiwitgehalte (mg) van het eindmonster.
| Chappel-Perry buffer I (CPI) | |
| Chemisch | Concentratie |
| KCl | 100 mM |
| MOPS | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| MgSO4 | 5 mM |
| ATP | 1 mM |
| pH | 7.4 |
| Chappel-Perry buffer II (CPII) | |
| Chemisch | Concentratie |
| KCl | 100 mM |
| MOPS | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| MgSO4 | 5 mM |
| ATP | 0.2 mM |
| Vetzuurvrij BSA | 0,50% |
| pH | 7.4 |
| Mitochondriale Assay Solution (MAS) (2X) | |
| Chemisch | Concentratie |
| Sucrose | 35 mM |
| Mannitol | 110 mm |
| KH 2 PO 4 | 2.5 mM |
| MgCl2 | 2.5 mM |
| HEPES | 1,0 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| Vetzuurvrij BSA | 0,10% |
| pH | 7.4 |
| Mitochondriale Assay Solution (MAS) met complexe II beginvoorwaarden | |
| Chemisch | Concentratie |
| 1X MAS | |
| Succinate | 10 mM |
| Rotenon | 2 uM |
| pH | 7.4 |
| Mitochondriale Assay Solution (MAS) met complexe Ik beginvoorwaarden | |
| Chemisch | Concentratie |
| 1X MAS | |
| Pyruvaat | 5 mM |
| Malaat | 5 mM |
| pH | 7.4 |
| * Alle buffers worden in gedeïoniseerd water | |
Tabel 1. Solution en buffer recepten.
| Protocol Stappen | ||
| StartProtocol | ||
| Commando | Tijd (min) | Poort |
| Kalibreren | 0.00 | |
| Wacht | 10.00 | |
| Mengen | 1.00 | |
| Wacht | 3.00 | |
| Mengen | 1.00 | |
| Wacht | 3.00 | |
| Mengen | 0.50 | |
| Maatregel | 3.00 | |
| Mengen | 1.00 | |
| Maatregel | 3.00 | |
| Mengen | 0.50 | |
| Injecteren | Een | |
| Mengen | 1.00 | |
| Maatregel | 6.00 | |
| Mengen | 1.00 | |
| Injecteren | B | |
| Mengen | 1.00 | |
| Maatregel | 3.00 | |
| Mengen | 1.00 | |
| Injecteren | C | |
| Mengen | 1.00 | |
| Maatregel | 3.00 | |
| Mengen | 1.00 | |
| Injecteren | D | |
| Mengen | 1.00 | |
| Maatregel | 3.00 | |
| EndProtocol | ||
Tabel 2. Mix, meten en meng cyclus instelling voor de respirometer.
Figuur 1. Stroomschema van het gehele protocol. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
/ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg "/>
Figuur 2. Een representatieve Western blot voor volle skeletspierweefsel en geïsoleerde mitochondria. Totaal weefselextract en geïsoleerde mitochondriën werden immunoblotting met COX IV antilichaam zoals mitochondriale marker en GAPDH antilichaam voor niet-mitochondriale control. Geen GAPDH- band werd waargenomen in de geïsoleerde mitochondriën aangeeft weinig of geen verontreiniging van niet-mitochondriale bronnen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Vertegenwoordiger respirometrische profiel van mitochondriën geïsoleerd uit menselijke Vastus lateralis. Drie concentraties van geïsoleerde mitochondriën, 5,0 ug, 2,5 ug, en 1,0 ug wij opnieuw gebruikt in deze test. Uiteindelijke concentraties van verbindingen na poort injecties 2 mM ADP (poort A); 2 uM oligomycin (poort B); 6 uM FCCP (poort C); en 2 uM antimycin A (poort D). Berekend RCR voor deze run was 7,95. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Som van de kwadraten. Som van de kwadraten van de verschillende mitochondriale ademhaling staten en RCR met behulp van 5,0 ug, 2,5 ug, en 1,0 ug mitochondriën. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
ig5highres.jpg "/>
Figuur 5. Dit kan worden gebruikt als een leidraad voor de hoeveelheid mitochondriaal eiwit te verwachten op basis van de oorspronkelijke musculaire monstergewicht Regressieanalyse schatten. Van hoeveelheid spier (mg) en totale mitochondriale eiwit opbrengst (mg). Zoals verwacht, is er een direct positieve correlatie tussen de hoeveelheid spieren en de totale mitochondriale eiwit verkregen.
Discussie
Geïsoleerde mitochondria worden vaak gebruikt in studies die de rol van ETC functie en andere mitochondriale activiteiten, waaronder substraattransport en TCA cyclusfunctie onderzoeken. Respirometrische testen met behulp van geïsoleerde organellen toestaan rechtstreeks onderzoek van de fundamentele processen van oxidatieve fosforylering en de intrinsieke eigenschappen van de ETC. Respirometrische profilering van geïsoleerde mitochondria in vergelijking met gehele cellen of permeabel spiervezels heeft de voordelen van relatief eenvoudige interpretatie van de gegevens en de afwezigheid van "storing" van niet-mitochondriale processen of veranderingen in mitochondriale massa / biogenese. Normalisatie van geeft de mitochondriale eiwitgehalte, waardoor eenvoudig onderling kunnen vergelijken mitochondriën tussen de monsters. Respirometrische profilering van geïsoleerde mitochondriën is een voorkeur aanpak bij het doel van het onderzoek is om te bepalen onderliggende mechanismen en de specifieke doelen, zoals ETC components / complexen, of mitochondriaal transport mechanismen.
Beschreven is een protocol voor spierbiopsie en isolatie van functionele mitochondriën van kleine weefselmonsters. Deze methode levert reproduceerbare resultaten tussen de gebruikers te wijten aan het gebruik van een geautomatiseerd homogenisator versus handbediende dounce homogeniseerapparaten. Isolatie van mitochondria kan worden uitgevoerd met slechts 20 mg van spierweefsel. Het bedrag van geïsoleerde mitochondriën die kunnen worden verkregen uit deze steekproef voldoende groot is om Seahorse-plaat gebaseerd respirometry draaien terwijl overschot mitochondriën voor andere experimenten en opslag voor verdere moleculaire analyses. Opgemerkt zij dat deze werkwijze kan worden vertaald naar de XF 96, waar nog kleinere hoeveelheden mitochondria worden gebruikt (1-2 ug per putje).
Verscheidene protocollen voor het isoleren mitochondria afhankelijk dounce homogenisatoren initiële weefselverstoring. Een nadeel van deze methode is de praktische aard van het initiële weefselhomogenisering. De kracht en de snelheid van de stamper in de homogenisator kan sterk variëren tussen de exploitanten 6. Dit kan resulteren in experiment tot experiment variatie en lab tot lab variatie, en leidt tot moeilijkheden bij het vergelijken van gegevens tussen experimenten. Dit is van bijzonder belang in de menselijke interventiestudies bij de gegevens van de deelnemers worden verzameld op verschillende tijdstippen, meestal vóór en na de behandeling, en mogelijk op meerdere plaatsen. We maken gebruik van een geautomatiseerde homogenisator voor een meer consistente aanpak die meer reproduceerbare resultaten met beperkte persoon tot persoon verschillen oplevert. De snelheid van bereiding maakt deze aanpak geschikt voor het hanteren van meerdere monsters tegelijk. Meestal kan tot drie experimenten worden uitgevoerd in een enkele dag.
Mogelijke beperkingen van de hier beschreven techniek ontstaan door het gebruik van geïsoleerde organellen en het gebruik van een plaat gebaseerd formaat. Bijvoorbeeld, Picard et al. hebben demontoond dat geïsoleerde mitochondriën bezitten functionele eigenschappen die fundamenteel verschillen van die van intacte mitochondriën in gepermeabiliseerde myovezels. Ze stelden mitochondriale isolatietechnieken resulteren in gewijzigde bioenergetica functie als aanzienlijk toegenomen RCR opzichte permeabel spiervezels gaan met een grotere productie van reactieve zuurstof 13. Vergeleken met gepermeabiliseerd spiervezels, isolatie van mitochondria vereist langere bereidingstijd. Ook verlies van cellulaire gehalte vermindert fysiologische relevantie, iets dat wordt vastgehouden in volledige cellen en zelfs gepermeabiliseerd vezels. Het gebruik van de plaat gebaseerd respirometry met de beschreven techniek het toelaat repliceren runs per monster. Echter, moet mitochondriën goed aan de bodem van elk. Deze configuratie verschilt van de normale omgeving en kunnen beïnvloeden functionele eigenschappen. Voorts zij opgemerkt dat het gebruik van dit protocol voor mitochondriële isolatie ther,e kunnen nog verontreiniging van het endoplasmatisch reticulum (ER) in het mitochondriale preparaat. Verschillen in ER verontreiniging kan de bepaling van de mitochondriale opbrengst en invloed resultaten beïnvloeden.
Kortom, deze studie bevat gegevens die bevestigt dat mitochondriën geïsoleerd uit weefsels met behulp van deze procedure functioneel actief en kan worden gebruikt voor onderzoek / toepassingen die hoogwaardige geïsoleerde mitochondriën van minimale skeletspier monsters vereisen. Het voordeel van deze methode is dat: i) het is mogelijk om mitochondriën te isoleren van geringe hoeveelheden van skeletspieren, ii) de werkwijze is snel, iii) de plaat gebaseerde technologie, is het mogelijk om meerdere monsters draaien op hetzelfde moment, en iv) er genoeg van overtollig weefsel en geïsoleerde mitochondria na de bio-energetische test voor opslag van monsters en andere moleculaire biologische onderzoeken.
Openbaarmakingen
De auteur, George Rogers, is een medewerker van Seahorse Bioscience die het instrument produceert dat in dit artikel wordt gebruikt. De Open Access-kosten werden ondersteund door Seahorse Biosciences.
Dankbetuigingen
We willen Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, bedanken voor de nuttige discussies; mevrouw Karin Murphy, mevrouw Heather Gregory en de heer John Stone, allemaal van Wake Forest School of Medicine, voor de nuttige technische assistentie bij de ontwikkeling van dit protocol.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Homogenizer Bio-Gen PRO200 | BioExpress | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Fisher Scientific | ||
| Deepwell late Rotor | Fisher Scientific | ||
| 6 mm University College Hospital Needle | Cadence | ||
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | ||
| 96-well plate reader | Tecan (Genios-basic) | ||
| Seahorse XF 24-3 analyzer | Seahorse Biosciences, Inc. | ||
| Protein gel system | Life Technologies (Invitrogen) | ||
| Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | ||
| Kodak camera assembly | Carestream Health, Inc | ||
| Consumables | |||
| XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 100850-001 | |
| 100867-100 | |||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Acros | 12421-0010 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Lonza | 17-512F | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P333 | |
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 | |
| ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 | |
| Fatty acid-free BSA | Calbiochem | 126575 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich Co | S0389 | |
| Bacterial proteinase | Sigma-Aldrich Co | P-8038 | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 | |
| BCA protein assay kit | Sigma-Aldrich Co | PI23227 | |
| Succinic Acid* | Sigma-Aldrich Co | S3674 | |
| Pyruvic acid* | Sigma-Aldrich Co | P5280 | |
| Malic acid* | Sigma-Aldrich Co | 2288 | |
| ADP(K+ salt)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 | |
| XF Cell mito stress test kit | Seahorse Biosciences | 101706 | |
| Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 | |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX | |
| Immobilin Transfer Membranes (0.45 um) | Millipore | IPVH20200 | |
| MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 | |
| Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) | Abcam | ab14734 | |
| Primary antibodies (mAB to GAPDH) | Abcam | ab9484 | |
| Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF822E001EA | |
| Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF812E001EA | |
| *ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only |
Referenties
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods. 26, 292-297 (2002).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA. Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PloS One. 8, e82392(2013).
- Chappell, J. B., Perry, S. V. The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria. The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).
- Tyrrell, D. J., et al. Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).
- Nicklas, B. J., et al. Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women. Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).
- Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746(2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6, e18317(2011).
Herprints en machtigingen
