Dit protocol beschrijft een celtransplantatiesysteem met behulp van genetisch gemodificeerde, injecteerbare sferen. Celsferen worden gekweekt op microgepatternde kweekplaten en hersteld na genintroductie met behulp van polyplex nanomicellen. Dit systeem vergemakkelijkt langdurige transgenexpressie van de getransplanteerde cellen in gastdieren terwijl het de aangeboren functie van de cellen behoudt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gentransfectie richting Sferoïde Cellen op micropatterned Cultuur Platen voor genetisch gemodificeerde Cell Transplantation
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Om de therapeutische werkzaamheid van celtransplantatie verbeteren, transplantatie stelsel van genetisch gemodificeerde, injecteerbare sferoïden ontwikkeld. De cel sferoïden worden op een kweeksysteem op micropatterned platen bekleed met een temperatuurgevoelige polymeer. Een aantal sferoïden zijn gevormd op de platen, die overeenkomen met de celadhesie gebied van 100 urn diameter die regelmatig zijn gerangschikt in een tweedimensionale wijze, omgeven door niet-klevende gebieden die zijn bekleed met polyethyleenglycol (PEG) matrix. De sferoïden kunnen gemakkelijk worden teruggewonnen als vloeibare suspensie door verlaging van de temperatuur van de platen en hun structuur is goed onderhouden doordat deze injectienaalden met een voldoende groot kaliber (via 27 G). Genetische modificatie wordt verkregen door gen transfectie met de oorspronkelijke niet-virale gen-carrier, Polyplex nanomicelle, dat in staat is het inbrengen van genen in cellen zonder verstoring van de bolvormige structuur. Voor primary hepatocyt sferoïden getransfecteerd met luciferase-expressie gen, wordt de luciferase duurzaam verkregen in getransplanteerde dieren, samen met bewaarde hepatocytfunctie, zoals door expressie van albumine. Dit systeem kan worden toegepast op een verscheidenheid van celsoorten waaronder mesenchymale stamcellen.
Inleiding
Celtransplantatie therapie is brede aandacht trok voor de behandeling van diverse hardnekkige ziekten. De activiteit en halfwaardetijd van bioactieve factoren die worden uitgescheiden door de getransplanteerde cellen zijn essentieel voor een verbeterde therapeutische werkzaamheid van celtransplantatie systeem. Genetische modificatie van de cellen voorafgaand aan transplantatie is een techniek nuttig te reguleren en te manipuleren cellulaire functies, waaronder de afscheiding van het biologisch actieve factoren. Het is ook belangrijk om een gunstige micro voor de cellen voor het vermijden celdood of verlies van cel activiteit. Driedimensionale (3D) sferoïde celkweek....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Tokyo, Tokyo, Japan.
1. Celbereiding
- Voor primaire hepatocyten, volgt u het protocol voor hepatocyt isolatie van de rat door een aangepaste twee-staps collagenase spijsvertering 13,14.
- Verdoven Sprague Dawley (SD) ratten (mannelijk, 5 weken oud) onder inhalatie-anesthesie met isofluraan. Plaats een rat in een kamer verbonden met een anesthesie met isofluraan machine voorzien in de kamer. Haal de rat na een val in slaap, en zet deze op de operatietafel met ventilatie met behulp van een masker. Co....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gentransfectie van de Gaussia-luciferase expressie pDNA werd uitgevoerd in de sferoïden gevormd door de hepatocyten of MSCs middels polyplex nanomicelles of control lipide-gebaseerde transfectie reagens 12. De nanomicelles veroorzaakte vrijwel geen verandering in de bolvormige structuur in vergelijking met niet getransfecteerde sferoïden op micropatterned platen, terwijl het reagens aanzienlijk verstoord structuur dag na transfectie (Figuur 3). Na transfectie met behulp van de nanomicelles, c.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit protocol is het essentieel om de 3D structuur van sferoïden tijdens de stappen van gen introductie en sferoïde herstel behouden. Het is essentieel om een gunstig microenvironments behouden de cellen om celdood of verlies van celactiviteit te vermijden. Bijvoorbeeld, albumine uitscheiding, een vertegenwoordiger aangeboren functie van hepatocyten, goed geconserveerd in de hepatocyten sferoïden, terwijl de hepatocyten in de conventionele monolaag kweek verliezen snel hun secretoire capaciteit enkele dagen na zaaie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We waarderen ten zeerste Dr. Takeshi Ikeya en technisch personeel in Toyo Gosei, Tokyo, Japan voor het verstrekken van temperatuurgevoelige micropatterned cultuur platen evenals wetenschappelijke adviezen. We danken ook mevrouw Satomi Ogura, mevrouw Sae Suzuki, mevrouw Asuka Miyoshi en mevrouw Katsue Morii voor technische bijstand met dierproeven. Dit werk werd financieel ondersteund in het kader van de JSPS KAKENHI Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek, het Centrum voor Innovatie (COI) Programma en de S-innovatieprogramma van de Japan Science and Technology Agency (JST), en de JSPS Core- to-Core Program, A. Advanced Research Networks.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethason | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s gebufferd zout en L-ascorbinezuur 2-fosfaat (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Humaan epidermale groeifactor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Multi-well platen voor cellen | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermogevoelige cellen kweekplaten (Upcell) | CellSeed Inc | De micro-gepatternde architectuur is gebouwd op de thermogevoelige platen (op maat gemaakt door Toyo Gosei) | |
| Lipide-gebaseerd transfectie reagens (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay Systeem | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA dat Gaussia luciferase tot expressie brengt | New England BioLabs | N8082S | |
| Muis erhtropoietin-expresserende vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Vriendelijk ter beschikking gesteld door het Laboratorium voor Pluripotente Celstudies, Centrum voor Ontwikkelingsbiologie, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competente cellen | Takara | 9057 | |
| Endotoxine-vrije plasmide DNA zuiveringssysteem | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collageenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsine-remmer | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Beeldvormingssysteem | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo beeldvormingssysteem | |
| Bloedmonster analyazer | Sysmex | pocH-100i Geautomatiseerde Hematologie Analyzer |
Referenties
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
