Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care

20.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52397

⸱

16 februari 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

In dit artikel

Samenvatting

De lymfodeletieve en immunomodulerende effecten van chemotherapie en stralingsstandaardzorg kunnen worden benut om de antitumor-effectiviteit van T-celimmunotherapie te verbeteren. We schetsen een methode voor het genereren van EGFRvIII-specifieke chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen en het toedienen ervan in de context van glioblastoma standaardzorg.

Samenvatting

Adoptieve T-cel immunotherapie biedt een veelbelovende strategie voor het specifiek targeten en elimineren van kwaadaardige glioma's. T-cellen kunnen ex vivo worden gemodificeerd om chimere antigeenreceptoren te gaan uitdrukken die specifiek zijn voor glioma-antigenen (CAR T-cellen). De expansie en functie van adoptief overgedragen CAR T-cellen kan worden versterkt door de lymfodeletieve en tumordodende effecten van standaard chemotherapie en radiotherapie. We beschrijven een methode voor het genereren van CAR T-cellen die EGFRvIII targeten, een glioma-specifiek antigeen, en evalueren hun effectiviteit in combinatie met een muismodel van glioblastoma standaard behandeling. T-cellen worden gemodificeerd door middel van transductie met een retrovirale vector die het anti-EGFRvIII CAR-gen bevat. Diermodellen met tumoren worden onderworpen aan hostconditionering door een kuur van temozolomide en bestraling van de hele hersenen met dosisregimes die zijn ontworpen om de klinische standaardbehandeling te modelleren. CAR T-cellen worden vervolgens intraveneus toegediend aan geprimeerde gastheren. Deze methode kan worden gebruikt om de antitumoreffectiviteit van CAR T-cellen te evalueren in de context van standaard behandeling.

Inleiding

Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende primaire kwaadaardige hersentumor en is altijd fataal. Chirurgische resectie gekoppeld aan aspecifieke zorgstandaard chemotherapie en radiotherapie niet volledig te elimineren kwaadaardige cellen, resulterend in een sombere prognose van minder dan 15 maanden bij patiënten met deze ziekte 1. Daarentegen immunotherapie biedt een nauwkeurige benadering specifiek richten op tumorcellen, en heeft dus de potentie om te dienen als een zeer effectieve behandeling platform met verminderd risico van toxiciteit zekerheden 2-4. T-cellen ontwikkeld ex vivo te uiten chimeer antigen receptoren (auto's) bieden een veelzijdige strategie voor tumor immunotherapie. Auto's worden gegenereerd door het fuseren van het extracellulaire variabele gebied van een antilichaam met één of meer intracellulaire T-cel signalerende moleculen (s), in plaats van een full-length major histocompatibility complex (MHC) -beperkte T-cel receptor 5. Deze wijze van antilichaam-achtige antigeen erkennOp maakt reactieve antigen-specifieke T-cellen te herkennen en tumorantigenen in afwezigheid van MHC en kan worden aangepast voor een virtueel oneindig antigeen repertoire.

CAR T-cellen gemanipuleerd tegen diverse tumor antigenen aangetoond preklinische werkzaamheid en uitstekende belofte in de kliniek 6-9. Met name in de context van GBM, auto T cel targeting epidermale groeifactorreceptor variant III (EGFRvIII), een tumor-specifieke mutatie expressie op het celoppervlak 10, bleek de overleving verlengen-glioom dragende muizen 11. Ondanks hun veelzijdigheid, maar de klinische voordelen van CAR adoptieve therapie is nog niet volledig gerealiseerd, mede als gevolg van tumor-geassocieerde immunosuppressie en het immuunsysteem belastingontduiking 12-16 evenals uitdagingen bij het ​​opzetten en onderhouden van antigeen-specifieke T-cellen in vivo. Gebruik te maken van standaard van zorg (SOC) met immunotherapie kan mogelijk overwinnen een aantal van deze limitaties, resulterend in verhoogde werkzaamheid in zowel de preklinische en klinische setting.

SOC voor post-resectie GBM bestaat uit een hoge dosis temozolomide (TMZ), een DNA-alkylerende stof 17, en het hele brein bestraling (WBI) 1. Deze behandelingen worden geacht om synergie met tumor vaccins via opregulatie van tumor MHC expressie 18-20 en het loskomen van antigenen door dode tumorcellen 17,19,21,22. Inderdaad, de toevoeging van TMZ 20,23 of 18,24 WBI leidt tot verhoogde antitumorale werkzaamheid van immuun gebaseerde behandelingen in de preklinische omgeving. Bovendien, net als vele niet-specifieke cytotoxische chemotherapeutica, TMZ bekend systemische lymfopenie 25,26, die kan worden benut als middel gastheer-conditioning voor adoptieve therapie platforms 27-29 veroorzaken. TMZ-gemedieerde lymphodepletion is aangetoond dat de frequentie en de functie van de antigeen-specifieke T-cellen verbeteren, wat leidt tot verhoogde werkzaamheid van een Adoptieve therapie platform tegen intracraniële tumoren 30. In de context van CAR therapie lymphodepletion fungeert als middel gastheer-conditioning zowel vermindering van het aantal endogene suppressor-T-cellen 31 en induceren homeostatische proliferatie 32 via verminderde concurrentie voor cytokinen 33, waardoor antitumoractiviteit 11,34 verbeteren. Gezien de synergetische relatie tussen GBM SOC en immunotherapie platforms evalueren adoptieve nieuwe therapieën en vaccins platforms in de context van SOC is essentieel voor het trekken van zinvolle conclusies inzake werkzaamheid.

In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het genereren en intraveneuze toediening van muizen EGFRvIII specifieke CAR T-cellen naast TMZ en WBI in muizen met EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren (zie Figuur 1 voor de behandeling tijdlijn). In het kort worden AUTO T-cellen gemaakt door retrovirale transductie. Menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen worden getransfecteerd met een DNA / lipide-complex (met de CAR vector en PCL-Eco plasmiden) virus, die vervolgens wordt gebruikt om geactiveerde muriene splenocyten die zijn geoogst en gekweekt in parallel transduceren produceren. Tijdens CAR generatie, zijn murine gastheren dragen EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren toegediend gefractioneerde hele brein röntgenbestraling en systemische TMZ behandeling bij doses vergelijkbaar klinische SOC. AUTO T-cellen worden vervolgens intraveneus te lymphodepleted gastheren geleverd.

De volgende procedure wordt beschreven in zeven afzonderlijke fasen: (1) Toediening van temozolomide tumordragende muizen, (2) Whole Brain Bestraling van tumordragende muizen, (3) transfectie (4) Splenectomie en T cel bereiding, (5 ) Transduction, (6) AUTO T-cel Cultuur en Harvest, en (7) AUTO T-cel toediening aan muizen met een tumor. Deze fasen bestaan ​​uit verschillende stappen die 6-7 dagen bestrijken en tegelijkertijd worden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is gebaseerd op experimentele ontwerp waarbij 10 muizen behandeld met 10 7 CAR T-cellen elk. Dit betekent dat 10 8 CAR T-cellen nodig zijn; de opbrengst moet worden overschat door 5 x 10 7 -1 x 10 8 om rekening te houden voor het verlies van de levensvatbaarheid. Het volgende protocol wordt geschaald tot ongeveer 200 x 10 6 cellen genereren. De cellen worden vervolgens intraveneus toegediend aan vrouwelijke C57BL / 6 muizen met 9 dagen vastgesteld syngene EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren, ontwikkeld uit de bestaande KR158B astrocytoma of B16 melanoma cellijnen. Gelijktijdig met CAR T cel generatie worden tumordragende muizen waaraan klinisch relevante doses lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) en WBI (16.5 Gy).

Muizen werden gehandhaafd en onder-pathogeen-vrije omstandigheden aan de Duke University Medical Center (DUMC) gefokt. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de protocollen van de Duke University Institution goedgekeurdal Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Toediening van Temozolomide to-muizen met een tumor

Dagen 0 tot 4:

  1. Bereken het totaal aantal muizen in te spuiten en vermenigvuldigen met 0,5 volume van TMZ oplossing nodig (bijvoorbeeld 30 muizen x 0,5 ml = 15 ml TMZ) bepalen en voeg 1,5 ml om deze hoeveelheid te verantwoorden overloop (16.5 ml TMZ ).
  2. Vermenigvuldig dit totaal volume van 3 mg / ml van het gewicht van gevriesdroogde TMZ benodigde bepalen (bijvoorbeeld 16.5 x 3 = 49.5 mg TMZ). Weeg deze in een 50 ml conische.
    LET OP: TMZ is giftig bij inademing, inslikken en contact met de ogen, huid en slijmvliezen. Overleggen met de veiligheid instelling beroeps- en / of milieu en gezondheid en wellness-afdeling voor aanbevelingen over het verminderen van het risico van blootstelling.
  3. Vermenigvuldig het totale volume met 0,15 om de hoeveelheid dimethylsulfoxide bepalen (DMSO) vereist (bijvoorbeeld 16.5 x0,15 = 2,475 ml DMSO). Filter steriliseren dit volume DMSO (plus nog eens 2 ml te verantwoorden spill) door een 0,2 urn filter in een steriele buis. Voeg 2,475 ml steriel DMSO aan de TMZ poeder.
  4. Plaats de TMZ / DMSO oplossing in een bekerglas met water over een hete plaat bij 65 ° C gedurende 10-15 min. Zodra TMZ volledig is opgelost, moet de oplossing lichtgeel van kleur geworden; als de oplossing wordt roze, dan is de TMZ wordt afgebroken en een nieuwe oplossing moet worden bereid met een frisse veel TMZ.
  5. Bereken het juiste volume steriele zoutoplossing nodig door vermenigvuldiging 0.85 door het totale volume (0.85 x 16.5 ml = 14,025 ml zoutoplossing). Voeg 15 ml steriele zoutoplossing in een 50 ml conische. Terwijl TMZ oplossen in de DMSO, warmte zoutoplossing tot 65 ° C.
  6. Vortex de TMZ / DMSO-oplossing zodat de TMZ poeder volledig is opgelost en voeg langzaam opgewarmd fysiologische zoutoplossing om de TMZ / DMSO-oplossing.
  7. Direct na bereiding, volledig laden 15 x 1 ml tuberculine syringes met TMZ oplossing voor toediening tot 4 dagen gevestigde muizen met een tumor.
  8. Herhaal deze procedure op dagen 1 tot 4 voor een totaal van vijf TMZ besturen.

2. Whole Brain Bestraling van-muizen met een tumor

Dagen 2 tot 4:

  1. Schakel de X-ray bestraler en laat deze warm-up van de volledige spanning. Zorg ervoor dat de juiste filter is op zijn plaats en het invoeren van de juiste spanning en de huidige instellingen (Figuur 2A).
    OPMERKING: De dosimetrie van de bestraler moet vooraf worden vastgesteld op het juiste voltage instellingen en grid (Figuur 2A, B) te bepalen.
  2. Bereken de tijd die nodig is om te resulteren in 5,5 Gy röntgenstraling. Als bijvoorbeeld röntgenstralen worden geleverd met een snelheid van 2 Gy / min, vervolgens 2,75 min nodig om een ​​totaal van 5,5 Gy leveren. Voer de juiste tijdsduur.
    OPMERKING: Tabel 2 geeft de muis WBI doseert eennd hun klinische equivalenten mens. In het kader van hooggradig glioom, 60 Gy gefractioneerd WBI (2 Gy fracties, 5 dagen / week gedurende 6 weken) is de klinische kwaliteit van de zorg, en de muizen equivalente hier gebruikt wordt is 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Bereid een verse oplossing van ketamine / xylazine systemische verdoving door toevoeging van 2 ml ketamine en xylazine 1 ml tot 17 ml zoutoplossing zodat de eindoplossing 10 mg / ml ketamine en 1 mg / ml xylazine.
  4. Weeg muizen en beheren 10 pl ketamine / xylazine intraperitoneaal per gram lichaamsgewicht zodanig dat dieren krijgen een dosis ketamine 100 mg / kg en 10 mg / kg xylazine. Muizen moet volledig worden verdoofd en zichtbaar ademhaling binnen 2 min van ketamine / xylazine administratie.
  5. Om oogheelkundige vocht in verdoofd dieren te behouden, wrijf een kleine hoeveelheid van kunsttranen zalf op elk oog.
  6. Plaats verdoofde muizen op het net zodat koppen geplaatst in het gebied dat de hoogste X-ray in ontvangtintensiteit (Figuur 2B, C). Schild lichamen van de nek naar beneden met geschikte afmetingen lood slang aan systemische X-ray levering (figuur 2D) te blokkeren.
  7. Plaats gepositioneerd muizen onder de x-stralen zodat de laser duidt het middelpunt van de röntgenbundel is de coördinaat (0,0) op de grid. Begin X-ray levering.
  8. Als X-ray levering is voltooid, verwijdert dieren uit de bestraler en leg ze op een warme verwarming pad. Laat verdoofd dieren niet huis met dieren bij bewustzijn, totdat de dieren voldoende bewustzijn hebben herwonnen om borstbeen recumbence behouden. Zodra dieren borstbeen recumbence kan handhaven, plaats bewuste dieren terug in hun geschikte kooien.
  9. Herhaal deze procedure op dagen 3 en 4 voor een totaal van drie gefractioneerde doses straling.

3. Transfectie

Dag -1:

  1. Bereid D10 media door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum (FBS) tot 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  2. Bereid T cel media (TCM) door toevoeging van 5,5 ml L-Glutamine, 5,5 ml natrium pyruvaat, 5,5 ml niet-essentiële aminozuren, en 5,5 ml penicilline / streptomycine (pen / strep) tot 500 ml RPMI-1640 medium. Voeg vervolgens 550 pl 2-mercaptoethanol en 550 pl gentamicine. Tot slot, voeg 50 ml FBS.
  3. Oogst in vitro gekweekte HEK293T cellen en breng aan een concentratie van 7,5 x 10 6 cellen / ml in D10 media.
  4. Plaat 10 ml D10 medium en voeg 1 ml van HEK293T celsuspensie in elk van 16 x 10 cm poly-D-lysine (PDL) beklede platen.
  5. Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2.

Dag 0:

  1. Vervang medium met 10 ml verse D10 tenminste 30 minuten voor het transfecteren van cellen.
  2. Bepaal de hoeveelheid plasmide, PCL-Eco vector en liposomaal transfectiereagens vereist voor transfectie door het totale aantal platen vermenigvuldigen + 1 (16 + 1 = 17) met 14,1 ugvector plasmide (14,1 x 17 = 239,7 g), 9,9 ug PCL-Eco vector (9,9 x 17 = 168.3 pg), en 60 pi liposomaal transfectiereagens (60 x 17 = 1020 pi). Alle reagentia moeten bij kamertemperatuur voor het bereiden van oplossingen.
  3. Label twee buizen A en B. In buis A, voeg 239,7 ug vector plasmide en 168,3 ug PCL-Eco vector tot (1,5 x 17) ML verlaagde serum gemodificeerd Eagle's medium (RS-MEM). In buis B, voeg 1020 ul liposomaal transfectiereagens naar (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Incubeer A en B afzonderlijk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Mix A en B samen zachtjes (vortex gedurende 1-2 seconden of invertsuiker meerdere malen) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur lipide / DNA complex.
  6. Voeg lipide / DNA-complex druppelsgewijs naar HEK293T cellen in 10 cm schotel.
  7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 6-8 uur of overnacht (niet meer dan 24 uur).
  8. Na 6-8 uur incubatie, vervangen medium met 12 ml vers TCM voor virale productie. Deze vergulde mediaworden gebruikt op dag 2 virale supernatant voor T-cel transductie.

4. Splenectomie en T Celbereiding

Dag 0:

  1. Giet 10 ml van TCM in een 50 ml conische en plaats op ijs milt collectie.
  2. Offer het juiste aantal dieren CO 2 stikken en secundaire onthoofding: Place dieren in een kooi ontvangende CO 2 bij een stroomsnelheid van 10-30% kooi / minuut, per American Veterinary Medical Association richtlijnen (niet meer dan 5 dieren worden tegelijkertijd opgeofferd) tot ademhaling eindigt en twee minuten daarna. Verwijder dieren uit de CO 2 kamer en onthoofden.
    OPMERKING: Een milt van een 6-12 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muis zal ongeveer 4,5-5 x 10 7 splenocyten opleveren. Hier vindt 4 milt worden geoogst voor ongeveer 200 x 10 6 cellen.
  3. Leg de muis zodanig dat de juiste zijde naar boven is gericht, enspuiten met 70% ethanol. Met de tang, pak een dunne huidplooi onder het linker ribbenkast en snijd een kleine incisie met de schaar. Trek de huid, voorzichtig pak een dunne plooi van het buikvlies met een tang, en snijd een kleine holte.
  4. De milt is een klein, langwerpig, donkerrood orgaan dat een afgeplatte boon lijkt; delicaat pak de milt met de tang en accijnzen door het wegsnijden van het omringende bindweefsel. Plaats de uitgesneden milten in de conische 10 ml TCM op ijs.
  5. Giet milten over een 70 urn maas zeef en splitsen door stampen met het stompe uiteinde van de binnenkant van een spuit 5 ml van een enkele celsuspensie te genereren. Er kunnen maximaal twee milt moeten worden uitgesplitst per zeef.
  6. Gebruik een kleine hoeveelheid TCM zorgvuldig wassen zeef volgende uitsplitsing voor resterende splenocyten verzamelen. Bundelen alle uitgesplitste milt in een eencellige suspensie. Breng uiteindelijke volume op 50 ml met TCM voor een wasbeurt van eend draaien bij 300 xg gedurende 10 min.
  7. Bereid een oplossing van 1x lysebuffer door toevoeging van 5 ml 10x lyseerbuffer tot 45 ml steriel water. Als rode bloedcellen, resuspendeer pellet in 5 ml van 1 x lysisbuffer per milt in 50 ml conische, goed mengen door voorzichtig pipetteren en neer te elimineren. Als meer dan 5 milt, gebruik maken van een 250 ml centrifugebuis. Plaats conische of centrifugebuis in een 37 ° C waterbad gedurende 5 min.
  8. Verwijder de lysis reactie van het waterbad en voeg TCM bij een 1: 1 verhouding met lysis buffer om de reactie te neutraliseren. Was door centrifugeren bij 300 g gedurende 10 min.
  9. Zuig supernatant en resuspendeer pellet volledig in TCM (2 ml / milt, 8 ml totaal 4 milten) door en neer te pipetteren.
  10. Tellen cellen door toevoeging van 10 ui celsuspensie 190 pi trypan blauw (1:20 verdunning). Vermenigvuldig het aantal in één van de vier gerasterde vierkanten verkregen door 20 x 10 x 4 totaal volume (8 ml) aan het totale aantal cellen te verkrijgen (bijvoorbeeld 125 cellen x 20 x 10 4 x 8 ml = 200 x 10 6 splenocyten).
  11. Verdun cellen tot een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml in TCM, gesupplementeerd met 2 ug / ml concanavaline A (ConA) en 50 IU / ml recombinant humaan interleukine-2 (rhIL-2). Aldus, 200 x 10 6 splenocyten, voeg 92 ml medium 8 ml cellen 200 ug ConA en 5000 IU rhIL-2.
  12. Voeg 2 ml cellen aan elk putje van 24-well weefselkweek behandelde platen, zodanig dat 4 x 10 6 cellen in elk putje (bijvoorbeeld 100 ml cellen ongeveer 4 platen nodig).
  13. Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2.

5. Transduction

Dag 1:

  1. Bereken het aantal niet-weefselkweek behandelde platen met 24 putjes die nodig is voor transductie door het aantal milten geoogst 2 (8 platen nodig voor 4 milten) te vermenigvuldigen.
  2. Bereken vervolgens de vereiste hoeveelheid recombinant humaan fibronectine fragment (RHFF) oplossingmoest coat platen door vermenigvuldiging (totaal aantal putten + 3) x 0,5 ml (8 x 24 wells platen = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Bereid 97,5 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die RHFF in een concentratie van 25 ug / ml van het totale volume te vermenigvuldigen met 25 ug (97,5 x 25 = 2437,5 g). Voeg deze hoeveelheid RHFF tot 97,5 ml PBS.
  4. Coat niet met weefselkweek behandelde platen met 24 putjes door het toevoegen van 0,5 ml PBS / RHFF oplossing per put.
  5. Incubeer overnacht bij 4 ° C.

Dag 2:

  1. Dump PBS / RHFF oplossing van niet-weefselkweek behandelde platen met 24 putjes.
  2. Voeg 1 ml / putje 2% runderserumalbumine (BSA) in PBS en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  3. Verwijder BSA door stevig upending plaat. Was door toevoeging van 2 ml PBS.
  4. Verzamel viraal supernatant door de overdracht van de media uit elke HEK293T PDL plaat in een 250 ml centrifugebuis en spin 10 min bij 500 x g.
  5. Breng zorgvuldig virale supernatant in een frisse 250 ml centrifugebuis, het zijn zeker niet naar de cel pellet die zich kunnen gevormd verstoren.
  6. Voeg verse TCM aan de virale supernatant zodanig dat het uiteindelijke volume is 3 ml meer dan de hoeveelheid die nodig is voor RHFF-beklede putjes. Bijvoorbeeld, voor 192 RHFF beklede putjes, breng het volume van virale supernatant 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Verwijder gekweekte splenocyten uit de incubator en resuspendeer door voorzichtig pipetteren en neer 2-3 keer in elk putje. Over te dragen aan een 250 ml conische. Bij gebruik van een multichannel pipet, met behulp van een steriele reservoir vóór de overdracht zal helpen bespoedigen deze stap. Telling zoals eerder beschreven en rotatie bij 300 xg gedurende 10 min.
  8. Voeg rhIL-2 virale supernatant bij een concentratie van 50 IE / ml. Voeg bijvoorbeeld 50 x 195 = 9750 IU rhIL-2-195 ml viraal supernatant.
  9. Resuspendeer splenocyten virale supernatant bij 1 x 10 6 cellen / ml
  10. Voeg 1 ml / putje van splenocyten suspensie RHFF-beklede platen met 24 putjes.
  11. Spin voor 90 min op basis van de volgende instellingen: 770 xg, acceleratie = 4, rem / vertraging = 0, 32 ° C.
  12. Bereid een TCM oplossing met 50 IU / ml rhIL-2. Bijvoorbeeld, bereiden 200 TCM door toevoeging 10.000 IE rhIL-2. Voeg 1 ml rhIL-2 / TCM aan elk putje na centrifugeren.
  13. Kweek overnacht bij 37 ° C in 5% CO2.

6. AUTO T-cel Cultuur en Oogst

Dag 3 en 4:

  1. Als T-cellen te bereiken> 80% samenvloeiing, kunnen cellen worden gesplitst (dit gebeurt meestal op dag 3 of dag 4). Cellen splitsen voorzichtig pipetteren en neer in elk putje 2-3 keer, en beweeg 1 ml van elk putje naar nieuwe putjes van een verse 24-well weefselkweek behandelde plaat. Vervolgens voeg 1 ml vers TCM met 50 IU / ml IL-2 aan elk putje zodat uiteindelijk volume 2 ml in alle putjes.
  2. Als cellen niet> 80% samenvloeiing bereiken, het uitvoeren van een half media verandering door langzaam pipetteren off 1 ml van media vanaf de bovenkant van elk putje. Vermijd disturbing cellen vestigden zich op de bodem tijdens het verwijderen van de media. Voeg 1 ml vers TCM met 50 IE / ml rhIL-2.

Dag 5:

  1. Resuspendeer CAR T-cellen door voorzichtig pipetteren en neer 3 keer in elk putje overgebracht in een 250 ml centrifugebuis. Spin-cellen bij 300 xg gedurende 10 min.
  2. Volledig aspireren supernatans zonder verstoring van pellet. Eenmaal met PBS, tellen cellen zoals eerder beschreven, en wassen met PBS nogmaals. Een typische AUTO T-cel-opbrengst is ongeveer 1 x 10 6 cellen per putje (8 platen x 24 putten = 192 x 10 6 CAR T-cellen).
  3. Resuspendeer cellen in PBS bij een concentratie van 5 x 10 7 / ml voor een injectie van 1 x 10 7 in een volume van 200 pg (bijvoorbeeld voor 192 x 10 6 CAR T-cellen, resuspendeer pellet gewassen in 3,84 ml PBS).

7. AUTO T-cel Administratie-muizen met een tumor

Dag 5:

  1. Transport cellen op ijs dierenverblijf voor intraveneuze injectie. Load 500-1.000 ul in insuline spuit met 27-31 G naald, ervoor te zorgen dat alle luchtbellen worden uitgestoten.
  2. Pak een muis aan de basis van de staart en plaats in buis restrainer.
  3. Trek de staart strak met de ader naar boven en glijden de naald ongeveer 1-2 mm onder de huid in de ader door deze evenwijdig aan de staartader. Langzaam verdrijven 200 ul in de ader. Als de naald correct is geplaatst in de ader, zal het volume gemakkelijk stromen; anders zal er weerstand en de naald zal nodig hebben van de staart worden verwijderd en correct opnieuw geplaatst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

AUTO T-cellen worden gegenereerd door transductie met de EGFRvIII CAR retrovirale vector 11. Deze vector, MSGV1, werd ontwikkeld op basis van de SFGtcLuc_ITE4 vector 35, waarin de muizen stamcellen virus (MSCV) lange terminale herhalingen, de uitgebreide gag regio en envelop splice site bevat (splitsingsdonor, sd, en splice acceptor, nv), en virale verpakkingssignaal (ψ). De EGFRvIII CAR die het humane anti-EGFRvIII variabel fragment enkele keten (scFv) 139, samen met murine CD8TM, CD28, 4-1BB, en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De behandeling tijdlijn hier beschreven is ontworpen voor het modelleren klinische kwaliteit van de zorg en het benutten ervan bij de CAR adoptieve therapie. CAR T cel doses TMZ regimes en radiotherapie toediening kan worden gemodificeerd ter verbetering van in vivo T-cel activiteit lymphodepletion en tumor doden. TMZ regimes kan worden verhoogd tot gastheer myeloablatie en verhoogde expansie van adoptief overgedragen cellen 30 verkregen. Bovendien kan de lymphodepletive effecten van TMZ worden geïnc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Dr. Laura Johnson en Dr. Richard Morgan danken voor het verstrekken van de CAR retrovirale constructie. De auteurs danken ook Giao Ngyuen voor haar hulp met de dosimetrie voor volledige hersenbestraling. Dit werk werd ondersteund door een NIH NCI-subsidie 1R01CA177476-01.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
pCL-Eco Retrovirus Packaging VectorImgenex10045PHelper vector voor het genereren van CAR-retrovirus
Concanavalin ASigma AldrichC2010Niet-specifiek mitogeen om T-cel proliferatie en virale transductie te induceren
RetronectinClonTech/TakaraT100BFaciliteert retrovirale transductie van T-cellen
Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019Transfectiereagens
DMEM, hoge glucose, pyruvaatLife technologies11995-065HEK293 kweekmedia
RPMI 1640Life Technologies11875-093T-cel kweekmedia
Opti-MEM I Reduced Serum MediumLife technologies11058-021Transfectie media
200 mM L-GlutamineLife technologies25030-081Aanvulling T-cel kweekmedia
100 mM Sodium PyruvateLife technologies11360-070Aanvulling T-cel kweekmedia
100X MEM Non-Essential Amino Acids SolutionLife technologies11140-050Aanvulling T-cel kweekmedia
55 mM 2-MercaptoethanolLife technologies21985-023Reducerend middel om vrije radicalen te verwijderen
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/ml)Life technologies15140-122Aanvulling T-cel kweekmedia
Gentamicine (50 mg/ml)Life technologies15750-060Aanvulling T-cel kweekmedia
GemCell U.S. Origin Foetale RunderserumGemini Bio Products100-500Biedt groeifactoren en voedingsstoffen voor in vitro celgroei
Rundserumalbumine (BSA), Fractie V–StandaardkwaliteitGemini Bio Products700-100PBlokkeert niet-specifieke binding van retrovirus aan retronectin-gecoate platen
Pharm Lyse (10x concentraat)BD Biosciences555899Lyseert rode bloedcellen tijdens de verwerking van splenocyten
70 μm Steriele Cel ZeefCorning352350Filtert grote weefseldeeltjes weg tijdens de verwerking van splenocyten
100 mm BioCoat Cultuurschotels met Poly-D-LysineCorning356469Bevordert HEK293 cel adhesie om proliferatie na transfectie te maximaliseren
[header]
TemozolomideBest PharmatechN/ALyofilisaatpoeder bereid op de dag van toediening
Dimethyl SulfoxideSigma Life SciencesD2650Noodzakelijk voor volledige oplossing van temozolomide
SalineHospiraIM 0132 (5/04)Oplosmiddel voor temozolomide en ketamine/xylazine
Ketathesia HClHenry Schein Animal Health11695-0701-1Ketamine oplossing
AnaSedLloyd IncN/AXylazine steriele oplossing 100 mg/ml

Referenties

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Standaardzorg voor glioblastoomtemozolomide-bestralingretrovirale vectortransductieengineering van murine T-cellenEGFRvIII-antigeentargetingbestraling van de gehele hersenenconditioneringsprotocol voor de gastheerflowcytometrie-analyseadoptieve T-celtherapie
Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.