Experimentele Glaucoom geïnduceerd door oculaire injectie van Magnetic microsferen

Samenvatting

We presenteren een methode voor het induceren van verhoogde intraoculaire druk (IOP), door magnetische microsferen in het rattenoog te injecteren, om glaucoom te modelleren. Dit leidt tot sterke drukverhogingen en uitgebreide neuronale dood. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren, vereist geen herhaalde injecties en produceert stabiele langdurige IOP-verhogingen.

Samenvatting

Vooruitgang in het begrijpen van de pathofysiologie en het bieden van nieuwe behandelingen voor glaucoom hangt af van goede diermodellen van de ziekte. We presenteren hier een protocol voor het verhogen van de intraoculaire druk (IOP) bij de rat, door magnetische microsferen in de voorste kamer van het oog te injecteren. Het gebruik van magnetische deeltjes stelt de gebruiker in staat om de korrels in de iridocorneale hoek te manipuleren, waardoor een zeer effectieve blokkade van vloeistofuittocht uit het trabeculair maaswerk ontstaat. Dit leidt tot langdurige stijgingen van de IOP en uiteindelijk neuronale dood in de ganglioncel laag (GCL) evenals pathologie van de oogzenuw, zoals gezien bij patiënten met de ziekte. Deze methode is eenvoudig uit te voeren, omdat er geen machines, specialistische chirurgische vaardigheden of vele uren oefening nodig zijn om deze te perfectioneren. Verder zijn de drukstijgingen zeer robuust en herinjectie van de magnetische microsferen is meestal niet nodig, in tegenstelling tot sommige andere modellen die plastic korrels gebruiken. Daarnaast zijn we van mening dat deze methode geschikt is voor aanpassing voor het muizenoog.

Inleiding

Primair glaucoom is een verwoestende oogziekte die naar schatting 60,5 miljoen mensen in de hele wereld ^1, wat kan leiden tot levensveranderende verlies van gezichtsvermogen en blindheid ^2. Onderzoek naar de ziekte mechanismen, en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor glaucoom, zijn afhankelijk van goede modellen van de ziekte die enkele van de kenmerken van de pathologie recapituleren.

We presenteren hier een rat glaucoom model gebaseerd op de methode van Samsel et al. ³ Het algemene doel van deze techniek is om intraoculaire druk (IOP) in het oog te verhogen door het injecteren magnetische microsferen in de voorste kamer en door een magnetische ring, rechtstreekse ze in de iridocorneale hoek. Dit belemmert waterige uitstroom, die IOP toeneemt, wat leidt tot neuronale beschadiging en celverlies. Het protocol werd ontwikkeld om te proberen een eenvoudiger, induceerbare model van glaucoom verschaffen.

Dit protocol kan een aantal voordelendan bestaande technieken. Genetische muismodellen zoals de DBA / 2J beschikbaar zijn, die geen procedures vereisen te initiëren; maar deze kan een onvoorspelbare begin van ziekteprogressie ⁴ hebben. Daarentegen induceerbare modellen, waarvan de meeste afhankelijk chirurgisch verhogen IOP bij knaagdieren, het voordeel dat initiatie kan worden door de gebruiker. Sommige van deze methoden kunnen nadelen van hun eigen hebben echter, met inbegrip van technisch uitdagende ^5, en kan meerdere procedures vereisen om verhoogde IOP ⁶ te behouden.

In tegenstelling, de induceerbare werkwijze beschreven in dit manuscript is een eenvoudige, efficiënte en reproduceerbare techniek die stabiele, robuuste toename in druk, met minimale behoefte herinjectie produceert. Bovendien is het niet betrekken dure apparatuur en vereist slechts eenvoudige chirurgische vaardigheden uit te voeren. Dit protocol kan geschikt zijn voor lezers die op zoek zijn naar het opzetten van een technisch minder veeleisend geïnduceerd zijnglaucoom model in hun laboratorium.

Protocol

Ethische verklaring: Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), en in overeenkomst met het Verenigd Koninkrijk van Binnenlandse Zaken richtlijnen (goedgekeurd http://goo.gl/FLkirW , laatste toegang 10 ^juni , 2014) en de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , laatst geopend op 10 ^juni, 2014).

1. oculaire hypertensie Inductie

1. Laten experimentele glaucoom door verhogen van de intraoculaire druk (IOP) via unilaterale injectie van paramagnetische microbolletjes in de voorste kamer van Brown Norway ratten, gebaseerd op de methode van Samsel et al. ³ andere gepigmenteerde ratten kunnen geschikt zijn, hoewel deze zouden moeten worden gevalideerd eerst door de gebruiker.
2. Huis 250-300 g vrouwelijkeex-fokker Brown Norway ratten in een constante omgeving met weinig licht (40-60 lux) om dagelijkse schommelingen te minimaliseren in IOP ^7, met toegang tot voedsel en water ad libitum.
3. Neem basislijn IOP metingen in wakkere dieren ⁸ voor de anesthesie en bead injectie, met een rebound tonometer gekalibreerd voor gebruik bij de rat oog ^9. IOP wordt genomen als het gemiddelde van vijf metingen.
4. Verdoven ratten met 37,5 mg / kg ketamine en 0,25 mg / kg medetomidine hydrochloride intraperitoneaal afgeleverd. Bevestigen diepte van de anesthesie door het testen achterste voet reflexen dier, voorafgaand aan jodium applicatie (zie stap 1.5), en de kraal injectie povidon (zie stap 1.8). Dien 0,5% proparacaïne hydrochloride voor analgesie.
   OPMERKING: Laat de leerling niet in elk stadium verwijden. Dit zal helpen de kralen om beter te vestigen in de iridocorneale hoek, en het voorkomen van binding aan de lens. Toepassing oculaire zalf aan het hoornvlies drogen op-un bediende contralaterale ogen te voorkomen.
5. WVerbrand het operatieve oog met 5% povidon jodium in het water ¹⁰ 5 min voorafgaand aan de injectie.
6. Na 5 min, lont de povidonjood uit met steriel gaasje en spoel de ogen met 0,9% steriele zoutoplossing. Houd het oog vochtig tijdens anesthesie met regelmatige toepassing van steriele zoutoplossing.
7. Plaats een toroïdale magneet rond het oog.
8. Injecteer 25 pi van een oplossing bevattende 30 mg / ml van gammastraling gesteriliseerd 8 urn magnetische microsferen in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in de voorste kamer, met een 33 G naald afgeschuind.
   1. Kralen bereiden wassen resuspenderen vervolgens centrifugeren 3 keer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten met 1 ml HBSS, alvorens de definitieve 30 mg / ml oplossing. Onderhouden steriele omstandigheden in.
   2. Voor injectie, wees voorzichtig om te voorkomen dat de naald om de iris, om het risico van iris trauma te minimaliseren. Dit kan worden voorkomen door richten van naald raakt aan het corneale oppervlak parallel aande iris mogelijk. Dit zal ook helpen om kraal verlies uit de injectieplaats te minimaliseren.
      OPMERKING: Spuit kralen in een snel tempo tot een gelijkmatige verdeling over de hele iridocorneale hoek, die cruciaal is voor het verhogen van IOP garanderen. Bovendien opslag kralen, naalden en magnetische ringen afzonderlijk zodat de korrels geen clusters, waardoor ze moeilijk te laden in de injectiespuit en injecteer en de naald niet gemagnetiseerd.
9. Laat de naald in de plaats voor 1 min na de injectie om ervoor te zorgen dat de kralen vestigen in de iridocorneale hoek met waterige afvoer belemmeren van het trabeculaire netwerk. Iets hoek van de naald na de kralen zijn in eerste instantie geregeld om een ​​aantal lekken van water mogelijk te maken, om een ​​tijdelijke verhoging van de IOP te minimaliseren. Aan het einde van de operatie spoelen de naald door eerst met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), vervolgens 70% ethanol, gevolgd door gedestilleerd water, om verder gebruik van de naald in afzonderlijke procedures. Als alternatief kan men gebruikwegwerp naalden als de juiste dikte en spuit combinatie is beschikbaar. Optioneel: naalden worden geslepen met een beveller gebruik ervan verlengen.
10. In dit stadium, indien nodig, verwijder de magneet, en het gebruiken om kralen te trekken naar gebieden van onvolledige dekking.
11. Laat de magneet op zijn plaats rond het oog voor een verdere 10 minuten na de injectie om ervoor te zorgen kralen vestigen ver in de iridocorneale hoek.
12. Reverse anesthesie met 0,25 mg / kg atipemezole hydrochloride.
13. Dien chlooramfenicol of andere antibiotische zalf, bijvoorbeeld gentamycine of terramycine topisch om infectie te voorkomen, en 0,5% proparacaïne hydrochloride analgesie. Verlaat dieren om te herstellen op een warmte mat, totdat zij weer beweging, vervolgens overbrengen naar een warme doos en voeding met extra voeding, zoals een voedingssupplement of bevochtigd normale dieet totdat herstel is voltooid. Systemische of lokale analgesie moet worden gegeven aan dieren met tekenen van pijn 24 uur na de operatie. Als these symptomen aanhouden, ondanks de behandeling, moeten de dieren op humane wijze worden gedood.
14. Gebruik het contralaterale oog als geopereerde controle.
15. Neem IOP metingen om de 2-3 dagen na toediening kraal en elke 2-3 dagen daarna met een rebound tonometer gekalibreerd voor gebruik bij de rat oog ^9.
16. De criteria om ogen studies zijn: indien 1) de IOP boven de contralaterale stuurdruk verhoogd door 5 mmHg, en 2) niet meer dan 60 mmHg.
17. Ogen waar de druk terugkeert naar basislijn (gewoonlijk met 1 week na injectie) niet worden opgenomen in het onderzoek, maar het is mogelijk om opnieuw injecteren kralen in ogen die niet aan hoge IOP ontwikkelen indien gewenst.
18. Euthanaseren dieren naar CO ₂ stikken aan het einde van het experiment.
19. Ontleden ogen en oogzenuwen en repareren in 4% paraformaldehyde (PFA) 's nachts voor verdere histologische analyse.

2. Het beoordelen van het netvlies Neuron Schade Met behulp van TUNEL Sbevattende

1. Apoptotische cellen te kwantificeren in ganse berg retinasuse de terminal deoxynucleotidyl-transferase gemedieerde dUTP nick-labeling (TUNEL) assay, volgens de instructies van de fabrikant.
2. Prepareer het netvlies van het oog beker, wassen 3 x 5 minuten in 0,3% Triton X-100 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS-T).
3. Permeabilize het weefsel in 3% T-PBS gedurende 2 uur.
4. Pre-evenwicht netvlies in equilibratiebuffer gedurende 10 min vóór incubatie in TUNEL reactieoplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C.
5. Was het weefsel voor 3 x 5 min in 0,3% T-PBS, spoelen in 0,3% T-PBS met 5 uM DAPI, en een flatscreen-mount in de montage media.
6. Te kwantificeren TUNEL positieve kernen gebruik maken van een confocale microscoop tot 10 pm z-stacks door het ganglion cellaag nemen bij een vergroting van 20x. Neem 3 plaatjes op elk van de 4 blaadjes, op plaatsen dicht bij de optische zenuw, halverwege de periferie, en aan de andere rand van de retina, dus in totaal 12 afbeeldingen per geheel bert, bemonstering ongeveer 7.000 cellen. Morfologische criteria gediscrimineerd niet-neuronale (endotheel en gliale) cellen van neuronale cellen.
7. Stalling voor beeldvorming met alleen de DAPI kanaal, en het masker onderzoekers behandelingsgroepen.

3. Het beoordelen van schade aan de oogzenuw behulp toluïdineblauw kleuring

1. Fix oogzenuwen overnachting in oplossing Karnovsky's bij 4 ° C.
2. Behandel specimens 2 uur in 1% (w / v) osmiumtetroxide en vervolgens drogen in 100% ethanol.
3. Incubeer optische zenuwen in propyleenoxide gedurende 30 min, en plaats in een 50:50 mengsel van propyleenoxide: Araldite overnight.
4. Verander deze oplossing tot 100% Araldite, gevolgd door incubatie overnacht bij 60 ° C.
5. Cut semithin secties (0,75 mm dik) en de vlek met 1% toluïdineblauw / borax (TB) in 50% ethanol voor het onderzoek met lichtmicroscopie.

4. Statistische analyse

1. Uit te voeren statistische analyseert behulp van een geschikte statistische softwarepakket. Een twee-weg ANOVA met Newman-Keul's post-hoc test kan worden gebruikt om statistische significantie berekenen IOP tijd verandert.
2. Een p waarde van minder dan 0,05 kan significant worden beschouwd.

Resultaten

Injectie van magnetische korrels in de iridocorneale hoek constant induceerde een langdurige en sterke drukstijging (figuur 1), die gemakkelijk waarneembaar was het eerste tijdstip, 3 dagen na injectie. Bovendien is de druktoename werd gehandhaafd gedurende de duur van het experiment en hoewel onze tijdsverloop eindigde op 18 dagen na injectie, maar andere die druk blijft langdurig ^3. De gemiddelde IOP gemiddeld over de volledige lengte van het experiment voor de controle, niet-bead-geïnjecteerde ogen was 19,7 ± 0,3 mmHg ten opzichte van 40,5 ± 2,8 mmHg voor bead geïnjecteerde ogen (p <0.001). Daarnaast piek IOP steeg van 22,8 ± 0,3 mmHg tot 49,9 ± 2,3 mmHg.

Om te bepalen of de verhoging van de IOP leidt tot de dood van retinale ganglioncellen, voerden we TUNEL kleuring op netvlies en histologie Dwarsafschot oogzenuw secties (figuur 2). In de retina we een toename waar TUNEL kleuring (figuur 2A) in bead geïnjecteerde ogen met verhoogde IOP. Het aantal apoptotische kernen nam ongeveer 15-voudig, 1,6 ± 0,5 cellen contralaterale controles, 24,5 ± 0,5 cellen in hypertensieve retina (Figuur 2B; P <0,05). Bovendien, in de ogen waarin magnetische bolletjes werden geïnjecteerd maar druk niet verhoogde (waarschijnlijk door onvolledige blokkering van de iridocorneale hoek), het aantal TUNEL-positieve cellen waren niet significant verschillend van die van niet-geïnjecteerde controles (P> 0,05). Dit suggereert dat celdood gerelateerd aan druk toeneemt, niet door directe toxiciteit van de magnetische microsferen. Tenslotte onderzochten we oogzenuw pathologie in de glaucoom model en zag accumulatie van toluidineblauw in veel van de axonen, aangeeft degeneratie van deze cellulaire processen (figuur 2C).

ure 1 "src =" / files / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg "/>
Figuur 1. Verhoging van intraoculaire druk met behulp van magnetische microsferen. Injectie magnetische microsferen in de voorste kamer induceerde een sterke, significante toename van de intraoculaire druk (IOP) in vergelijking met contralaterale controle, niet-geïnjecteerde ogen. Y-as eenheden = millimeter kwik (mm Hg). Data = gemiddelde ± SEM. * = P <0,001; N = 12. Dit cijfer is gewijzigd van Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Figuur 2. Elevation IOP door injectie van magnetische microsferen in de iridocorneale hoek geïnduceerde neuronale dood in de ganglion cellaag (GCL). (A) Representatieve beelden van netvliezen van controle (links) en glaucoom (rechts) gekleurd voor ogen apoptotische kernen door TUNEL (green;witte pijlen) en DAPI (blauw), met vermelding van het aantal apoptotische kernen verhoogd als IOP roos. (B) Kwantificering van TUNEL positieve cellen in de GCL, waaruit blijkt dat de ogen met verhoogde IOP (midden), hadden significant meer apoptotische cellen in vergelijking met control (links). Daarentegen, in bead geïnjecteerde ogen waar de druk niet stijgt (rechts) geen significante toename TUNEL kleuring waargenomen. Data = gemiddelde ± SEM. * = P <0.05; N = 7 - 8 (C) Representatieve beelden van oogzenuw kleuring, waaruit een verhoging toluidine blauw accumulatie (zwarte pijlen) in beschadigde axonen van glaucoom (rechts) maar geen controle ogen (links).. Schaalbalken = 50 urn. Dit cijfer is gewijzigd van Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Discussie

Hier tonen we een werkwijze voor het induceren van verhoogde IOP in ratten door injectie magnetische microsferen in de voorste kamer van het oog. Deze methode is eenvoudig uit te voeren, en vereist weinig chirurgische deskundigheid, of uren van de praktijk en verfijning. Bovendien is de procedure effectief; zelden die meer dan een enkele injectie van kralen tot een sterke en robuuste drukstijging (ongeveer 10% herinjectie rate) induceren. Dit kan een voordeel bieden ten opzichte van bestaande induceerbare methoden, zoals de technisch uitdagende episceral ader sclerose ¹¹ model, of laserfotocoagulatie protocol ^6, die meerdere procedures voor het onderhouden verhoogde IOP kan eisen.

Om de methode echter succesvol zijn, zijn er enkele kleine kritische stappen die moeten worden genomen. Allereerst is het nuttig om een ​​toroidale vorm magneet om parels te trekken in de iridocorneale hoek. Deze stap is een wijziging van het oorspronkelijke protocol Where de korrels werden geïnjecteerd in de voorste kamer, en daarna verplaatst vrije hand rond de ogen ^3. Met behulp van een ringkern magneet betekent dat microsferen gelijkmatig genoegen zou moeten nemen om de hoek, met minimale handmatige herverdeling. Te traag en de kralen overwegend ophopen op één zijde van de hoek, wat leidt tot onvolledige dekking, en mogelijk geen drukstijging - tweede dient de injectiesnelheid snel. Maar over het algemeen gesproken is de werkwijze eenvoudig genoeg dat de gebruiker gemakkelijk wijzigingen in het protocol, zoals variëren van de grootte of het volume van de microsfeer deeltjes, misschien proberen om de mate van de IOP hoogte veranderen kunnen maken.

Echter, een potentieel nadeel van de methode is dat men weinig controle over de omvang van de hypertensie, die ongeveer 5-10% van de gevallen zagen we steeg boven 60 mmHg. Excessieve stijgingen van de IOP kan zeer destructief te netvliesweefsel, en kunnen maken het bestuderen van de mechanismen en biologie van celdood uitdagend. Echter produceert de werkwijze een consistente neuronale pathologie, zowel in de retina en optische zenuw, die farmacologisch ¹² kunnen worden gemanipuleerd. Dit kan het model aantrekkelijk voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van glaucoom te maken. Bovendien, omdat de korrels worden gericht in de iridocorneale hoek laat dit de zichtas gratis live beeldvorming van de retina of optische schijf. We verwachten dat dit model zal worden aangepast en gebruikt voor toekomstige toepassingen in andere soorten, met inbegrip van de muis.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
250 - 300g vrouwelijke Brown Norway ex-fokkersratten	Harlan UK	203
Tonolab Rebound Tonometer	Tiolat	TV02
Ketaset (ketamin)	Fort Dodge Animal health	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitor (medetomidine hydrochloride)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Povidon-jodium	Ecolab	BN4369LE10	5% in H2O
Minim's Saline Solution	Bausch and Lomb	PL00033/5017
Toroïdale magneet	Supermagnete	R-10-07-03-N
Magnetische Microspheres	Bangs Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G afgeschuinde naald	Hamilton	7747-01	Aangepaste naald
Luer tip spuit	Hamilton	80601
Antisedan (atipemezole hydrochloride )	Orion Pharma	141-003	0,25 mg/kg
Chloramfenicol zalf	Medicom	18956-0005
TUNEL staining kit	Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield montagemedia	Vector Labs	H-1000