Het dooierzakmembraan van het kuiken (CAM) is immuundeficiënt en sterk gevasculariseerd, waardoor het een natuurlijke in vivo model van tumorgroei en angiogenesis is. In dit protocol beschrijven we een betrouwbare methode om driedimensionale, gevasculariseerde hepatocellulair carcinoom (HCC) tumoren te laten groeien met behulp van de CAM-assay.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De chick chorion-membraan (CAM) begint te ontwikkelen op dag 7 na de bevruchting en rijpt op dag 12. De cam is natuurlijk immunodeficiënte en sterk doorbloed, waardoor het een ideaal systeem voor tumor implantatie. Voorts bevat de CAM extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, laminine, collageen, integrine alfa (v) beta3 en MMP-2, waardoor het een aantrekkelijk model voor tumor invasie en metastase te onderzoeken. Wetenschappers hebben lang gebruik gemaakt van de fysiologie van de CAM door het te gebruiken als een model van angiogenese. Meer recent heeft de CAM-assay aangepast om te werken als een in vivo xenograft model voor verschillende kankers die de kloof tussen basic in vitro werk en complexere dierlijke modellen van kanker overbrugt. De CAM-assay maakt de studie van tumorgroei, antitumor therapieën en pro-tumor moleculaire pathways in een biologisch systeem waarin zowel kosten- en tijd-effectief. We beschrijven hier de ontwikkeling van de CAM xenograft model van hepatocellulair carcinoom (HCC) embryonale overleving tot 93% en betrouwbare tumor nemen leidt tot groei van driedimensionale, gevasculariseerde tumoren.
Inleiding
Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de 3 belangrijkste oorzaak van kankersterfte ter wereld 1. Nog slechts 30% van de HCC patiënten komen in aanmerking voor curatieve chirurgische behandelingen 2 en systemische chemotherapie niet effectief 3. Daarom is er dringend onvervulde medische behoefte aan nieuwe therapieën HCC en de ontwikkeling van modelsystemen geschikt voor het efficiënt testen van nieuwe middelen. De chick chorion-membraan (CAM) assay levert een reproduceerbare, rendabele en snelle middellange-throughput werkwijze voor het testen van potentiële anti-tumor drugs in vivo.
De CAM-assay is uitgebreid toegepast om angiogenese te bestuderen 4. Het is ook met succes ontwikkeld tot een tumor xenograft model van kanker, zoals glioblastoom 5, 6 pancreaskanker, melanoom 09/07, 11/10 en osteosarcoom. Zowel in ovo 12 en ex ovo13 technieken zijn toegepast in de literatuur met gegevens variërend van protocol protocol. Een belangrijke uitdaging voor de CAM xenotransplantaatmodel is de relatief hoge incidentie van embryonale sterfte na manipulatie van het ei, met gepubliceerde kippenembryo sterftecijfers variërend 25-50 procent 11-14.
In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een in ovo xenotransplantaatmodel van HCC die betrouwbaar produceert groei van drie-dimensionale, gevasculariseerde tumoren die histologisch lijken ongedifferentieerde HCC. We hebben een protocol voor het eerst beschreven door Ossowski et al. 14 aangepast en chick embryonale overleving tot 93% met een extreem hoge tumor implantatie hebben bereikt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. broeden
- Verkrijgen 8 dagen oude specifieke pathogenen vrije bevruchte eieren.
- Plaats de eieren in roterende ei-lade, gestempeld uiteinden naar boven en plaats de draaiende bak binnen een ei incubator. Incubeer eieren voor 48 uur bij 36 ° C en 50% vochtigheid.
2. Het laten vallen van de CAM en openen van de eieren
- Verzamelen eieren van incubator. Plaats eieren in ei-rek, gestempelde kant naar boven, en breng aan de laminaire stroming kap.
- Schakel de kamer en kap lichten.
- Houd de gestempelde eind licht ei om het ei candler de vasculatuur van de CAM en de luchtzak bloot.
LET OP: Het ei candler is een lichtbron wordt gebruikt om de ontwikkeling van het embryo en de bijbehorende luchtzak en vaatstelsel te visualiseren. - Plaats een potlood merk in tussen twee grote bloedvaten.
- Inschakelen van de verlichting en een steriele punaise een gat aan het uiteinde van het ei boven de luchtzak (gestempeld einde) en een gat aan de pencil merk. Druk niet op de punaise helemaal door; een gat ongeveer 3 mm diep gewoonlijk voldoende.
- Doe de lichten uit. Knijp veiligheid bol, stevig indrukken van de open einde tegen het gat boven de luchtzak. Afzuigen om lucht te trekken in het gat aan het potlood merk, waardoor de CAM om weg te komen uit de schelp te laten vallen op het potlood merk.
- Controleer of de luchtzak is verhuisd van de gestempelde einde van het ei tot het potlood gemarkeerd gat met de Candler. Als het niet, gebruik dan de punaise om beide gaten iets dieper te maken en dan opnieuw afzuigen met de veiligheid lamp.
- De lichten aandoen. Houdt het ei in de ene hand, zet de dremel roterende gereedschap met een 15/16-inch cut-off wiel bevestigd en maak twee dwarse sneden net diep genoeg door de shell te snijden, maar niet diep genoeg om helemaal naar beneden te snijden om de depressieve CAM. Maak de insnijdingen ongeveer 2 cm lang en 1 cm van elkaar. Maak de sneden breed genoeg zodat een siliconering 1 cm in diameter kan passerenmaar dunner dan de breedte van de standaard plakband.
- Vervolgens maak 1 langsuitstraling tussen en aan de uiteinden van de twee dwarse sneden door licht de cut-off wiel om de shell te raken.
- Schuif steriel pincet onder de shell stuk en parallel aan de schelp. Pak de schelp stuk met de tang en verwijder het hele stuk netjes.
- Plaats plakband over de onlangs geopende raam, en zorg ervoor om te vouwen de ene kant op zichzelf voor het gemak van de verwijdering.
- Plaats eieren terug in de incubator eiertray (niet in de roterende ei racks) op het moment van inoculatie.
3. Inoculatie
- Houd kelder membraaneiwit mengsel, zoals matrigel, op ijs in kap (om polymerisatie te voorkomen) en plaats.
- Gebruik 2 mM EDTA om cellen los (4 - 5 ml per T75 fles) en plaats kolven weefselkweek incubator gedurende 5 min.
- Resuspendeer de vrijstaande cellen in de media en te tellen met behulp van een hemocytometer en trypaanblauw. Gebruik tussen de 500.000 to 2.000.000 cellen voor het enten op de CAM, afhankelijk van de cellijn. Optimaliseer het juiste aantal in voorlopige experimenten.
- Meet volume vereist voor juiste celaantal en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 min.
- Gooi supernatant en resuspendeer de cel pellet in 40 μ l PBS ++ en 20 μ l van basaal membraan mengsel.
Opmerking: Op dit punt worden cellen behandeld met geneesmiddelen of andere testmiddelen zoals nodig voor experimenten van resuspenderen in de cel / basaalmembraan mengsel suspensie. Als alternatief, kunnen agenten worden gepipetteerd op de cel / basaal membraan mengsel schorsing na enten. - Ophalen ei rek met eieren van de incubator en plaats in de laminaire stroming kap.
- Schil tape off van het raam, op te halen een 1 mm siliconen ring van de dop van een cryogene flacon met behulp van gesteriliseerde pincet, en laat de ring door het raam.
- Pipet de 60 μ l mobiele oplossing van PBS ++ en basaal membraan Mixture direct in het midden van de silicone ring rust op de CAM.
- Re-tape het raam en beweeg ei rek terug naar incubator. Op dit punt, wees voorzichtig bij het verplaatsen van de eieren als de ring en de celsuspensie kan gemakkelijk raken ontheemd.
- Laat tumoren groeien 5 tot 7 dagen.
4. Oogsten Tumoren
- Plaats onder-pad in capuchon. Bereid 35 x 10 mm platen en paraformaldehyde containers nodig voor histologie. Zet 1 ml PBS ++ in elk 35 x 10 mm plaat.
- Plaats biohazard zak in kap. Neem steriele dissectie schaar en steek de punt in het ei bij het gat in de buurt van de gestempelde einde.
- Snijd rond het hele ei lengterichting.
OPMERKING: de CAM en de tumor met de ring moet vasthouden aan de bovenste helft van de shell met het raam. - Gebruik dissectie scharen en pincetten, ontleden de tumor van het CAM en plaats tumor in de 35 x 10 mm plaat. Meten en te wegen tumoren. Vaste tumoren in paraformaldehyen dan de paraffine-inbedding ze voor gebruik in de histologie en immunohistochemie experimenten.
5. (Optioneel): Tumor Cell Dissociatie
- Gebruik dissectie schaar om de tumor in de 35 x 10 mm plaat blad voor de mond. Giet gehakt tumor in een 15 ml centrifugebuis en verwijder zo veel PBS ++ mogelijk door middel van pipetteren.
- Voeg 2 ml collagenase (1 mg / ml in PBS ++), draai buis over meerdere malen en incubeer buis bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten (tot enkele uren).
- Voeg 5 ml medium aan elke buis en resuspendeer grondig op en neer te pipetteren 20 - 40x. Grondige pipetteren is van cruciaal belang voor een volledige cel dissociatie.
- Sta neerslag bezinken, en breng de supernatant naar een nieuwe buis. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 min. Verwijder supernatant, met achterlating van gedissocieerde celpellet.
Opmerking: Op dit punt kan celpellets worden gebruikt voor verschillende experimenten (flow cytometrie, lysis gebruikt in Western blotting, RNA-isolatie, etc). Totaal aantal tumorcel kan ook worden verkregen met behulp van een hemocytometer en trypan blauw kleuring. Merk op dat kleinere ovale cellen kippen cellen van de CAM en mag niet als tumorcellen. Er moet een minimum aantal contaminerende niet-tumor (CAM) cellen of de tumor weg zorgvuldig ontleed uit de CAM zijn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Representatieve foto belangrijkste stappen in het protocol worden hier getoond. Figuur 1A toont het gebruik van de candler het ontwikkelende embryo, de luchtzak en het vaatstelsel van de CAM visualiseren. Figuur 1B-1C tonen het proces van het vervallen van de CAM door de twee gaten en het vervolgens toepassen onderdruk via de veiligheids- lamp en figuur 1D toont een succesvol liet CAM met een grote luchtbel onder potlood gemerkt hole. Figuur 1E en figuu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een aantal belangrijke stappen in dit protocol waarschijnlijk goed voor de verbeterde embryo overleving evenals verhoogde betrouwbaarheid van tumorgroei. Laten vallen van de CAM uit de buurt van de schaal door te zuigen aan de luchtzak is minder invasief dan andere bestaande methoden (met behulp van een naald aan albumine uit het ei, stompe dissectie, enz. Te verwijderen). Met behulp van een steriele punaise op de twee kleine gaten vereist voor deze methode te maken is de meest uitdagende deel van het protocol. Het gebr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
A.S. ontvangt financiering van het farmaceutische bedrijf Advaxis om een door onderzoekers geïnitieerde klinische proef te ondersteunen.
Dankbetuigingen
A.S. werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) en het National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
Het Howard Hughes Medical Institute heeft financiering verstrekt voor M.L. via het HHMI Medical Research Fellows Program.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
Referenties
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241(2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58(2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522(2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485(2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
