Methodenartikel

Teelt van

21.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52412

⸱

6 april 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunology and Infection Research, University of Edinburgh, 2Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research

In dit artikel

Samenvatting

Heligmosomoides polygyrus is een muizen nematode met krachtige immunomodulerende mogelijkheden die sterk lijken op die van zeer voorkomende menselijke worminfecties. Hier beschrijven we een protocol voor het onderhoud van de H. langdurige polygyrus levenscyclus.

Samenvatting

Heligmosomoides polygyrus (voorheen bekend als Nematospiroides dubius, en ook genoemd door sommigen als H. bakeri) is een gastro-intestinale worminfecties die meerdere immunomodulerende mechanismen hanteert om chronische infectie te vestigen in muizen en lijkt voorkomende menselijke worminfecties. H. polygyrus is uitgebreid onderzocht op het gebied van helminthen afgeleide immuunregulatie en is gebleken krachtig onderdrukken experimentele modellen van allergie en auto-immuniteit (zowel actieve infectie en geïsoleerd uitgescheiden producten). De in dit document beschreven protocol schetst het beheer van de H. polygyrus levenscyclus voor een consistente productie van L3 larven, het herstel van de volwassen parasieten, en het verzamelen van hun excretie-secretoire producten (HES).

Inleiding

Heligmosomoides polygyrus is een natuurlijke muizen gastro-intestinale worminfecties, dat nauw verwant is aan zeer voorkomende menselijke nematode parasieten 1. In tegenstelling tot andere nematode modellen zoals Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus stelt consequent chronische infectie bij muizen als een direct gevolg van meerdere krachtige immunomodulerende mechanismen die zij in dienst bij de gastheer immuunrespons 2 onderdrukken.

H. polygyrus heeft een directe levenscyclus: infectieuze L3 larven worden ingenomen door FECO-orale transmissie (of door orale maagsonde in het laboratorium setting toegediend), waarna ze migreren naar de subserosal laag van de twaalfvingerige darm en encyst alvorens terug te keren naar het darmlumen als volwassen wormen ongeveer acht dagen na de eerste infectie. Paring en de productie van eieren gebeurt op dag 10 en het is mogelijk om volwassen wormen voor cultuur en verzamelen van excretie-secretoire producten van da oogsteny 14 vanaf 3. H. polygyrus interageert ook met de commensale microflora, met verhoogde Lactobacilli aanwezig in geïnfecteerde vatbare muizen 4-6 en verhoogde H. polygyrus infectie na blootstelling van muizen om Lactobacillen 6.

Actieve infectie met H. polygyrus is aangetoond tegen immunopathologie vele diermodellen van autoimmuniteit 7-10, colitis 11,12 en allergie 13-16. Er werd dan ook grote interesse in het potentieel van uitscheidingsmechanisme-Secretory moleculen van deze parasiet ("HES") naar beneden-moduleren pathologie in vivo 17,18. Inderdaad, zijn beschermende effecten waargenomen na behandeling van muizen met HES producten 19 tot en paden die nu worden geïdentificeerd 18,20. Hier beschrijven we een protocol voor de betrouwbare productie van Heligmosomoides polygyrus en invordering van haar afgescheiden productendat verder kan worden gebruikt voor verschillende functionele biochemische en immunologische onderzoeken.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures in dit protocol worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die door het Verenigd Koninkrijk van Binnenlandse Zaken en de Universiteit van Edinburgh Veterinary Services instellen.

1. Infectie van Muizen door Gavage

  1. Store Heligmosomoides polygyrus L3 larven in gedestilleerd water voor maximaal zes maanden bij 4 ° C.
  2. Voor het gebruik, wassen L3 larven drie keer in gedestilleerd water: centrifuge bij 300 xg gedurende 10 min (met rem), verwijder alle maar 500 ul van water (om storende gepilleerd L3 larven te voorkomen) en resuspendeer de pellet elke keer.
  3. Voor de derde maal, voeg water toe tot een exacte volume (gewoonlijk 40 ml) en zuig 20 gl met 200 ul tip gesneden zijn opening verbreden. Plaats twee 20 ul monsters op het oppervlak van een 60 mm kweekschaal en tel de L3 larven (meestal mobiel en best bekeken onder 50x vergroting met een dissectie microscoop). Resuspendeer de laatste pellet in gedistilleerd water om een ​​concentration van 2.000 L3 larven per ml.
  4. Voor levenscyclus productie, infecteren 8 weken oude F1 (C57BL / 6xCBA) muizen met 400 H. polygyrus L3 larven in 200 ul van gedestilleerd water door orale sondevoeding (bedwingen muizen in de verticale positie door de nekvel en voorzichtig langs de botte maagsonde naald door de mond en de slokdarm naar de maag). Schud grondig vóór elke infectie (larven vestigen snel in water) en zuig 200 ui in een spuit van 1 ml; gebruik maken van een speciale sondenaald met een afgerond uiteinde. Voor experimentele infectie van jongere muizen (6-8 weken oud), of andere ingeteelde stammen (bijvoorbeeld C57BL / 6 of BALBc), infecteren muizen met 200 L3 larven.

2. Voortplanting en onderhoud van H. polygyrus

  1. Plaats houtskool in het centrum van een grote plastic kuip en laat koud leidingwater te lopen over het voor een minimum van 30 min (ongewassen actieve kool is giftig voor L3 larven). Tap het water uit het bad en plaats de houtskool op two lagen van absorberend papier, waardoor het blootgesteld aan lucht in de ruimte tot het volledig droog.
  2. Als eieren vereist, schraap uitwerpselen eerst uit het colon met een tang (en schaar indien nodig). Als een groot aantal L3 larven nodig, plaatst muizen op een draadrooster en laat fecale pellets gedurende enkele dagen.
  3. Meng de ontlasting met gekorrelde houtskool in een verhouding van ten minste 1: 1, tot een consistentie net vochtig genoeg te houden aan filtreerpapier. Smeer een dunne laag op het midden van een aantal vochtige filtreerpapier in een petrischaal en plaats deze in een vochtige doos (voeg wat vochtige papieren handdoek en een schotel van water) in het donker voor de 12-14 dagen.
  4. Verwijder L3 larven van dag 7 verder, en verzamel ze op ten minste twee keer voordat het papier wordt weggegooid. De larven een ring rond de rand van het filtreerpapier; Til het filter papier uit de petrischaal en spoel de larven die nog over zijn van de plaat (met behulp van een pipet en 5 ml steriel water per plaat) in een 50 ml buis.
  5. Liftuit het filter met het oogsten van de resterende larven links op de plaat met gedestilleerd water in een 50 ml buis. Centrifugeer het effluent oplossing bij 300 xg gedurende 10 min. Was de larven driemaal met gedestilleerd water en bewaar bij 4 ° C bij 50 ml gedestilleerd water tot nodig.
    OPMERKING: Larven levensvatbaar blijven en besmettingen ten minste 6 maanden.

3. Het verzamelen van Adult H. polygyrus Worms

  1. Bereid de gemodificeerde Baermann Inrichting tevoren figuur 1.
  2. Ruiming muizen veertien dagen na infectie.
  3. Was de buik met 70% ethanol. Snijd de huid over de buik en trek terug naar de voorste buikwand onthullen. Maak middellijn incisie aan de peritoneale holte voeren.
  4. Verwijder de gehele dunne en dikke darm (van proximale twaalfvingerige darm tot distale rectum). Leg in een droge petrischaal.
  5. Strek de darm over de volledige lengte; uitsnijden de ontlasting bevattende colon; plaats deze in een apart schaaltje voor ei voorbereidingen later.
  6. Accijnzen de proximale 20 cm van de dunne darm dat de volwassen wormen -identified door de relatief dikke wand van het duodenum en vaak een rode uitstraling door de intra-luminale wormen bevat. Plaats in een (100 mm diameter) petrischaal met 5 ml Hanks 'oplossing, verwarmd tot 37 ° C (twee monsters per schaal).
  7. Open de-worm gevuld proximale darm deel in de lengte met een schaar (round-ended schaar zijn het beste voor deze), en schraap beneden binnenkant van de darm voering met twee glaasjes om de wormen te verwijderen. Gooi dan de schone darmwand.
  8. Tip wormen in kleine mousseline tassen, nieten gesloten en veilig met paperclips rond de rand van de glazen trechter (figuur 1).
  9. Vul trechter met Hanks 'Solution en voeg ongeveer 4 petrischalen van wormen in elke trechter.
  10. Zet het apparaat op 37 ° C incubator voor 1-2 uur, halverwege voorzichtig schudden door te verjagenpuin van de darm voorbereiding die de mousseline filter kan verstoppen. Zorg ervoor dat het morsen van puin buiten de mousseline zak te vermijden - dit zal vervuiling van de uiteindelijke HES voorbereiding veroorzaken. Volwassen wormen moet langzaam gemigreerd door neteldoek en zich op de bodem van de glazen reageerbuis. Voorzichtig los van de reageerbuis uit het aansluiten van rubberen slang boven de gootsteen (zorg om te voorkomen dat wormen op dit punt).
  11. Met behulp van een plastic pipet de wormen in een 50 ml buis en was zes keer met Hanks 'Solution (laten wormen om media af te wikkelen met de zwaartekracht, verwijderen met een stripette, voeg 40 ml Hanks' oplossing en herhaal vijf keer).
    OPMERKING: worm cultuur moet steriel gehouden worden vanaf dit punt.
    1. Naar een laminaire stroming kap en was nog zes keer in oplossing steriele Hanks 'aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, klaar voor in vitro kweek.
  12. Tel devolwassen wormen hersteld door het nemen van twee monsters van 20 ul in beslag genomen met een gele tip gesneden om haar diafragma te verruimen; verwachten dat ongeveer 50% van de hoeveelheid geënte larven.

4. Installatie culturen voor HES: Medium Voorbereiding, wassen volwassen wormen

  1. Week de wormen 3.11 ongeveer 10 ml RPMI aangevuld met 10% gentamycine gedurende 20 minuten, waardoor de buis rust in een hoek te waarborgen wormen volledig afgedekt.
  2. Voer deze in een laminaire stroming kap: Was opnieuw zesmaal Hanks 'oplossing (aangevuld met 5 U / ml penicilline en 5 ug / ml streptomycine).
  3. Bereid H. polygrus media.
  4. Handhaving steriliteit in een laminaire stroming kap, 500 ml RPMI1640, voeg 11,1 ml 45% glucose (eindconcentratie 1,2% als RPMI 1640 bevat 0,2% glucose), 5 ml 100x Peniclllin-streptomycine (eindconcentratie 5 U / ml penicilline, 5 ug / ml streptomycine), 5 ml L-glutamine (eindconcentratie 2 mM), en5 ml gentamycine (eindconcentratie 1%). Laat FCS niet toevoegen.
  5. Portie wormen in ontlucht T25 flessen, ong. 1000 wormen in 15 ml H. polygyrus media per fles, en plaats rechtop in 37 ° C incubator (5% CO 2) gedurende 3 weken.

5. Bereiding van HES

  1. Verzamel HES-bevattende kweekmedia uit culturen met tussenpozen van niet meer dan twee keer per week, afgezien van de eerste collectie na 24 uur van de cultuur (vanwege de hoge niveaus van LPS besmetting en gastheereiwitten - kan apart worden verwerkt of verwijderd). Houd elke collectie gescheiden en duidelijk zijn gemarkeerd met de datum en het nummer van de partij. Vervangen door een gelijk volume H. polygyrus media bij elke gelegenheid.
  2. Centrifuge HES-bevattende media bij 400 x g gedurende 5 min. Vervolgens filteren steriliseren door 0,2 micrometer eiwitarme-bindend filters in 50 ml buizen. Bewaren in de -20 ° C vriezer duidelijk gelabeld met datum van worm oogst en datum van HES collectie.
  3. Na 21 dagen van HES collectie van cultuur, gooi wormen.
  4. Pool 500-1.000 ml HES supernatant (meestal van bevroren voorraad, en niet met inbegrip van de eerste 24 uur verzamelen) en concentreer je dan een 3000 MWCO filter in de ultrafiltratie apparaat onder stikstofdruk.
    LET OP: Wees zeer voorzichtig het filter drooglopen niet te laten.
    1. Voor het instellen van het filter apparaat, eerst was de 3 kDa membraan glimmende kant naar beneden in een 1 liter beker met gedestilleerd water gedurende 3 x 20 min roeren. Monteer de ultrafiltratie inrichting volgens instructies van de fabrikant met filtermembraan glanzende zijde. Plaats in de kast bij 4 ° C en laat 50 ml gedestilleerd water door voordat u begint met gepoolde HES concentreren.
    2. Naar elke buis van HES in de filtratie-inrichting vereist (100-140 ml per dag), totdat het volume geconcentreerd tot 2-5 ml.
  5. Om verontreinigingen uit de HES-bevattende kweekmedia verwijderen, 50 ml pyr voegenOgen-vrij PBS om de filterinrichting en vervolgens ingedampt tot ongeveer 2 ml. Herhaal deze stap tweemaal (150 ml PBS in totaal). Breng HES in een 15 ml buis, filter steriliseren (met een 0,2 urn filter) in een laminaire stroming kap en eiwitconcentratie te meten met een spectrofotometer (E 280 = 10) of door Bradford assay.
  6. Portie, label met batchnummer en datum, en bevriezen bij -80 ° C.
  7. Voer een chromogene LAL assay volgens de protocollen van de fabrikant op elke partij HES vóór gebruik. Als LPS niveaus groter dan 1 U LPS per 1 ug eiwit overwegen niet deze batch in vivo of in vitro culturen.
  8. Verwerk de gegevens over 24 uur apart op dezelfde wijze HES; zal LPS en enige gastheer eiwitten en, hoewel niet geschikt voor functionele experimenten, is een nuttige bron van individuele moleculen die door monoklonaal antilichaam affiniteit zuivering kan worden geïsoleerd.

Resultaten

Vatbaarheid voor infecties met H. polygyrus wordt geregeld in hoge mate door de genetische achtergrond van de muizenstam (tabel 1); C57BL / 6 en CBA muizen zeer gevoelig 21,22. Voor onderhoud van de parasiet levenscyclus is de F1 hybride tussen deze twee stammen gekozen vanwege zijn vermogen om veel hogere worm lasten weerstaan ​​zonder morbiditeit (overmatige intestinale epitheliale schade) vergeleken met elk ouderstam. Orale gavage 400 L3 larven wordt gebruikt om de levenscyclus F1 muizen houden (om volwassen worm lasten getoond in figuur 2), terwijl een dosis van 200 L3 larven wordt algemeen gebruikt voor experimenten bij homozygote ingeteelde stammen (bijvoorbeeld C57BL / 6 of BALBc). Echter, kan het nodig zijn deze dosering te worden verlaagd, afhankelijk van het milieu co-factoren die kunnen verschillen tussen dierlijke faciliteiten, zoals variaties in de darmflora.

Batches van HES hebben reproduceerbaar effi bewezenwerkzaamheid in functionele assays en in eiwitsamenstelling; Bovendien, wanneer supernatanten van elke volgende week kweek geanalyseerd, tot een totaal van 4 weken werden de eiwitprofielen gevonden vergelijkbaar te zijn (figuur 3). Wanneer HES concentratie wordt gemeten door Bradford assay (zie 5.5), de totale eiwit is meestal ongeveer 1 mg / ml (Figuur 4).

Een alternatieve werkwijze voor het concentreren HES is een centrifugale concentrator (bijv Vivaspin 3-kDa cut-off membraan), waarin monsters worden gecentrifugeerd bij maximaal 4,000 g een swing-out rotor centrifuge verwijderen bufferzouten en laagmolecuulgewichtcomponenten. Centrifugale concentratie is het meest geschikt om kleine verwerken volumes (1-10 ml) en zijn beperkt tot een maximale concentratie factor van circa 30x.

Bij het verzamelen van HES, het vermijden van contaminatie is van cruciaal belang. Om besmetting met gastheer moleculen voorkomen, HES-cont gooi weaining cultuur media uit de eerste 24 uur na de volwassen worm oogst van de muis darm. We het niveau van de LPS besmetting kwantificeren ook in elke partij van HES met een Chromogene LAL-test (zie 5.7). 1 U van LPS komt neer op ~ 100 pg LPS en niveaus onder deze zijn verwaarloosbaar 23 beschouwd. In onze handen meeste partijen HES aanzienlijk onder deze grens, de gemiddelde concentratie van LPS HES zijnde 0,23 U / mg (figuur 5). De effecten van LPS in in vivo modellen van pathologie (bijvoorbeeld de onderdrukking van astmatische reacties) vereist ten minste 10 ng LPS 23. Vandaar dat in vivo toediening van 5 ug HES uit een hoeveelheid van 100 pg LPS / ug HES omvatten 500 pg LPS, ruim onder de effectieve concentratie waarbij LPS een probleem.

figure-results-1
Figuur 1: Baermann Apparatus Baermann Apparatuur setup voor het verzamelen van volwassen H. polygyrus (zoals beschreven in paragraaf 2).

figure-results-2
Figuur 2: Gemiddelde Worm Burden 14 dagen na infectie met 400 L3 larven Mean worm lasten 14 dagen na infectie met 400 L3 larven. Datapunten zijn afkomstig uit 19 afzonderlijke rondes van infectie van C57BL / 6xCBA muizen. Gemiddelde ± SEM getoond.

figure-results-3
Figuur 3: Eiwit Profielen van HES Van Opeenvolgende Weken in Cultuur SDS-PAGE profiel van HES eiwitten in opeenvolgende weken van de cultuur verzameld.

figure-results-4
Figuur 4: Definitieve Hoeveelheid HES van 500 ml ES-bevattende media Opbrengst van HES eiwit uit 11 verschillende batches afgeleid van ongeveer 500 ml kweeksupernatans. Gemiddelde ± SEM getoond.

figure-results-5
Figuur 5: LPS besmetting van HES Niveaus van LPS besmetting 41 batches van HES gemeten met de Limulus ameobocyte assay. Mediane LPS concentratie = 86 U per mg van HES.

figure-results-6
Figuur 6: Geanimeerde Schematische van H. polygyrus Life Cycle Samenvatting van de belangrijkste fasen in de levenscyclus van orale sondevoeding van L3 larven, door herstel van de larven en volwassen wormen tot isolatie van HES.

figure-results-7
Figuur 7: Animated Schematische van HES en haar functies Toets immunomodulerende effecten van oplosbare mediatoren en exosomen bevat binnen HES.

Genotype (en achtergrond stam) Primaire Infectie Fenotype Verwijzing
Inteeltstammen
A / J, CBA, C3H- Zeer vatbaar 22,29
C57BL / 6 en C57BL / 10 Vatbaar 22,30
BALB / c, DBA / 2, 129 / J Tussen- 22,31
NIH, SJL, SWR Lage gevoeligheid 22,32
Transgene voor cytokinen en cytokine-receptoren
IL-1β - / - Vatbaarder 33
IL-1R - / - Minder gevoelig (a); geen verandering in gevoeligheid maar verhoogde granulomen (b) (A) 33
(B) 34
IL-2Rp Transgene (C57BL / 6) Bestendig 35
IL-4 - / - Hogere vruchtbaarheid 36
IL-4R - / - (C57BL / 6 of BALB / c) Zeer vatbaar 22
IL-6 - / - (BALB / c of C57BL / 6) Zeer goed bestand 37
IL-9 transgene(FVB) Bestendig 38
IL-21R - / - (C57BL / 6) Deficiënt Th2, verminderde granuloom gormation 39,40
IL-25 - / - (BALB / c) Vatbaarder 33
IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) Geen verandering in gevoeligheid 33
TGFβRIIdn (C57BL / 6) Hoge Th1, verhoogde gevoeligheid 41,42
Transgene voor T-cel markers
CD28 - / - (BALB / c) Marginaal hoger vruchtbaarheid 43
CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) Hogere vruchtbaarheid 44
OX40L - / - (BALB / c) Hogere vruchtbaarheid &# 160; 45
Transgeen voor aangeboren immuunsysteem loci
Type 1 interferon receptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) Hogere vruchtbaarheid, meer granulomen 34
MyD88 - / - (C57BL / 6) Meer resistent, meer granulomen 34
C-KitW / Wv (WBB6) Vatbaarder 46,47

Tabel 1: Primaire infecties met H. polygyrus in genetisch verschillende en gen-Gerichte muis stammen.

Discussie

De levenscyclus van H. polygyrus verloopt in een betrouwbaar consistente wijze. Na natuurlijke inslikken of orale gavage van L3 larven op dag 0, cysten beginnen te vormen onder de twaalfvingerige serosa op dag 5, overgaand in larvale vervellingen en opkomende als volwassen wormen in het darmlumen van dag 10 kunnen de eieren worden gezien in feces van dag 14 en granulomen zijn zichtbaar op de duodenale serosale oppervlak van dag 21. De hierboven beschreven (en samengevat in figuur 6) protocol maakt high-throughput productie van H. polygyrus excretory-uitscheidingsproducten (HES), naast betrouwbaar herstel van levensvatbare L3 larven toekomstige experimentele en levenscyclus infecties.

H. polygyrus infectie aangetoond beschermend in modellen van astma afhankelijk OVA of Der p 1 (huisstofmijtallergeen) 14 zijn. Bovendien kon onderdrukking van luchtwegontsteking worden overgedragen met CD4 + CD25 + regulerende T-cellen 14 of CD19 + CD23 hi regulerende B-cellen 24 van niet-gesensibiliseerde, H. polygyrus geïnfecteerde muizen. In modellen van auto-immuniteit, H. polygyrus infectie is aangetoond suppressieve in experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) model voor multiple sclerose 9 zijn, en onderdrukking kunnen worden overgedragen met ofwel CD4 + T cellen of CD19 + B-cellen van geïnfecteerde muizen 24.

Heligmosomoides polygyrus excretory-uitscheidingsproducten (HES) moduleren de immuunrespons en onderdrukken Th2 gemedieerde inflammatie door verschillende mechanismen (aangegeven in figuur 7), inclusief: a) Remming van dendritische cel respons op stimulatie 25, b) inductie van CD4 + Foxp3 + regulerende T-cellen 18. en c) blokkade van IL-33 productie 20. HES is aangetoond beschermend te zijn wanneer toegediendt overgevoeligheid of uitdaging in de OVA-aluin model van astma 19 en ook wanneer intranasaal toegediend met Alternaria extract allergeen 20, door middel van onderdrukking van de vroege IL-33 release. Vermijden van LPS besmetting van HES is vaak cruciaal voor het succes van toekomstige immunologische experimenten. In het protocol hier geschetst, de kritische stappen in het bereiken van deze zijn om dat puin opgenomen in de neteldoek zakken van de Baermann apparaat overschrijdt niet de laatste HES voorbereiding voer te waarborgen (zie 2.10) en opzij te zetten ES oplossing uit de eerste 24 uur van de cultuur (zie 5.1).

In de afgelopen jaren heeft HES grondig gekarakteriseerd aan de proteomics-niveau met meer dan 370 verschillende eiwitten geïdentificeerd 26,27. Bovendien heeft ES van de 4e graad larven ondergaan proteoomanalyse 28. Lopende werk omvat het karakteriseren van de belangrijkste glycaan- componenten van HES, bekende sterk immunogeen 3 te zijn, en uitgescheiden micro-RNAls die zijn ingekapseld in 50-100 nm blaasjes of exosomen (Buck et al., Ingediend voor publicatie). Met de oprichting van reproduceerbare protocollen voor het verzamelen van ES van deze zeer immunomodulerende parasiet, en met uitgebreide proteomics identificatiegegevens van de moleculaire componenten van HES, is het podium nu voor de identificatie en therapeutische testen van individuele moleculen van H. polygyrus die belangrijke effecten op de gastheer immuunsysteem mediëren.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

De auteurs worden gefinancierd door de Wellcome Trust via de Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) en Programme Grant (Y.H. en R.M.M.) en Fellowship (J.R.G) financiering, de BBSRC (G.C.), de American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. en R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) en de Rainin Foundation (D.J.S. en R.M.M.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amicon concentratorMillipore5112Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solutionSigmaH9394500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en®ion=GB
Penicillin streptomycinInvitrogen15070-063100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamineInvitrogen25030-081200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoalMerck1.09624.050018-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solutionSigmaG8769100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en®ion=GB
Falcon tubesSarstedt62.547.25450 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 FlasksSigmaCLS430639 25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en®ion=GB
Chromogenic LAL assayLonza50-647UQCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
GentamicinGibco15710-049100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640Gibco11875093500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

Referenties

  1. Monroy, F. G., Enriquez, F. J. Heligmosomoides polygyrus : a model for chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today. 8, 49-54 (1992).
  2. Maizels, R. M., et al. Immune modulation and modulators in Heligmosomoides polygyrus infection. Exp. Parasitol. 132, 76-89 (2012).
  3. Hewitson, J. P., et al. Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant nonprotective antibody response directed at restricted glycan and peptide epitopes. J Immunol. 187, 4764-4777 (2011).
  4. Walk, S. T., Blum, A. M., Ewing, S. A., Weinstock, J. V., Young, V. B. Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis. 16, 1841-1849 (2010).
  5. Rausch, S., et al. Small intestinal nematode infection of mice Is associated with increased enterobacterial loads alongside the intestinal tract. PLoS ONE. 8, e74026(2013).
  6. Reynolds, L. A., et al. Commensal-pathogen interactions in the intestinal tract: Lactobacilli promote infection with, and are promoted by, helminth parasites. Gut Microbes. 5, 10-19 (2014).
  7. Saunders, K. A., Raine, T., Cooke, A., Lawrence, C. E. Inhibition of autoimmune type 1 diabetes by gastrointestinal helminth infection. Infect Immun. 75, 397-407 (2007).
  8. Liu, Q., et al. Helminth infection can reduce insulitis and type 1 diabetes through CD25- and IL-10-independent mechanisms. Infect Immun. 77, 5347-5358 (2009).
  9. Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., Doligalska, M. Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp Parasitol. 132, 243-248 (2012).
  10. Mishra, P. K., Patel, N., Wu, W., Bleich, D., Gause, W. C. Prevention of type 1 diabetes through infection with an intestinal nematode parasite requires IL-10 in the absence of a Th2-type response. Mucosal Immunol. 6, 297-308 (2013).
  11. Sutton, T. L., et al. Anti-Inflammatory mechanisms of enteric Heligmosomoides polygyrus infection against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in a murine model. Infect Immun. 76, 4772-4782 (2008).
  12. Hang, L., et al. Heligmosomoides polygyrus bakeri infection activates colonic Foxp3+ T cells enhancing their capacity to prevent colitis. J Immunol. 191, 1927-1934 (2013).
  13. Bashir, M. E., Andersen, P., Fuss, I. J., Shi, H. N., Nagler-Anderson, C. An enteric helminth infection protects against an allergic response to dietary antigen. J Immunol. 169, 3284-3292 (2002).
  14. Wilson, M. S., et al. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells. J. Exp. Med. 202, 1199-1212 (2005).
  15. Kitagaki, K., et al. Intestinal helminths protect in a murine model of asthma. J Immunol. 177, 1628-1635 (2006).
  16. Hartmann, S., et al. Gastrointestinal nematode infection interferes with experimental allergic airway inflammation but not atopic dermatitis. Clin Exp Allergy. 39, 1585-1596 (2009).
  17. Pritchard, D. I., Lawrence, C. E., Appleby, P., Gibb, I. A., Glover, K. Immunosuppressive proteins secreted by the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. Int. J. Parasitol. 24, 495-500 (1994).
  18. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-β pathway. J Exp Med. 207, 2331-2341 (2010).
  19. McSorley, H. J., et al. Suppression of type 2 immunity and allergic airway inflammation by secreted products of the helminth Heligmosomoides polygyrus. Eur. J. Immunol. 42, 2667-2682 (2012).
  20. McSorley, H. J., Blair, N. F., Smith, K. A., McKenzie, A. N. J., Maizels, R. M. Blockade of IL-33 release and suppression of type 2 innate lymphoid cell responses by helminth secreted products in airway allergy. Mucosal Immunol. 7, 1068-1078 (2014).
  21. Behnke, J. M., Menge, D. M., Noyes, H. Heligmosomoides bakeri: a model for exploring the biology and genetics of restance to chronic gastrointestinal nematode infections. Parasitology. 136, 1565-1580 (2009).
  22. Filbey, K. J., et al. Innate and adaptive type 2 immune cell responses in genetically controlled resistance to intestinal helminth infection. Immunology and Cell Biology. 92, 436-448 (2014).
  23. Bortolatto, J., et al. Toll-like receptor 4 agonists adsorbed to aluminium hydroxide adjuvant attenuate ovalbumin-specific allergic airway disease: role of MyD88 adaptor molecule and interleukin-12/interferon-gamma axis. Clin Exp Allergy. 38, 1668-1679 (2008).
  24. Wilson, M. S., et al. Helminth-induced CD19+CD23hi B cells modulate experimental allergic and autoimmune inflammation. Eur J Immunol. 40, 1682-1696 (2010).
  25. Segura, M., Su, Z., Piccirillo, C., Stevenson, M. M. Impairment of dendritic cell function by excretory-secretory products: A potential mechanism for nematode-induced immunosuppression. Eur J Immunol. 37, 1887-1904 (2007).
  26. Hewitson, J. P., et al. Proteomic analysis of secretory products from the model gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus reveals dominance of Venom Allergen-Like (VAL) proteins. J Proteomics. 74, 1573-1594 (2011).
  27. Moreno, Y., et al. Proteomic analysis of excretory-secretory products of Heligmosomoides polygyrus assessed with next-generation sequencing transcriptomic information. PLoS Negl Trop Dis. 5, e1370(2011).
  28. Hewitson, J. P., et al. Secretion of protective antigens by tissue-stage nematode larvae revealed by proteomic analysis and vaccination-induced sterile immunity. PLOS Pathogens. 9, e1003492(2013).
  29. Prowse, S. J., Mitchell, G. F. On the choice of mice for dissection of strain variations in the development of resistance to infection with Nematospiroides dubius. Austral J Exp Biol Med. 58, 603-605 (1980).
  30. Behnke, J. M., Robinson, M. Genetic control of immunity to Nematospiroides dubius: a 9-day anthelmintic abbreviated immunizing regime which separates weak and strong responder strains of mice. Parasite Immunol. 7, 235-253 (1985).
  31. Zhong, S., Dobson, C. Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122-131 (1996).
  32. Behnke, J. M., et al. Genetic variation in resistance to repeated infections with Heligmosomoides polygyrus bakeri, in inbred mouse strains selected for the mouse genome project. Parasite Immunol. 28, 85-94 (2006).
  33. Zaiss, M. M., et al. IL-1β suppresses innate IL-25 and IL-33 production and maintains helminth chronicity. PLoS Pathog. 9, e1003531(2013).
  34. Reynolds, L. A., et al. MyD88 signaling inhibits protective immunity to the gastrointestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. J Immunol. , (2014).
  35. Morimoto, M., Utsumiya, K. Enhanced protection against Heligmosomoides polygyrus in IL-2 receptor β-chain overexpressed transgenic mice with intestinal mastocytosis. J Vet Med Sci. 73, 849-851 (2011).
  36. Urban, J. F., Katona, I. M., Paul, W. E., Finkelman, F. D. Interleukin 4 is important in protective immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 5513-5517 (1991).
  37. Smith, K. A., Maizels, R. M. IL-6 controls susceptibility to helminth infection by impeding Th2 responsiveness and altering the Treg phenotype in vivo. Eur J Immunol. 44, 150-161 (2014).
  38. Hayes, K. S., Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Immune-mediated regulation of chronic intestinal nematode infection. Immunol Rev. 201, 75-88 (2004).
  39. Fröhlich, A., et al. IL-21 receptor signaling is integral to the development of Th2 effector responses in vivo. Blood. 109, 2023-2031 (2007).
  40. King, I. L., Mohrs, K., Mohrs, M. A nonredundant role for IL-21 receptor signaling in plasma cell differentiation and protective type 2 immunity against gastrointestinal helminth infection. J Immunol. 185, 6138-6145 (2010).
  41. Ince, M. N., et al. Role of T cell TGF-β signaling in intestinal cytokine responses and helminthic immune modulation. Eur J Immunol. 39, 1870-1878 (2009).
  42. Reynolds, L. A., Maizels, R. M. Cutting Edge: In the absence of TGF-β signaling in T cells, fewer CD103+ regulatory T cells develop, but exuberant IFN-γ production renders mice more susceptible to helminth infection. J Immunol. 189, 1113-1117 (2012).
  43. Ekkens, M. J., et al. Memory Th2 effector cells can develop in the absence of B7-1/B7-2, CD28 interactions, and effector Th cells after priming with an intestinal nematode parasite. J Immunol. 168, 6344-6351 (2002).
  44. Greenwald, R. J., et al. B7-2 is required for the progression but not the initiation of the type 2 immune response to a gastrointestinal nematode parasite. J. Immunol. 162, 4133-4139 (1999).
  45. Ekkens, M. J., et al. The role of OX40 ligand interactions in the development of the Th2 response to the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. J. Immunol. 170, 384-393 (2003).
  46. Hashimoto, K., et al. Immunity-mediated regulation of fecundity in the nematode Heligmosomoides polygyrus--the potential role of mast cells. Parasitology. 137, 881-887 (2010).
  47. Hepworth, M. R., et al. Mast cells orchestrate type 2 immunity to helminths through regulation of tissue-derived cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 6644-6649 (2012).

Herprints en machtigingen

Tags

Excretoire secretieproductenorale gavagewormcultuurHES-bereidingmuisinfectielarvenverzamelingherstel van volwassen wormensteriele techniekultrafiltratie
Teelt van
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.