Hier presenteren we een protocol continu kwantificeren celadhesie en de adhesie processen met hoge tijdsresolutie op niet-invasieve wijze door cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze benaderingen onthullen de dynamiek van cel adhesie / de-adhesieprocessen getriggerd door matrixmodificatie en hun temporele relatie tot adhesie-afhankelijke signalering evenementen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cel-matrix adhesie speelt een belangrijke rol in de controle celmorfologie en signalering. Stimuli die cel-matrix adhesie (bijvoorbeeld myeloperoxidase en andere matrix modificerende oxidanten / enzymen vrijkomen bij ontsteking) verstoren zijn betrokken bij het ontstaan van pathologische veranderingen in cellulaire functie fenotype en levensvatbaarheid in een aantal ziekten. Hier beschrijven we hoe cel-substraat impedantie en live cell imaging aanpak gemakkelijk kan worden gebruikt om nauwkeurig kwantificeren real-time veranderingen in celadhesie en de adhesie geïnduceerd door matrixmodificatie (met endotheelcellen en myeloperoxidase als pathofysiologische matrix modificerende stimulus) met hoge tijdsresolutie en op niet-invasieve wijze. De xCELLigence cel-substraat impedantie systeem kwantificeert continu het gebied van cel-matrix adhesie door meting van de elektrische impedantie in de mobiele substraatgrensvlak in cellen gekweekt op goud micro-elektrode arrays. Beeldanalyse van time-lapse differentiële interferentie contrast films kwantificeert veranderingen in het geprojecteerde gebied van afzonderlijke cellen in de tijd, die veranderingen in het gebied van cel-matrix contact. Beide technieken nauwkeurig te kwantificeren snelle veranderingen om cellulaire hechting en de-adhesieprocessen. Cel-substraat impedantie micro-elektrode arrays biosensor verschaft een platform voor robuuste, high-throughput metingen. Live cell imaging analyseert zorgen voor extra details met betrekking tot de aard en de dynamiek van de morfologische veranderingen gekwantificeerd door cel-substraat impedantie metingen. Deze aanvullende benaderingen leveren waardevolle nieuwe inzichten in hoe-myeloperoxidase- gekatalyseerde oxidatie van subcellulaire extracellulaire matrix componenten triggers snelle veranderingen in de cel adhesie, morfologie en signalering in endotheelcellen. Deze benaderingen zijn ook voor het bestuderen van cellulaire adhesie dynamiek in reactie op andere matrix modificerende stimuli en aanverwante hechtende cellen (bijvoorbeeld epitheelcellen).
Inleiding
Stabiele lijm contacten tussen cellen en de omringende extracellulaire matrix vereist onderhoud weefsel homeostase. Bijvoorbeeld endotheelcel adhesie aan de subendotheliale matrix bloedvaten speelt een cruciale rol bij het handhaven van de integriteit van de endotheliale laag en de homeostatische functie als regulerende, halfdoorlaatbare barrière vasculaire 1. Het actine cytoskelet is mechanisch gekoppeld met matrix moleculen op plaatsen van cel-matrix adhesie en hechtende contacten op de cel-matrix-interface lijm spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de positie van het celmembraan door weerstand centraal gerichte actomyosine trekkrachten. Extra....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Algemene endotheelcellen Culture
- Cultuur runder aorta endotheelcellen (passages 4-9) op gelatine gecoate weefselkweek kolven (laag weefselkweek oppervlak met 0,1% w / v gelatine in PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 min) in EGM-2 medium (met EGM-2 bullet kit met 5% foetaal runderserum, groeifactoren en alle supplementen van de fabrikant, behalve hydrocortison).
- Wanneer cellen bijna samenvloeiende (ca. 3 dagen na enten na een 1: 4 frames), oogsten cellen door behandeling met 0,05% w / v trypsine / 0,02% w / v EDTA in PBS bij 37 ° C. Na de meerderheid van de cellen hebben losgemaakt, voeg volledige EGM-2-media om de trypsine en vervolgens cen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Real-time kwantificering van endotheelcellen de-hechting van fibronectine in reactie op MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie (Experiment 2). Het zaaien van endotheelcellen suspensies op inheemse (MPO gratis) fibronectine of MPO-dragende fibronectine resulteert in maximale celhechting en spreiding binnen 2 uur, zoals beoordeeld door een plateauing cel indexwaarden in de cel substraat impedantiemetingen (Figuur 3A). Deze eerste fase van celhechting en spreiding wordt aanzienlijk verminde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Cel-matrix adhesie en de-adhesieprocessen nauwkeurig kan worden gekwantificeerd in real time met een hoge temporele resolutie met behulp van cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze real-time benaderingen bieden een groot voordeel ten opzichte van end-point analyses van cel adhesie, die arme temporele resolutie bieden. Door het nauwkeurig kwantificeren snelle de-hechting reacties met een hoge temporele resolutie, kunnen deze analyses kritisch inzicht in verschaffen hoe morfologische reacties op matri.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen onthullingen te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door een National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) en, gedeeltelijk, door een UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | eenmalig te gebruiken plaat voor het uitvoeren van cel-gebaseerde tests op het xCELLigence systeem |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selectieve remmer van non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endotheel cel groei media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | van bovien plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cel cultuur schaal met optisch kwaliteit glazen bodem voor beeldvorming |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | celcultuur substraat |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-vrij cel media |
| Methionine | Sigma | M9500 | blusst chlorinerende oxidanten gegenereerd door myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Bestaat uit RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station en RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
Referenties
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
