In dit artikel wordt een protocol beschreven voor de infectie van macrofagen met Cryptococcus neoformans. Ook wordt een methode uitgelegd voor het verminderen van sterolen in de macrofagen. Deze protocollen bieden een leidraad om schimmelinfecties in vitro te bestuderen en de rol van sterolen in dergelijke infecties te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Macrofagen Cholesterol Uitputting en het effect daarvan op de Fagocytose van
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cryptokokkose is een levensbedreigende infectie veroorzaakt door ziekteverwekkende schimmels van het geslacht Cryptococcus. Infectie gebeurt bij inhalatie van sporen die kunnen repliceren in de diepe long zijn. Fagocytose van Cryptococcus door macrofagen is een van de manieren waarop de ziekte kan verspreiden in het centrale zenuwstelsel dodelijke hersenvliesontsteking veroorzaken. Daarom is onderzoek naar de associatie tussen Cryptococcus en macrofagen is belangrijk voor het begrijpen van de progressie van de infectie. De onderhavige studie beschrijft stap voor stap protocol macrofaag infectiviteit bestuderen door C. neoformans in vitro. Met behulp van dit protocol, wordt de rol van gastheer sterolen op gastheer-pathogeen interacties bestudeerd. Verschillende concentraties van methyl - cyclodextrine (MCD) gebruikt om cholesterol uit muizen reticulum sarcoom macrofaag cellijn J774A.1 afbreken. Cholesterol uitputting werd bevestigd en gekwantificeerd met behulp van zowel een commercieel beschike cholesterol kwantificering kit en dunnelaagchromatografie. Cholesterol uitgeputte cellen geactiveerd met lipopolysaccharide (LPS) en interferon gamma (IFNy) en geïnfecteerd met antilichaam opsonized Cryptococcus neoformans wildtype H99 cellen bij een effector-tot-doel-verhouding van 1: 1. Geïnfecteerde cellen werden gevolgd na 2 uur incubatie met C. neoformans en de fagocytose index werd berekend. Cholesterol depletie resulteerde in een significante vermindering van de fagocytose index. De gepresenteerde protocollen bieden een handige methode om de inleiding van de infectie proces na te bootsen in een laboratoriumomgeving en bestuderen van de rol van gastheer lipidesamenstelling op besmettelijkheid.
Inleiding
Fagocytose is een proces waarbij extracellulaire entiteiten worden geïnternaliseerd door gastheercellen. Het is een belangrijk wapen in het arsenaal van het immuunsysteem om te beschermen tegen pathogenen, maar het proces kan vaak worden ondermijnd door pathogenen te zorgen voor internalisatie en verspreidt zich door het lichaam 1. Fagocytose wordt gemedieerd door verschillende signalering gebeurtenissen die de hechting en afblazen via herschikkingen van het cytoskelet gastheercel. 'Professionele fagocyten kunnen herkennen en binden opsoninen op het oppervlak van de pathogeen te signaleren bevestigen van de vorming van lamellipodia die de pathogeen ove....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cholesterol Uitputting van J774A.1 Cellen met MβCD
- In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 5 J774A.1 macrofaag-achtige cellen per putje op een 96-well celkweek plaat in 200 pl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 O / N.
- Verwijder media uit de celmonolaag en was de cellen tweemaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die is gefilterd en geautoclaveerd.
- Voeg 200 ul van MβCD oplossing in de gewenste concentratie (10 mM of 30 mM in PBS) of 1x PBS als controle en incubeer gedurende....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cholesterol Uitputting
Analyse van het supernatans gereserveerd stap 1.3 van het protocol volgens de instructies van de fabrikant in de Amplex Red Cholesterol Assay kit levert een verhoogd cholesterolgehalte in MβCD behandelde monster vergeleken met de 1x PBS controle. Afhankelijk van celtype en MβCD gebruikte concentratie cholesterol depletie kan variëren. Voor J774 behandeld met 10 mM MβCD, werd een afname van ongeveer 50% waargenomen. Uitputting kan worden berekend met waarden verkregen uit .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bij het werken met dit protocol is het belangrijk om nauwkeurige celtellingen wanneer plating zoogdiercellen en opsoniserende C. verkrijgen neoformans-cellen. Dit minimaliseert de variatie tussen onderzoeken en zeer nauwkeurig 1: 1 tot doel effectorverhouding gedurende de studie. Het is ook kritisch om de timing van de cholesterol uitputting en infectie coördineren voorkomen opsonized gistcellen of behandelde macrofaag cellen uit rusten bij kamertemperatuur tussen de procedures. Periodes lange wachtt.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies AI56168, AI71142, AI87541 en AI100631 te MDP. Maurizio Del Poeta is Burroughs Wellcome Investigator in Infectieziekten.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Bewaar op 4 °C en verwarm tot 37 °C voor gebruik |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Bewaar ingevroren op -20 °C en ontdooi voordat u toevoegt aan DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Gebruikt om DMEM te suppleren |
| Isotemp Celkweekincubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well kweekschaal | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Fosfaatgebufferde Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Verdun tot 1x en filter of autoclaveer voor gebruik. |
| Methyl-β-cyclodextrine | Sigma Life Science | C4555-10G | Los op in 1x PBS om oplossingen van 10 mM en 30 mM concentraties te maken |
| Orbitale schudder | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | Alle reagentia voor Cholesterol Assay zitten in het kit. Volg de instructies van de fabrikant. |
| 96-Well Black Assay plaat | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplaatlezer | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC kamer | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Papier | Whatman | 3030917 | Snij naar de gewenste grootte voor TLC tank |
| Afzuigkap | Elke afzuigkap die voldoet aan AIHA/ANSI Standaarden | ||
| 6-Well plaat | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsine-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Celschraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Weegschaal | Mettler Toledo | Model # MS104S meet tot 0,1 mg | |
| Glazen Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Azijnzuur | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 met concentratiezone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Jodium chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Zwavelzuur | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganchloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Gebruik de Vision Works LS software voor densitometrie analyse | |
| Glazen bodem confocale schaal | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Verkregen van Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | Zie fabrikant voor bereidingsinstructies. Gebruik een glucoseconcentratie van 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Los op in 1x PBS om 1 mg/ml stock op te maken. Bewaar op -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Los op in 1x PBS om 0,1 mg/ml stockoplossing te maken |
| Glucuronoxylomannaan antilichaam (anti-GXM) | Gift van Arturo Casadevall's Lab concentratie is 1,98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Los 0,8 g Giemsa op in 25 ml glycerol en verwarm tot 60 °C gedurende 1 uur. Voeg 25 ml methanol toe aan de oplossing en laat ten minste 1 maand op kamertemperatuur ouder worden. |
| Microscoop | Zeiss | Observer.D1 microscoop met AxioCam MRm voor het maken van afbeeldingen |
Referenties
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Ch....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
