Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Summary

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Abstract

Plantaardige systemen worden beschouwd als een waardevol platform voor de productie van recombinante eiwitten ten gevolge van hun goed gedocumenteerde potentieel voor de flexibele, goedkope productie van hoogwaardige biologisch actieve producten.

In deze studie hebben we de expressie van een doelwit menselijk recombinant eiwit in traditionele fermentatie gebaseerde celkweken (bacteriën en insecten) met plantaardige expressiesystemen, zowel transiënte en stabiele.

Voor elk platform, beschrijven we de opzet optimalisatie en lengte van het productieproces kan de uiteindelijke kwaliteit van het product en de opbrengst en we voorlopig productiekosten, specifiek voor het gekozen doelwit recombinante eiwit geëvalueerd.

Kortom, onze resultaten aan dat bacteriën niet voor de bereiding van het doeleiwit door de ophoping ervan in onoplosbare inclusielichamen. Anderzijds, plantaardige systemen zijn veelzijdig platforms thoed kan de productie van het geselecteerde eiwit tegen lagere kosten dan baculovirus / insectencel-systeem. Vooral stabiele transgene lijnen toonde de hoogste opbrengst van het eindproduct en voorbijgaande expressie planten de snelste procesontwikkeling. Kunnen echter niet alle recombinante eiwitten profiteren van plantaardige systemen, maar de beste productie platform moet empirisch worden bepaald met een case-by-case benadering, zoals hier beschreven.

Introduction

Recombinante eiwitten worden commercieel in grote hoeveelheden geproduceerd in heterologe expressiesystemen met behulp van opkomende biotechnologietools. Belangrijke factoren die in overweging moeten worden genomen bij het kiezen van het heterologe expressiesysteem zijn: eiwitkwaliteit, functionaliteit, processnelheid, opbrengst en kosten.

In het recombinante eiwitveld is de markt voor geneesmiddelen snel aan het uitbreiden en daarom worden de meeste biopharmaceuticals die vandaag worden geproduceerd recombinant. Eiwitten kunnen worden geëxpresseerd in celculturen van bacteriën, gisten, schimmels, zoogdieren, planten en insecten, evenals in plantensystemen (ofwel via stabiele- of transiënte-transformatie) en transgene dieren; elk expressiesysteem heeft zijn inherente voordelen en beperkingen en voor elk doelwit recombinant eiwit moet het optimale productiesysteem zorgvuldig worden geëvalueerd.

Plantgebaseerde platformen ontstaan als een belangrijke alternatief voor traditionele fermentor-gebaseerde systemen voor veilige en kosteneffectieve recombinante eiwitproductie. Hoewel de kosten van downstreamverwerking vergelijkbaar zijn met die van microbiële en zoogdiercellen, zijn de lagere initiële investering vereist voor commerciële productie in planten en de potentiële schaalvoordelen, geboden door cultivatie over grote gebieden, belangrijke voordelen.

We hebben planten geëvalueerd als bioreactoren voor de expressie van de 65 kDa isovorm van humaan glutamaatdecarboxylase (hGAD65), een van de belangrijkste autoantigenen bij Type 1 auto-immuun diabetes (T1D). hGAD65 wordt grotendeels aangenomen als een marker, zowel voor het classificeren en monitoren van de progressie van de ziekte en de rol ervan in T1D preventie is momenteel onderwerp van klinische onderzoeken. Als deze onderzoeken succesvol zijn, zal de wereldwijde vraag naar recombinant hGAD65 dramatisch toenemen.

Hier richten we ons op de expressie van de enzymatisch inactieve tegenhanger van hGAD65, hGAD65mut, een mutant gegenereerd door het lysineresidu dat de cofactor PLP (pyridoxaal-5'-fosfaat) bindt te vervangen door een arginineresidu (K396R)¹.

hGAD65mut behoudt zijn immunogeniciteit en accumuleert in plant- en insectencellen tot wel tien keer hoger dan hGAD65, zijn wildtype-tegenhanger. Er werd gehypothetiseerd dat de enzymatische activiteit van hGAD65 interfereert met het plantencelmetabolisme tot een zodanig punt dat het zijn eigen synthese onderdrukt, terwijl hGAD65mut, de enzymatisch inactieve vorm, in plantencellen tot hogere niveaus kan worden geaccumuleerd.

Voor de expressie van hGAD65mut werd hier het gebruik van verschillende technologieën, die veel worden gebruikt in de plantenbiotechnologie, verkend en vergeleken met traditionele expressieplatforms (Escherichia coli en Baculovirus/insectencel-gebaseerd).

In dit werk werden de recombinante platformen die zijn ontwikkeld voor de expressie van hGAD65mut, bestaande uit traditionele en plantgebaseerde systemen, beoordeeld en vergeleken op basis van processnelheid en opbrengst, en op basis van de kwaliteit en functionaliteit van het eindproduct.

Protocol

1. Bouw van Expression Vectoren

1. Commerciële recombinatie kloneringssysteem:
   1. Versterken van de volledige lengte sequentie van het doelwitgen (hGAD65mut) met geschikte primers waarbij toevoeging van een CACC klem aan het 5'-uiteinde van het gen zoals eerder beschreven ^2.
   2. Kloon de gel-gezuiverde amplificatieproduct volgens de gerichte klonering kit specificaties in de vermelding vector (topoisomerase gebonden) door het samenvoegen van de reactie in een totaal volume van 6 pl, met een 1,5: 1 molverhouding insert: vector en 1 pi zoutoplossing (0,2 M NaCl en 0,01 _MgCl2). Incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT).
   3. Transformeer de gehele reactie in chemisch competente E. coli cellen volgens gerichte klonering kit specificaties en scherm verkregen kolonies door kolonie PCR ^3, met M13 forward en reverse primers in de gerichte klonering kit. Isoleer het plasmide uit een positief kolonie volgens plasmide-DNA voorbereidingskit specificaties Type de insertie met M13 forward en reverse primers voor de afwezigheid van mutaties ³ te garanderen.
   4. Gebruik de verkregen toegang kloon aan de recombinatie reactie uit te voeren door de Lambda Recombinase Clonase II Enzyme (LR) met specifieke bestemming vectoren: voor recombinant eiwit expressie in bacteriële cellen met pDEST17 (opbrengst pDEST17.G65mut), in planten (voorbijgaande of stabiel) met pK7WG2 (opbrengst pK7WG2.G65mut), in met Baculovirus / insectencel-systeem met de gelineariseerde viraal DNA (hetgeen Baculo.G65mut) ^4. Monteer de reactie volgens clonase kit specificaties, met 100 ng van vector binnenkomst, 150 ng bestemmingsvector en 2 pl enzymmengsel in een eindvolume van 10 pl. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   5. Transformeer de recombinatie product in chemisch competente E. coli cellen volgens clonase set specificaties. Scherm verkregen kolonies door PCR ³ gebruikt voor de transformatie reactie afgeleide kolonies dezelfde omgekeerde GAD65mut-specifieke primer (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ') en de volgende specifieke bestemming vectoren voorwaartse primers: voor pDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; voor pK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; voor Baculo gelineariseerde vector: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 '.
   6. Isoleer plasmide-DNA met een commercieel minipreparation DNA kit en bevestigen de aanwezigheid van de targetsequentie door PCR ^3, met dezelfde specifieke primer combinaties in de voorgaande stap beschreven.
   7. Met de verkregen PCR-positieve plasmiden verschillende doelorganismen transformeren, afhankelijk van de gekozen recombinante eiwitexpressie zoals beschreven in de volgende stappen platform.
2. MagnICON systeem ^5-7:
   1. Kloon het doelgen in de 3'-module pICH31070, zoals eerder in detail ^7, waarbij pICH31070.G65mut. Gebruik devolgende specifieke reactie cyclus: 30 min incubatie bij 37 ° C, 5 min bij 50 ° C en daarna 5 minuten bij 80 ° C.

2. Recombinante eiwitexpressie

1. Bacteriële cel-systeem:
   1. Transformeren pDEST17.G65mut in E. coli BL21 (DE3) elektrocompetente cellen onder toepassing van standaardtechnieken en screenen de kolonies gegroeid op ampicilline-bevattende (100 ug / ml) LB-medium met kolonie-PCR met de volgende transgen-specifieke primers: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'en 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', met een hybridisatietemperatuur van 58 ° C en een rek van 20 sec. Voer de PCR-reactie in een totaal volume van 20 gl na oplossen bacteriële cellen met een plastic tip in de buis.
   2. Inoculeer een enkele kolonie gedurende de nacht bij 37 ° C in 3 ml ampicilline bevatten (100 ug / ml) LB-medium.
   3. Verdun de bacteriekweek 1: 100 in 100 ml vers LB-medium (inclusief ampicillin) en incubeer bij 37 ° C gedurende 1-6 uur totdat een uiteindelijke _OD600 van 0,8.
   4. Laten recombinant eiwit expressie door toevoeging van isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) tot een eindconcentratie van 1 mM en incubeer cultuur onder krachtig schudden gedurende 3 uur bij 37 ° C.
   5. Verzamel cellen door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 20 minuten en gebruik bacteriële pellet voor eiwitextractie (stap 3.1.1.1).
2. Baculovirus / insectencelsysteem:
   1. Zaad Spodoptera frugiperda (Sf9) cellen in 6-well platen (8 x 10 ⁵ cellen per putje) en tweemaal wassen met 2 ml van niet-aangevuld Grace's Insect Medium.
   2. Verwijder en vervang het medium druppelsgewijs met transfectie mengsel (5 ul LR recombinant reactie, 6 pl Celfectin oplossing en 200 ul niet-aangevuld Grace's Insect Medium).
   3. Incubeer de platen bij 27 ° C gedurende 5 uur.
   4. Verwijder en vervang transfectie mengsel met 2 ml verse Sf-900 medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml gentamycine en 100 uM ganciclovir recombinant Baculovirus klonen selecteren.
   5. Na incubatie gedurende 96 uur bij 27 ° C, verzamel medium (V1 virale stock), centrifugeer bij 4000 xg cellen en grof vuil en slaan verwijderen in het donker bij 4 ° C.
   6. Zaad 1 x 10 ⁶ Sf9 cellen per putje in 2,5 ml Sf-900 medium bevattende 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml gentamycine en 100 uM ganciclovir infecteren met 100 ui V1 voorraad in elke put.
   7. Incubeer cellen gedurende 3 dagen bij 27 ° C.
   8. Verzamelen en centrifuge medium bij 4000 x g.
   9. Bewaar het supernatant (V2 high-titer stock) bij 4 ° C.
   10. Zaad 1 x 10 ⁶ Sf9 cellen per putje in 2,5 ml Sf-900 medium bevattende 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml gentamycine en 100 uM ganciclovir infecteren met 25 gl V2 voorraad in elke put.
   11. Incubeer cellen gedurende 3 dagen bij 27 ° C.
   12. Verzamel cellen door centrifugeren bij 4000 xg en insectenwerend celpellet eiwitextractie (stap 3.1.2. 1).
3. Nicotiana benthamiana voorbijgaande expressie systemen:
   1. Groeien N. benthamiana planten in een kas, onder natuurlijk licht binnen het temperatuurbereik 18-23 ° C. Voor agro-infectie gebruiken 4-5 weken oude planten.
   2. Houd agroinfected planten in een klimaatkamer bij 22 ° C met een 13 uur dag / 11 uur nacht fotoperiode.
   3. Commerciële recombinatie kloneringssysteem:
      1. Breng pK7WG2.G65mut in Agrobacterium tumefaciens-stam EHA105 elektrocompetente cellen zoals eerder beschreven ⁸ en screenen de kolonies na 2 gekweekt op LB medium dat rifampicine (50 ug / ml), streptomycine (300 ug / ml) en spectinomycine (100 ug / ml) dagen incubatie bij 28 ° C, door kolonie-PCR ⁸ met de volgende transgen-specifieke primers: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; en 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', met een hybridisatietemperatuur van 58 ° C en een verlengingstijd van 50 sec. Voer de PCR-reactie in een totaal volume van 20 pl.
      2. Inoculeer bacteriën in 30 ml LB medium met rifampicine (50 ug / ml), streptomycine (300 ug / ml) en spectinomycine (100 ug / ml) gedurende twee dagen bij 28 ° C.
      3. Verzamel bacteriën door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 20 min en resuspendeer pellet in 10 ml infiltratie buffer (10 mM MES, 10 mM _MgCl2, 100 pM acetosyringoon, pH 5,6). Meet de _OD600 waarde en vervolgens aanpassen tot 0,9 door verdunning in dezelfde buffer.
         OPMERKING: het totale volume nodig is voor het infiltreren van drie N. benthamiana planten is 30 ml.
      4. Gebruik een 2,5 ml naaldloze injectiespuit aan de Agrobacterium suspensie in N. infiltreren benthamiana bladeren. Voorzichtig en langzaam te injecteren blad panelen met de vering van de spuit. Infiltreren drie uitgebreid ldakranden per plant en het gebruik van drie planten als drievoud.
         OPMERKING: voor de gezondheid en veiligheid redenen oogbescherming tijdens infiltratie proces.
      5. Verzamel agroinfiltrated bladeren 2 dagen na infectie (dpi) en vries in vloeibare stikstof. Bewaren plantenweefsel bij -80 ° C.
   4. MagnICON systeem:
      1. Breng de MagnICON vectoren - de 5 'module (pICH20111), de 3'module (pICH31070.G65mut) en het integrase module (pICH14011) - in A. tumefaciens GV3101 stam met standaardtechnieken. Zeef de kolonies gegroeid op LB medium dat 50 ug / ml rifampicine en geschikte vector-antibioticum (50 ug / ml carbenicilline voor pICH20111 en pICH14011, 50 ug / ml kanamycine voor pICH31070) door kolonie-PCR met behulp van specifieke primers voor elke vector.
      2. Te enten afzonderlijk de drie A. tumefaciens stammen in 5 ml LB medium dat 50 ug / ml rifampicine en geschikte vector-specifieke antibioticumen schud gedurende de nacht bij 28 ° C.
      3. Pellet overnacht bacteriële kweken door centrifugatie bij 4000 xg gedurende 20 min en resuspendeer ze in twee delen van de oorspronkelijke bacteriekweek van 10 mM MES (pH 5,5) en 10 mM _MgSO4.
      4. Meng gelijke volumes van bacteriële suspensies die de drie vectoren en gebruik maken van de schorsing mix voor spuit infiltratie van N. benthamiana bladeren. Infiltreren drie uitgebreid bladeren per plant.
      5. Verzamel agroinfiltrated bladeren op 4 dpi en vries in vloeibare stikstof.
      6. Bewaren plantenweefsel bij -80 ° C.
4. Nicotiana tabacum stabiele expressie systeem:
   1. Groei en in vitro plantjes N. handhaven tabacum (var Sr1.) op vaste planten kweekmedium (4,4 g / l Murashige en Skoog - MS - medium waaronder vitaminen, 30 g / l sucrose, pH 5,8, 7 g / l fabriek agar) onder gecontroleerde omstandigheden in de klimaatkamer bij 25 ° C met 16 uur / 8 uur dag / night regime.
   2. Start een pre-cultuur van A. tumefaciens EHA105 de expressievector pK7WG2.G65mut in 5 ml vloeibaar YEB-medium met geschikte antibiotica (rifampicine 50 ug / ml, streptomycine 300 ug / ml spectinomycine 100 ug / ml) en overnacht groeien bij 28 ° C in een orbitale schudder set bij 200 rpm.
   3. Gebruik 1 ml van de voorkweek in een 50 ml Agrobacterium kweek in YEB medium met antibiotica inoculeren (rifampicine 50 ug / ml, streptomycine 300 ug / ml spectinomycine 100 ug / ml) en kweken gedurende 24 uur, totdat de bacteriële cultuur verzadigde (OD ₆₀₀ waarde van 0,5-1,0).
   4. Verzamel bacteriën door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 20 min en resuspendeer pellet in 50 ml vloeibaar planten kweekmedium. Herhaal deze stap twee keer tegen antibiotica volledig te verwijderen.
   5. Neem de eerste gezonde volledig ontwikkelde bladeren van in vitro tabaksplanten en snijd ze in ongeveer 1 cm pleinen.
   6. Transfer bladstukkendiepe platen met bacteriële suspensie en laat in het donker gedurende 20 min.
   7. Verwijder blad stukken uit schorsing en dep droog op steriele filter papier.
   8. Plaats blad stukken met adaxiale zijde (bovenste bladoppervlak) op vaste planten kweekmedium met 1,0 ug / ml 6-benzylaminopurine (BAP) en 0,1 ug / ml naftaleen azijnzuur (NAA) en incubeer platen voor twee dagen in een klimaatkamer bij een gecontroleerde omstandigheden (25 ° C, 16 uur dag / nacht 8 uur).
   9. Transfer bladstukken op vast kweekmedium (inclusief 1,0 ug / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500 mg / ml cefotaxime, 100 ug / ml kanamycine) met abaxiale oppervlak (onderste oppervlak van het blad) in contact met medium.
   10. Incubeer de platen gedurende 2-3 weken in de klimaatruimte bij 25 ° C met 16 uur / 8 uur dag / nacht regime scheutvorming induceren. Subcultuur om de 2 weken door de overdracht van bladexplantaten frisse stevige planten kweekmedium met 1,0 ug / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500gg / ml cefotaxime en 100 ug / ml kanamycine.
   11. Wanneer scheuten overbrengen naar Magenta dozen met vast kweekmedium met 500 ug / ml cefotaxime en 100 ug / ml kanamycine voor wortelvorming induceren. Incubeer plantjes met 16 uur dag / nacht 8 uur fotoperiode bij 25 ° C gedurende 1-2 weken.
   12. Wanneer wortels vormen, dragen de planten in de grond in de kas.
   13. Verzamel een blad stuk voor elke plant en te isoleren genomisch DNA met een commerciële kit.
   14. Detecteren van de aanwezigheid van het transgen door specifieke PCR. Met 30 ng genomisch DNA als matrijs voor PCR-amplificatie met de volgende transgen-specifieke primers: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'en 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', met een hybridisatietemperatuur van 58 ° C en een rek van 20 sec . Voer de PCR-reactie in een totaalvolume van 50 ul.
   15. Analyseer het 220 bp product door elektroforese op 1% agarosegel in Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA).
   16. Selecteer transgene planten die het doelgen.
   17. Verzamel een blad stukje uit elk van de geselecteerde transgene plant en vries in vloeibare stikstof direct.
   18. Bereid totaal proteïne-extracten van plantaardige blad weefsel (stap 3.1.3) en test elke monster door western blot analyse zoals eerder beschreven ² om de beste recombinant eiwit fabriek uiten van tabak te selecteren.
   19. Zak bloemen van de geselecteerde best presterende planten voor de bloei om kruisbestuiving te voorkomen.
   20. Na de bloei, rijping van fruit en zaad drogen, het verzamelen van zakken.
   21. Aparte zaden van het kaf en bewaar ze in een droge ruimte bij een gecontroleerde temperatuur (20-24 ° C).
   22. Zaai de gedroogde zaden tot de tweede generatie transgene planten produceren en vervolgens selecteert u de best presterende plant om zelf-bestoven zijn.
   23. Herhaal dezelfde stappen in 2.4.19-2.4.21 beschreven voor de volgende generaties procedure.

3. recombinant eiwit expressie Analyses

1. Totaal eiwitextractie:
   1. Bacteriële cellen:
      1. Resuspendeer de bacteriële celpellet, verzameld zoals beschreven in stap 2.1.5, de helft van de kweek volume Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS - 2 mM Tris / HCl, 500 mM NaCl), pH 7,4 aangevuld met 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF).
      2. Sonicaat geresuspendeerd cel pellet drie keer voor 40 sec op halve kracht, terwijl het monster op het ijs.
      3. Geef lysaat door centrifugatie bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
      4. Overdracht supernatant naar een schone buis en beide supernatant en pellet afzonderlijk bij -80 ° C.
      5. Oplosbaar De insluitlichaampjes in de pellet verzameld doormidden cellulaire lysaat volume TBS pH 8,0 aangevuld met 6 M ureum door krachtig schudden gedurende de nacht bij kamertemperatuur.
      6. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 25 min bij kamertemperatuur en laat supernatant in een schonebuis.
      7. WINKEL zowel supernatant en pellet bij -80 ° C.
   2. Insectencellen:
      1. Was geïnfecteerde insectencel pellet verzameld zoals beschreven in stap 2.2.12 met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH _{2PO 4)} pH 7,4.
      2. Resuspendeer cellen in 200 ul lysisbuffer (20 mM Tris / HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 3 mM β-mercaptoethanol en 1% Tween-20) en incubeer op ijs gedurende 30 min.
      3. Centrifugeer cellen gesolubiliseerd bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
      4. Verzamel oplosbare fracties en bewaar bij -80 ° C en de pellet weggegooid.
   3. Plant bladweefsel:
      1. Grind N. benthamiana en N. tabacum weefsel tot fijn poeder in vloeibare stikstof met behulp van een mortier en een stamper.
      2. Homogeniseren 100 mg van de grond weefsel in 300 ul van extractie buffer (40 mM Hepes pH 7,9, 5 mM DTT, 1,5% CHAPS), supplemented met 3 ul van proteaseremmer cocktail en ontdooien op ijs.
         OPMERKING: de gekozen verhouding tussen plantenweefsel gewicht (g) naar buffer volume (ml) is 1: 3.
      3. Centrifugeer extract bij 30.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
      4. Verzamel supernatant in een schone buis en bewaar bij -80 ° C.
2. Coomassie kleuring gel:
   1. Bereid een geschikte verdunning van de totale eiwitextracten (bijvoorbeeld 2 ui plantenextract, 5 gl bacteriën en insecten extracten) tot een eindvolume van 10 pl extractiebuffer en voeg 5 ul 3x monsterbuffer (1,5 M Tris / HCl pH 6,8, 3% SDS, 15% glycerol, 4% β-mercaptoethanol) tot een uiteindelijke concentratie van 1x.
   2. Kook monsters gedurende 10 min.
   3. Afzonderlijke eiwitten door 10% SDS-PAGE.
   4. Na elektroforese warmte gel in aanwezigheid van Coomassie-oplossing A (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol, 10% azijnzuur) in een magnetron gedurende ongeveer twee minutens tot aan het kookpunt.
   5. Afkoelen gel tot kamertemperatuur onder zacht schudden.
   6. Discard Coomassiekleuring oplossing A.
   7. Destain gel door verwarmen in aanwezigheid van Coomassie oplossing B (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol), C (0.002% Brilliant Blue R-250, 10% azijnzuur) en D (10% azijnzuur) telkens volgens hetzelfde protocol voor kleuring.
   8. Na de laatste verhittingstrap met oplossing D, laat gel ontkleuren tot achtergrond is duidelijk ^9.
3. Western blot-analyse:
   1. Na elektroforese overdracht gescheiden eiwitten op een nitrocellulosemembraan met behulp van standaard technieken en blok met 4% melk in PBS pH 7,4 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   2. Incubeer de blot overnacht bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur in de blokkerende oplossing bevattende konijnen primair antilichaam opgewekt tegen het doeleiwit bij 1: 10.000 en aangevuld met 0,1% Tween-20.
   3. Na het primaire antilichaam labeling, was het membraan 3 maal gedurende 5 minuten elk met blokkerende oplossing bevattende 0,1% Tween-20.
   4. Incubeer met mierikswortel peroxidase (HRP) -conjugate anti-konijn antilichaam bij 1: 10.000 1,5 uur.
   5. Was membraan 5 keer gedurende 5 minuten elk met PBS-T (PBS aangevuld met 0,1% Tween-20).
   6. Proces western blot met de chemiluminescente peroxidase substraat.
4. Radioimmuno assay (RIA):
   1. Laat reagentia (antiserum, tracer en proteïne A Sepharose) tot kamertemperatuur en pipet 20 pl proteïne extract monsters en standaarden in verschillende concentraties (van 300-2,400 ng / ml commercieel recombinant hGAD65) in 12 x 75 mm polystyreen buizen bereiken.
   2. Voeg 20 ul van antiserum, bereide verdunning 1:30 het serum van plasmaferese van een T1D patiënt.
   3. Voeg 50 ul van tracer (125-I-GAD65) en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Stel een buis met tracer slechts een schatting van de totale activiteit.
   4. Voeg 50 ulproteïne A Sepharose en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
   5. Breng 1 ml koude PBS buffer in elke buis en centrifugeer bij 1500 xg bij 4 ° C gedurende 30 min.
   6. Schenk de buizen om supernatant te verwijderen en te absorberen resterende vloeistof op vloeipapier door zachtjes te tikken buis.
   7. Meet immunologisch radioactiviteit in alle buizen door het tellen gedurende 1 min in een gammateller.
   8. Perceel in log-schaal de bindende tarieven (B / T%) van calibratoren met betrekking tot de totale activiteit, de standaard curve vast te stellen, en te lezen GAD concentratie van monsters uit de ijkcurve ^10.
      LET OP: Beperkt gebieden moeten worden ontworpen voor de opslag, verwerking en berging van radioactief materiaal.

Results

Een experimenteel ontwerp voor de heterologe expressie van een doel recombinant proteïne in verschillende productiesystemen wordt beschreven. De eerste focus lag de set-up van de verschillende platformen door de oprichting van de optimale omstandigheden voor de expressie van het doelwit eiwit in elk systeem.

De expressie van het doeleiwit, hGAD65mut, geïnduceerd in drievoud E. coli kweken. Na 3 uur van expressie bij 37 ° C werden de bacteriële cellen verzameld door centrifugeren en ...

Discussion

In deze studie werden drie verschillende platforms vergeleken voor de expressie van een recombinant humaan eiwit: bacteriële cellen, met baculovirus / insectencellen en planten. De plantaardige platform werd verder onderzocht door de exploitatie van drie veel gebruikte technologieën expressie (dat wil zeggen, van voorbijgaande aard - MagnICON en pK7WG2 basis - en stabiel). Het doeleiwit voor dit experiment gekozen, hGAD65mut, eerder uitgedrukt in verschillende systemen ^13, en de productie en function...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gistextract	Sigma	Y1333
Tryptone	Formedium	TRP03
Agar Bacteriologisch graad	Applichem	A0949
Sf-900 II SFM medium	Gibco	10902-088
Grace’s Insect Medium, onaangedaan	Gibco	11595-030
Cellfectin II Reagens	Invitrogen	10362-100
MS medium inclusief vitaminen	Duchefa Biochemie	M0222
Suiker	Duchefa Biochemie	S0809
Plantagar	Duchefa Biochemie	P1001
Ampicillin natrium	Duchefa Biochemie	A0104	Toxisch
Gentamicine sulfaat	Duchefa Biochemie	G0124	Toxisch
Ganciclovir	Invitrogen	I2562-023
Carbenicillin di-natrium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxisch
Kanamycin sulfaat	Sigma	K4000	Toxisch
Rifamycin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxisch – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin sulfaat	Duchefa Biochemie	S0148	Toxisch
Spectinomycine dihydrochloride	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG (isopropiel-β-D-1-thiogalactopyranosid)	Sigma	I5502	Toxisch
MES-hydraat	Sigma	M8250
MgCl2	Biochemical	436994U
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxisch – 0.1 M stock in DMSO
Spuit (1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-Benzylaminopurine)	Sigma	B3408	Toxisch
NAA (Naftaleen azijnzuur)	Duchefa Biochemie	N0903	Irritante
Cefotaxime	Mylan Generics
Trizma base	Sigma	T1503	Pas pH aan met 1 N HCl om Tris-HCl buffer te maken
HCl	Sigma	H1758	Corrosief
NaCl	Sigma	S3014	1 M stock
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (Fenilmethanesulfonylfluoride)	Sigma	P7626	Corrosief, toxisch
Urea	Sigma	U5378
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxisch
Tween-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Dithiothreitol)	Sigma	D0632	Toxisch – 1 M stock, bewaar bij -20 °C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374	Toxisch
Plant protease inhibitor cocktail	Sigma	P9599	Vries/ontdooi niet te vaak
SDS (Natriumdodecylsulfaat)	Sigma	L3771	Ontvlambaar, toxisch, corrosief – 10% stock
Glycerol	Sigma	G5516
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
Isopropanol	Sigma	24137	Ontvlambaar
Azijnzuur	Sigma	27221	Corrosief
Anti-glutamaatzuur decarboxylase 65/67	Sigma	G5163	Vries/ontdooi niet te vaak
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugaat anti-konijnenantilichaam	Sigma	A6154	Vries/ontdooi niet te vaak
Sf9 Cellen	Life Technologies	11496
BL21 Competent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Protein A Sepharose	Sigma	P2545
Cellcultuur platen	Sigma	CLS3516
Radio Immuno Assay kit	Techno Genetics	12650805	Radioactief materiaal