Methodenartikel

Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde

12.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52462

⸱

6 april 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diagnostic and Interventional Radiology, University Medical Center, Hamburg, 2Institute of Immunology, University Medical Center, Hamburg, 3University Cancer Center Hamburg, University Medical Center, Hamburg, 4Department of Oncology and Hematology, University Medical Center, Hamburg

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om ex vivo validatie uit te voeren van in vivo nabije-infrarood fluorescentie xenograft beeldvormingsexperimenten bij muizen met behulp van met fluorofoor gelabelde nanolichamen en conventionele antilichamen.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om ex vivo validatie uit te voeren van in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft-beeldvormingsexperimenten bij muizen met behulp van met fluorofoor gelabelde nanolichamen en conventionele antilichamen.

Eerst beschrijven we hoe je subcutane tumoren bij muizen genereert, waarbij je antigeen-negatieve cellijnen gebruikt als negatieve controles en antigeen-positieve cellen als positieve controles in dezelfde muizen voor intra-individuele vergelijking. We geven aan hoe je intraveneus near-infrared fluorofoor gelabelde (AlexaFluor680) antigeen-specifieke nanolichamen en conventionele antilichamen toedient. In vivo beeldvorming werd uitgevoerd met een NIRF-beeldvormingssysteem voor kleine dieren. Na de in vivo beeldvormingsexperimenten werden de muizen geëuthanaseerd. We beschrijven vervolgens hoe je de tumoren voorbereidt voor parallelle ex vivo analyses door middel van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie om de in vivo beeldvormingsresultaten te valideren.

Het gebruik van de near-infrared fluorofoor gelabelde nanolichamen maakt non-invasieve beeldvorming op dezelfde dag in vivo mogelijk. Onze protocollen beschrijven de ex vivo kwantificering van de specifieke labelingefficiëntie van tumorcellen door middel van flowcytometrie en analyse van de distributie van de antilichaamconstructies binnen de tumoren door middel van fluorescentiemicroscopie. Het gebruik van near-infrared fluorofoor gelabelde sondes maakt non-invasieve, economische in vivo beeldvorming mogelijk met de unieke mogelijkheid om dezelfde sonde zonder verdere secundaire labeling te gebruiken voor ex vivo validatie-experimenten met behulp van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie.

Inleiding

In dit rapport beschrijven we de implementatie van nabij-infrarood fluorofor gelabelde probes voor de validatie van in vivo xenograft beeldvorming experimenten met behulp van ex vivo flowcytometrie en fluorescentie microscopie van de ontleed xenograft tumoren. We vergelijken een enkel domein nanobody (s + 16a, 17 kDa) 1 en een monoklonaal antilichaam (Nika102, 150 kDa) 2,3 gericht op dezelfde doelgroep antigeen voor specifieke in vivo nabij-infrarood fluorescentie beeldvorming in een lymfoom xenotransplantaatmodel. Het doelantigeen ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 wordt uitgedrukt als een GPI-verankerde celoppervlak ecto-enzym lymfoomcellen 4-9.

Nanobodies afgeleid van kameelachtigen alleen zware keten-antilichamen de kleinste beschikbare antigeenbindende fragmenten 10,11. Met slechts ~ 15 kDa, deze kleine antilichaamfragmenten oplosbaar, zeer stabiel en renaal geklaard uit de circulatie 8,10. Teze eigenschappen maken ze bijzonder geschikt voor specifieke en efficiënte targeting van de tumor antigenen in vivo 12-20. Gemeenschappelijke antigeendoelen beschikbare nanobodies de epidermale groeifactor receptor (EGFR1 of HER-1), humane epidermale groeifactor type 2 (HER-2 of CD340), carcino-antigeen (CEA) en vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1 ) 21. Nanobody conjugaten zijn veelbelovend gereedschap voor immunotherapie van kanker en de behandeling van ontstekingsziekten 22.

Recente studies hebben aangetoond dat nanobodies mogelijk hogere tumor-tot-achtergrond (T / B) -ratios dan conventionele antilichamen in vivo moleculaire beeldvorming toepassingen 8,17,19. Dit is voornamelijk te verklaren door de relatief slechte en trage penetratie van conventionele antilichamen, langzame klaring uit de circulatie, en een lange retentie in niet-gerichte weefsels 23. Bovendien overmaat conventionele antilichamen leidt tot niet-specifieke accumulatie in doelantigen-negatieve tumoren veroorzaakt door de verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) bewerkstelligen 24,25. Dit betekent dat hogere doses van conventionele antilichamen kunnen verhogen niet enkel specifieke signalen maar ook niet-specifieke signalen, waardoor de maximaal haalbare tumor-tot-achtergrond verhouding verminderen. Daarentegen verhogen van de dosis nanobodies verhoogt de signalen van antigeen-positieve tumoren, maar niet die van normaal weefsel of antigeen-negatieve tumoren (ongepubliceerde gegevens).

Voorbij de vergelijking van nanobodies en conventionele antilichamen, schetsen we een intra-individuele beoordeling van antigeen-positieve en -negatieve xenograften in dezelfde muizen voor directe vergelijking van specifieke en niet-specifieke signalen als gevolg van de EPR-effect. Het nabij-infrarood fluorofoor geconjugeerde probes liet ons toe om een enkele sonde te exploiteren in vivo en ex vivo met behulp van nabij-infrarood fluorescentie beeldvorming, flowcytometrie, en fluorescentie microscopie. Toepassing onze protocollen maakt nietradioactief, zeer gevoelig, en goedkoop optimalisatie van in vivo moleculaire beeldvorming experimenten zoals de evaluatie van nieuwe antilichaamconstructen voor specifieke tumor targeting.

Het doel van deze tutorial studie is om het gebruik van NIRF-beeldvorming voor de evaluatie van nieuwe antilichaamconstructen in preklinische moleculaire beeldvorming te markeren.

In dit protocol werden alle experimenten uitgevoerd met een dierenverblijf NIRF-beeldvormingssysteem, een fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) stroom cytometer, en een confocale microscoop.

Protocol

OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met internationale richtlijnen over de ethische gebruik van dieren en werden goedgekeurd door de lokale dierenwelzijn begaan van het Universitair Medisch Centrum, Hamburg.

1. Bereiding van tumorcellen, muis en antilichaamconstructen

  1. Voorbereiding van lymfoom cellen en aliquoting van Basement Matrix (Matrigel).
    1. De dag voor de injectie van tumorcellen zet een gesteriliseerde tip doos (1.000 III tips) en de juiste pipet in de -20 ° C vriezer.
    2. Ontdooi de fles met de kelder matrix op ijs in het 4 ° C koelkast O / N.
    3. Op de dag van de injectie te vullen een ijsemmer en plaats de kelder matrix samen met pipet, tips, en 1 ml spuiten met 30 G naalden op ijs.
    4. Aliquot lymfoom cellen in een volume van 100 pl RPMI medium in 1,5 ml microcentrifuge buizen en meng voorzichtig met 100 ul van de kelder matrix. Opstellen in de pre-gekoeldespuiten en op ijs gezet totdat injectie.
      OPMERKING: Gebruik een goede steriele techniek en te werken op het ijs de hele tijd om verstopping van de kelder matrix te voorkomen.
  2. Muizen Voorbereiding
    1. Gebruik 8-10 weken oude athymische naakt muizen (NMRI- Foxn1 n u).
    2. Ter vermindering autofluorescentie van de darm houden muizen op een alfalfa dieet gedurende 1 week voor in vivo beeldvorming.
    3. Voor injectie van lymfoom cellen verdoven muizen te bewerkstelligen met 2% isofluraan in een inductie kamer. Handhaaf 1-2% isofluraan voor de duur van de procedure met een isofluorane verdeelstuk.
    4. Injecteren lymfoom cellen subcutaan in de schouder flanken. Voor direct intra-individuele vergelijking injecteren antigeen-positieve en antigeen-negatieve cellen aan de rechter- en linkerkant, respectievelijk.
      1. Gebruik een duim en wijsvinger op de huid van de muis knijpen en trek deze uit de buurt van het lichaam van de muis. Injecteer langzaam en gelijkmatig inhet zakje door de vingers, waardoor een cluster cellen onder de huid. De kelder matrix helpt houden geïnjecteerde cellen op zijn plaats.
  3. Voorbereiding van antilichaamconstructen
    1. Label monoklonale antilichamen en enkel domein nanobodies met een commercieel verkrijgbaar eiwit labeling kit voor de fluorescente kleurstof AlexaFluor-680 (AF680) (excitatie golflengte = 679 nm, emissiegolflengte = 702 nm) volgens instructies van de fabrikant. Bereken het aantal kleurstoffen per Nanobody en conventionele antilichamen met molaire extinctie coëfficiënt van 15720 mol -1 cm -1 en 203.000 mol -1 cm -1, respectievelijk. Beoordeel de zuiverheid van antilichaamconstructen door SDS-PAGE grootte fractionering en Coomassie brilliant blue vlek.
    2. Zorg ervoor dat de specificiteit van de gemerkte conjugaten door het uitvoeren van een serie van in vitro experimenten voordat de eigenlijke imaging studies. Test de specificiteit van het label eentibody construeert in vitro door middel van het blokkeren van studies en aspecifieke isotypecontroles 8,20.
      LET OP: In stap 1.2.4 mobiele nummers voor antigeen-negatieve en antigeen-positieve cellen (of verschillende cellen lijnen) kan worden aangepast volgens verschillende groeicijfers. Voor deze experimenten werden 0.5x10 6 DC27.10 ARTC2 negatieve en 1.5x10 6 DC27.10 ARTC2 positieve cellen gebruikt om tumoren van vergelijkbare grootte te verkrijgen. In stap 1.3.1 het proces van etikettering en de etikettering werkzaamheid van antilichaam sondes met fluoroforen kan verschillen door de etikettering kit gebruikt.

2. In vivo beeldvorming

  1. Na 7-9 dagen, als de tumoren bereikt ~ 8 mm Injecteer 50 ug AlexaFluor680 gemerkt antilichaam constructen in een volume van 200 pi zoutoplossing intraveneus in de staartader van de muis (mAb-AF680 50 ug met 2 kleurstoffen / molecuul ≈ ~ 4 ^ 14 fluorchromen ≈ ~ 0,8 ug fluorchromen; Nanobody-AF680: 50 μg met 0,3 kleurstoffen / molecuul ≈ ~ 5,6 ^ 14 fluorchromen ≈ ~ 1,1 ug fluorochromen).
  2. Initialiseer de imaging-systeem en verdoven muizen te bewerkstelligen met 3% isofluraan met behulp van een XGI-8 anesthesie-systeem in de inductie kamer voorafgaand aan de beeldvorming. Handhaaf 1-2% isofluraan voor de duur van de beeldopname met de isofluraan verdeelstuk ondergebracht in de beeldvorming kamer.
    1. Plaats muizen op verwarmde afbeeldeenheid met tumoren gericht naar de camera. Toezien op de juiste verdoving door knijpen de teen of de staart van het dier; enige reactie van het dier aangeeft dat verdoving te licht.
    2. Bewaken van de ademfrequentie; de verdoving is te licht als de ademhaling wordt verhoogd en te diep als de ademfrequentie wordt verlaagd, diep of onregelmatig. Bescherm hoornvliezen dier met een oogzalf tot droog te voorkomen tijdens het onder narcose.
  3. Kies fluorescerende filter sets van 615-665 nm voor excitatie, 695-770 nm voor EMISSIESn, en 580-610 nm excitatie voor achtergrond aftrekken met een 51 2x 512 pixelmatrix grootte. Stel belichtingstijd op auto, pixel binning aan middelgrote en F / Stoppen om 2.
    OPMERKING: Kortere sluitertijden maken snellere framerates; langere belichtingstijden grotere gevoeligheid. Binning regelt de pixelgrootte van de CCD camera. Het verhogen van de binning vergroot de pixelgrootte, gevoeligheid en frame rate, maar vermindert ruimtelijke resolutie. F / Stop stelt de grootte van de opening cameralens. Het diafragma grootte regelt de hoeveelheid licht gedetecteerd en de diepte van field.Note die instellingen kunnen verschillen door beeldvorming apparaat en experimentele set-up. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant voor een optimaal resultaat.
    1. In de imaging software belichting optimaliseren tijd, F / stop en pixel binning op basis van de expressie van de cellijn. Wijzig deze instellingen op elk moment tijdens een experiment zonder impact op het kwantitatieve resultaat. Als alternatief, laat de Imaging Wizard software automatisch te bepalende parameters.
  4. Afbeelding muizen vóór de injectie en 6 uur na injectie van antilichaamconstructen.
    OPMERKING: De etikettering werkzaamheid kan de vereiste dosis die nodig is voor een optimale beeldvorming resultaten beïnvloeden. Daarom is de hoeveelheid benodigde antilichaam-construct voor optimale beeldvorming resultaat moet empirisch worden bepaald. Het variabel etikettering werkzaamheid en de grootte van het construct en de tumormodel en de doelwit-antigeen expressie.

3. Oogst en Voorbereiding van tumoren

  1. Vul een emmer en plaats 4% paraformaldehyde (PFA) fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) / proteaseremmer (AEBSF) en PBS / 0,2% runderserumalbumine (BSA) op ijs.
  2. Nadat de opnamesessie voltooid, verhogen de concentratie van isofluraan tot 4%. Na het dier ophoudt ademhaling, haal hem uit de beeldvorming podium en het uitvoeren van cervicale dislocatie.
  3. Mount muis op een piepschuim blok en spray met 70% ethanol.
  4. Gebruik schaars en een tang om de buitenste huid gesneden en trek het voorzichtig terug naar tumoren bloot. Verwijder tumoren met scalpel waarborgen tumorweefsel intact.
  5. Cut tumoren in de helft met behulp van een scalpel. Plaats een halve in een verzamelbuis met PBS / AEBSF voor FACS analyse en de andere helft in een 50 ml buis met 4% PFA voor immunohistochemie.
  6. Voorbereiding voor immunohistochemie
    1. Houd tumoren in 4% PFA in de koelkast bij 4 ° C gedurende 24 uur. Breng tumoren een buis met PBS / 30% sucrose en in de koelkast bij 4 ° C totdat de tumor zinkt naar de bodem van de buis.
    2. Snijd de tumoren in de juiste stukken voor de cryomolds. Doe de tumoren in cryomolds en vul met oktober verbinding, zodat de tumoren zijn gedekt.
    3. Zet mallen op droog ijs en wacht tot de verbinding is volledig bevroren. Transfer bevroren tumoren tot -80 ° C vriezer en op te slaan voor immunohistochemie.
    4. Cut bevroren tumoren in delen van 8 urn met een microtoom. Gebruik standaard immunohistochemischechemie protocol te kleuren met antilichaam tegen CD31-AF488 aan bloedvaten en diamidino-fenylindool (DAPI) visualiseren om kernen te visualiseren.
      OPMERKING: Tumor secties zijn zeer gevoelig voor licht als ze fluorescerend gemerkte antilichamen bevatten al. Blootstelling minimaliseren zoveel mogelijk aan licht.
  7. Voorbereiding voor FACS-analyse
    1. Plaats petrischaal op ijs en verwijder de plunjer van een injectiespuit 2,0 ml. Doe de tumor in de cel zeef en snijd hem voorzichtig in 3-4 stukken met behulp van een scalpel. Giet de eerste PBS in de petrischaal en gebruik het platte uiteinde van de plunjer aan de tumor mash binnen de cel zeef.
    2. Spoel de cel zeef met de eerste PBS te wassen alle cellen met een pipet 10 ml. Overdracht celsuspensie in een nieuwe buis en rotatie bij 500 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml PBS / 0,2% BSA. Tellen cellen.
    3. Aliquot 1-5 x 10 6 lymfoom cellen in een 5 ml FACS buis. Spin cellen weer (500xg), gooi supernatant en resuspendeer in 100 ul PBS / 0,2% BSA.
    4. Eventueel blok FcR met een anti-CD16 / CD32-mAb (FcgR3 / 2) die bindt aan FcyR op ijs gedurende 10 min. Was de cellen eenmaal met PBS / 0,2% BSA.
    5. Voeg anti-CD45-mAb aan leucocyten van andere cellen onderscheiden. Incubeer gedurende 20 min op ijs in het donker, gevolgd door twee wassen met PBS / 0,2% BSA.
    6. Vlak voor FACS analyse vlek met propidiumiodide gedurende 15 min op ijs om de dode cellen, gevolgd door twee wassen met gewoon PBS onderscheiden. Resuspendeer in 150 pi voor FACS-analyse.
      LET OP: In stap 3.7.4 en stap 3.7.5 andere antilichamen kunnen worden gebruikt afhankelijk van de tumor entiteit.

4. FACS analyse

  1. Gebruik een reeks van gating tools waarmee u de poort van de bevolking van belang in de vorm van grote spreiding, discriminatie doublet, uitsluiting van dode cellen, gating voor CD45 positieve cellen, en gating voor antigeen-positieve cellen.
    1. Op het eerste, de poort uit celpuin in een voorwaartse verstrooiing (FSC-A) versus zijwaartse verstrooiing (SSC-A) met behulp van een twee-parameter plot. Volgende discard cel wambuizen. Tot slot, poort uit non CD45-antigeen-positieve (CD45) en dode / stervende cellen (LD - levend / dood-vlek).
  2. Neem monsters met dezelfde sjabloon voor alle experimenten.
    OPMERKING: Raadpleeg het protocol van de fabrikant voor technisch advies over het gebruik van hardware en analytische software.

5. microscopisch onderzoek

  1. Analyseren in lood tumor cryocoupes met behulp van een confocale microscoop met een olie-immersie lens (40x objectief). Gebruik een He-Neon 633 nm laser excitatie van AF680, een Argon laser voor AF488, en een 405-Diode voor DAPI.
  2. Verwerk de ruwe beeldgegevens met behulp van een software compatibel is met de microscoop. Voeren achtergrond-correctie en ruisfilter indien nodig. Voeren aanvullende aanpassingen afbeelding zoals snijden, bijsnijden evenals de helderheid en het contrast aanpassen.
    1. Eindelijk geafbeelding van een enkele samengestelde overlay nerate uit alle detectie kanalen. Pas de helderheid en het contrast van de afzonderlijke lagen. De samengestelde beelden zal lokalisatie van cellen (DAPI-vlek, blauw), de distributie van gelabeld antilichaam constructen (AF680-vlek, rood) en bloedvaten (AF488-vlek, groen) zien.

6. In vivo beeldvorming Analysis

  1. Open beeldbestanden in imaging software en maak een overlay-afbeelding van beeldgegevens foto te combineren met het fluorescentie data. Optimaliseer beeldweergave door het verwijderen van weefsel autofluorescentie achtergrond signaal van de specifieke fluorescente signaal. Dit kan gedaan worden door het aftrekken van de verworven met een achtergrond filter instellen van de ervaring met de set die specifiek zijn voor de tracer filter afbeelding afbeelding.
  2. Tekenen identieke cirkelvormige meetgebieden van belang (ROI) rond de antigeen-positieve tumor het antigeen-negatieve tumor. Om achtergrond signaalintensiteit bepalen, plaatst een cirkelvormige ROIin een gebied van het dier waar fluorescentiesignaal laag zal zijn (bijvoorbeeld achterpoot).
    1. Gebruik dezelfde ROI voor alle dieren op alle tijdstippen. Voor het plaatsen, gebruik fotografische zwart-wit beelden van de tumor marges te identificeren.
  3. Weergave ROI gegevens in een meettafel. Gebruik gemiddelde stralende efficiëntie gegevens, die een meer kwantitatieve vergelijking van fluorescente signalen voor verdere statistische analyses mogelijk maakt.
    1. Display en vergelijken van gegevens als absolute signaalintensiteiten of bereken de signaal-achtergrond verhouding met behulp van gemeten ROI-gegevens van gerichte weefsel en achtergrond weefsel. Bereken de tumor-tot-achtergrond verhouding van de tumoropname waarde door de achtergrondwaarde bepaald uit de achterste ledematen delen.
    2. Als controles werden ook geanalyseerd antigeen-negatieve en antigeen-positieve tumoren in dezelfde dieren als ingespoten met gemerkte isotype controles om de specificiteit van signalen in vivo te evalueren.

Resultaten

Fluorescent gelabelde probes voor de combinatie van verschillende NIRF-beeldvormende technieken (figuur 1A). Ons doel in vivo NIRF-beeldvorming uitvoeren, flowcytometrie en fluorescentie microscopie achtereenvolgens om fluorescent gemerkte nanobodies en monoklonale antilichamen Vergelijk specifieke in vivo beeldvorming (Figuur 1B).

Muizen werden geïnjecteerd met 50 ug Nanobody en monoklonaal antilichaam de specificiteit van de fluorescent gelabelde constructen in vivo beeldvorming evalueren. De resultaten toonden specifieke labeling van antigeen-positieve tumoren zowel Nanobody en monoklonaal antilichaam tegen 6 uur na injectie (Figuur 2). ROI analyses van de antigeen-positieve tumoren vertoonden een veel hogere T / B-verhouding van ~ 12 voor het Nanobody opzichte ~ 6 voor het monoklonale antilichaam. Bovendien is het Nanobody toonde geen aspecifieke signaal in de antigeen-negatieve tumoren, terwijl demonoklonaal antilichaam toonde aspecifieke storende signalen in de antigeen-negatieve tumoren.

Naast de niet-specifieke signaal van de negatieve tumoren, het monoklonale antilichaam induceerden ook niet-specifieke achtergrond signalen in het gehele dier. Dit is waarschijnlijk te wijten aan overmatige vrij circulerende antilichamen, die te groot renaal wordt uitgescheiden zijn. Daarentegen, dieren geïnjecteerd met nanobodies toonde aspecifieke signalen alleen in de nieren als gevolg van de renale eliminatie van de kleine nanobodies.

Flow cytometrie analyse van tumorcelsuspensies toonde specifieke labeling van antigeen-positieve tumorcellen zowel AF680-conjugaten 6 uur na injectie. De sterkere fluorescentie signaal van de nanobody gelabelde cellen in vergelijking met monoklonaal antilichaam gelabelde cellen weerspiegelt de in vivo NIRF-imaging resultaten. Belangrijk is de flowcytometrische analyses blijkt dat er geen niet-specifieke labeling van antigeen-negatieve cellen met een van de tweeconstructen (figuur 3).

Fluorescentie microscopie van tumor vriescoupes vertoonden een sterke en nagenoeg homogene kenmerken van antigeen-positieve cellen met het Nanobody 6 uur na injectie. Omgekeerd, het monoklonale antilichaam toonde een veel zwakker en nogal homogene kleuring (Figuur 4A). Antigeen-negatieve tumoren tonen geen vlekken 6 uur na injectie van het Nanobody, terwijl antigeen-negatieve tumoren geïnjecteerd met de conventionele antilichamen tonen aspecifieke verspreid kleuring in de interstitiële ruimte (Figuur 4B).

figure-results-1
Figuur 1: fluorescentie beeldvorming en antilichaam constructen. (A) Imaging opstelling voor evaluatie van AF680-conjugaten: In vivo NIRF-imaging gevolgd door flowcytometrie en fluorescentie microscopie. (B ) Schematische voorstelling van AlexaFluor680 gelabeld nanobody s + 16a (rood) en monoklonale antilichaam Nika102 (blauw). Oranje sterren geven de AlexaFluor680 fluorochromen.

figure-results-2
Figuur 2: In vivo-beeldvorming NIRF afbeeldingen van het fluorescentiesignaal van antigeen-positieve (+) en antigeen-negatieve (-) tumoren bij muizen die zijn geïnjecteerd met Nanobody s + 16a (A) en monoklonaal antilichaam Nika102 (B). . In vivo beeldvorming werd uitgevoerd vóór (0 uur) en 6 uur na injectie. Signaalintensiteiten worden als stralende efficiëntie (p / sec / cm2 / sr) / (uW / cm2).

figure-results-3
Figuur 3:Ex vivo FACS analyse van cel gebonden antilichaam constructen van tumorcelsuspensies. (A) Poortsignalen strategie voor FACS analyse van tumorcellen. (B) Histogrammen tonen de hoeveelheid intraveneus geïnjecteerd AF680-geconjugeerde nanobody s + 16a en antilichaam Nika102 specifiek de tumorcellen gebonden in vivo. Antigeen-negatieve tumoren worden weergegeven als ongevulde histogrammen en antigeen-positieve tumoren worden weergegeven als gevuld histogrammen.

figure-results-4
Figuur 4:. Ex vivo fluorescentie microscopie (A) Overzicht fluorescentie microscopie van gehele antigeen-positieve tumor cryocoupes 6 uur na injectie van s + 16a 680 of Nika102 680. Signaalintensiteiten van de in vivo intraveneusworpen AF680-conjugaten zonder secundaire-etikettering agenten worden weergegeven in het rood. Ex vivo tegengekleurd kernen worden weergegeven in blauw en schepen in het groen. Gestippelde lijnen geven buitenmarges van de gehele tumoren. (B) Close-up van fluorescentie microscopie van antigeen-positieve en antigeen-negatieve tumoren.

Discussie

We gebruikten nabij-infrarode fluorofoor gemerkte nanobodies en conventionele monoklonale antilichamen gericht tegen hetzelfde doel op lymfoomcellen een multimodale vergelijking van in vivo en ex vivo analyses. We toonden aan dat Nanobodies zijn goed geschikt als diagnostische hulpmiddelen voor snelle en specifieke in vivo detectie van lymfomen.

In vivo, s + 16a 680 mag een snelle en meer specifieke detectie van ARTC2-positieve xenograften. Afgezien van de verschillende kinetiek voor de beste tumor visualisatie in vivo, het grote nadeel van Nika102 680 was de hoge niet-specifieke signaal van ARTC2-negatieve tumoren en niet-specifieke achtergrond signalen.

Ex vivo flowcytometrische analyses van verspreide cellen van ontleed tumoren toonde geen specifieke binding aan ARTC2-negatieve lymfoom cellen van geïnjecteerd AF680-conjugaten. Ex vivo fluorescentie bleek sterk en bijna homogenlende kleuring van cellen in ART2C-positieve tumor secties in het geval van nanobody s + 16a, bevestigt dat het Nanobody was in staat om zelfs afgelegen gebieden in de tumor te bereiken na 6 uur. In tegenstelling, het monoklonale antilichaam toonde zwakker en inhomogene kleuring van cellen in ARTC2-positieve tumoren na 6 uur. Betere beeldvormende resultaten met de conventionele antilichamen kan worden bereikt na 24 uur of 48 uur (gegevens niet getoond). Om een ​​grondige vergelijking van twee verschillende afmetingen constructen uitvoeren beeldvorming op verschillende tijdstippen (serieel-imaging) moet worden uitgevoerd om de optimale beeldvorming tijdstip kan voor elk construct.

Net als andere eerdere studies, de resultaten gemeld hier benadrukken dat in vivo moleculaire beeldvorming met gemerkte Nanobodies maakt een snelle en specifieke dezelfde dag tumor beeldvorming met hoge tumor-tot-achtergrond ratio 12-15,17-19. Omgekeerd conventionele antilichamen resulteren in lage tumor-tot-achtergrond verhouding en niet-specifieke signalen van antigen-negatieve tumoren vroeg na injectie vanwege hun langzame klaring uit het lichaam. Om optimale beeldvorming resultaten conventionele antilichamen, imaging tijdstippen 24 uur of zelfs 48 uur na injectie gewoonlijk nodig. Deze bevindingen zijn in overeenstemming met eerdere studies die hebben gesuggereerd dat conventionele antilichamen met bewezen therapeutische voordeel beperkt nut in moleculaire beeldvorming 17,19,26. Daarom conventionele antilichamen zouden tamelijk geschikt voor therapeutische doeleinden vanwege hun lange halfwaardetijd terwijl nanobodies tamelijk geschikt voor beeldvormingsdoeleinden vanwege hun snelle klaring uit de circulatie. Deze verschillen zijn te wijten aan het feit dat een overmaat van de kleinere nanobodies (15-17 kDa) snel wordt geklaard via renale eliminatie terwijl overmaat grotere conventionele antilichamen (150 kDa) wordt vastgehouden in de circulatie. Dus het grote voordeel van nanobodies voor moleculaire beeldvorming is de lage achtergrond signaal op vroege beeldvorming tijdstippen regardless van de geïnjecteerde dosis. Hierdoor dezelfde dag beeldvorming en vertaalbare de klinische setting. Omgekeerd kan conventionele antilichamen precies worden getitreerd om niet-specifieke achtergrondsignalen minimaliseren behoud voldoende specifiek signaal van het doelweefsel (ongepubliceerde gegevens).

Een van de beperkingen van de in vivo NIRF beeldvormende techniek is het lage penetratiediepte waarmee doorgaans slechts beeldvorming van subcutaan, maar niet die van orthotope tumormodellen. Echter, zou deze beperking in een experimentele setting worden overwonnen door de recent ontwikkelde tomografische foto-akoestische technieken die het hele lichaam in beeld brengen van levende muizen 27 mogelijk te maken. Een andere beperking van de NIRF beeldvormende techniek is de beoordeling van de dosis weefsel in vergelijking tot radionuclide gemedieerde imaging. Echter, de nanobodies radiolabelen voor positron emissie tomografie (PET) beeldvorming van xenotransplantaatmodellen en exacte kwantitatieve beoordeling vantracer biologische distributie. Inderdaad, onze NIRF imaging resultaten volgens een recente studie die nanobodies en conventionele antilichamen voor PET vergeleken. De auteurs kwamen ook tot de conclusie dat nanobodies mogelijk dezelfde dag krijgt met hoge tumor-tot-achtergrond ratio 15.

Slechts de etikettering van antilichaam constructen met het nabije infrarood fluorescerende kleurstof AF680 liet ons uitgebreide in vitro, in vivo en ex vivo nabij infrarood fluorescentie beeldvorming vergelijking met flowcytometrie, fluorescentie microscopie, en NIRF-imaging. Daarom, en omdat het niet-radioactieve, zeer gevoelig, goedkoop en gebruikt relatief eenvoudig te produceren gerichte probes bepleiten wij het gebruik van de NIRF-beeldvormende techniek voor evaluatie van nieuwe antilichaam constructen in preklinische moleculaire beeldvorming.

Openbaarmakingen

Friedrich Koch-Nolte en Friedrich Haag ontvangen een deel van de antilichaam- en eiwitverkopen via MediGate GmbH, een volledige dochteronderneming van het Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de graduate school 'Ontsteking en regeneratie' van de Collaborative Research Centre 841 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), door de Collaborative Research Centre 877 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , door de Werner Otto Foundation (Peter Bannas), door de Wilhelm Sander Foundation (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), en door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag en Friedrich Koch-Nolte). Wij danken de University Cancer Center Hamburg (UCCH) In vivo Optical Imaging Core Facility en het personeel van UKE voor overleg en hun hoge kwaliteit service. De Core Facility werd mede ondersteund door subsidies van Deutsche Krebshilfe (German Cancer Aid).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AF680 protein labelkitInvitrogenA20172
Anti-CD16/CD32-antilichaamBioXCellBE0008
Anti-CD31-antilichaamSanta Cruzsc-1506Gelabeld met secundair antilichaam met AF488
Anti-CD45-antilichaam V450BD Biosciences560501
AxioVision LE softwareZeisswww.zeiss.com
Basement membrane matrixBD Biosciences354234Alternatief product kan worden gebruikt
Cell strainer 70 µmCorning431751Alternatief product kan worden gebruikt
Confocale microscoopLeica www.leica-microsystems.comLeica SP5 met de volgende lasers: He-Neon voor AF680, Argon Laser voor AF488 en een 405-Diode voor DAPI
DAPIMolcular ProbesD1306
DC27.10 cellen laboratorium specifiekAndere cellen met verschillende oppervlaktedoelen kunnen worden gebruikt
DPBSSigma AldrichD8662
FACS Canto IIBD Bioscienceswww.bdbiosciences.com
Fluorescentie microscoopZeisswww.zeiss.comZeiss Axiovert 200 met Filter Set #32 voor AF680: 000000-1031-354
ImageJ softwareNIHhttp://imagej.nih.gov/ij/
IVIS 200Perkin Elmerwww.perkinelmer.comAlternatief in vivo beeldvormingssysteem kan worden gebruikt
Leica LAS softwareLeicawww.leica-microsystems.comSoftware specifiek voor gebruikte microscoop
Living Image softwarePerkin Elmerwww.perkinelmer.comSoftware specifiek voor gebruikt beeldvormingssysteem
Naalden 30 GBD Biosciences305128Alternatief product kan worden gebruikt
Nika102-antilichaam AF680laboratorium specifiekAndere antilichamen tegen verschillende oppervlaktedoelen kunnen worden gebruikt
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148Mogelijke gevaren: carcinogeen, kan de ogen en de huid irriteren, contact kan uitdroging van de huid en/of allergische dermatitis veroorzaken
s+16a-nanobody AF680laboratorium specifiekAndere antilichamen tegen verschillende oppervlaktedoelen kunnen worden gebruikt
Spuiten 1 mlBraun916 1406 VAlternatief product kan worden gebruikt

Referenties

  1. Koch-Nolte, F., et al. Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).
  2. Koch-Nolte, F., et al. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).
  3. Koch-Nolte, F., et al. Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation. Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).
  4. Bannas, P., et al. Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts. Blood. 105, 3663-3670 (2005).
  5. Bannas, P., et al. Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells. Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).
  6. Bannas, P., et al. Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death. Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).
  7. Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases. Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).
  8. Bannas, P., et al. In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies. Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).
  9. Scheuplein, F., et al. NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells. J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).
  10. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  11. Wesolowski, J., et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).
  12. Vaneycken, I., et al. Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer. FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).
  13. Xavier, C., et al. Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer. J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).
  14. Tchouate Gainkam, L. O., et al. Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy. Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).
  15. Vosjan, M. J., et al. Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).
  16. Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy. Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).
  17. Kijanka, M., et al. Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).
  18. Zaman, M. B., et al. Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer. J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).
  19. Oliveira, S., et al. Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody. Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).
  20. Gainkam, L. O., et al. Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT. J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).
  21. Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging. Theranostics. 4, 386-398 (2014).
  22. Siontorou, C. G. Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy. International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).
  23. Kaur, S., et al. Recent trends in antibody-based oncologic imaging. Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).
  24. Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress. Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).
  25. Jain, R. K., Stylianopoulos, T. Delivering nanomedicine to solid tumors. Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).
  26. Lisy, M. R., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice. Radiology. 247, 779-787 (2008).
  27. Herzog, E., et al. Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography. Radiology. 263, 461-468 (2012).

Herprints en machtigingen

Tags

Fluorescentiemicroscopiexenografttumornanobody-validatieantilichaamlabelingex vivo-analysein vivo-beeldvormingnabij-infrarood
Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.