Methodenartikel

In Situ Ca 2+ Beeldvorming van het enterische zenuwstelsel

21.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52506

⸱

29 januari 2015

 , 
1Department of Physiology, Michigan State University

In dit artikel

Samenvatting

Het enterische zenuwstelsel (EZS) is een netwerk van neuronen en gliacellen in de darmwand dat intestinale reflexen controleert. Dit protocol beschrijft methoden voor het opnemen van de activiteit van enterische neuronen en gliacellen in levende bereidingen van EZS met behulp van Ca2+ beeldvorming.

Samenvatting

Reflexgedrag van de darm wordt geregeld door het enterische zenuwstelsel (ENS). Het ENS is een integratief netwerk van neuronen en gliacellen in twee ganglionate plexussen die in de darmwand zijn gehuisvest. Enterische neuronen en enterische gliacellen zijn de enige celtypen binnen de enterische ganglia. De activiteit van enterische neuronen en gliacellen is verantwoordelijk voor het coördineren van darmfuncties. Dit protocol beschrijft methoden voor het observeren van de activiteit van neuronen en gliacellen binnen het intacte ENS door het beeldvormen van intracellulaire calcium (Ca2+) transienten met behulp van fluorescente indicatorkleurstoffen. Onze technische bespreking richt zich op methoden voor Ca2+ beeldvorming in whole-mount preparaten van het myenterische plexus uit de darm van knaagdieren. Bulkbelasting van ENS whole-mounts met een hoogaffiniteit Ca2+ indicator zoals Fluo-4 maakt metingen van Ca2+ reacties in individuele neuronen of gliacellen mogelijk. Deze reacties kunnen herhaaldelijk en betrouwbaar worden opgewekt, wat kwantitatieve studies mogelijk maakt met behulp van farmacologische hulpmiddelen. Ca2+ reacties in cellen van het ENS worden opgenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een gekoelde charge-coupled device (CCD) camera. Fluoresceïmetingen verkregen met behulp van Ca2+ beeldvorming in whole-mount preparaten bieden een eenvoudige manier om de mechanismen en mogelijke functionele gevolgen van Ca2+ reacties in enterische neuronen en gliacellen te karakteriseren.

Inleiding

Het enterische zenuwstelsel (ENS) is onderverdeeld in twee ganglionated plexi ingebed in de wand van het spijsverteringskanaal 1. Deze intramusculaire neurale circuits, de myenterische plexus (MP) en submucosale plexus (SMP), bestaan ​​uit neuronen en enterische glia (figuur 1) 2. De MP en SMP reguleren functies zoals darmmotiliteit en epitheliale absorptie en secretie, respectievelijk 3 gastro-intestinale (GI). Enterische glia zijn gelegen in de nabijheid van neuronen in de ganglia maar populaties van enterische glia ook bestaan ​​binnen tussendeur fiber traktaten en extra-ganglion delen van de darmwand 3,4. Enterische glia werden oorspronkelijk verondersteld alleen voedingswaarde ondersteuning neuronen verschaffen. Echter, recente studies suggereren sterk dat neuron-glia interacties zijn essentieel voor ENS functioneert 5,6. Zo blijkt uit gegevens dat enterische glia "luisteren" naar neuronale activiteit 7en moduleren neuronale circuits 6,8, enterische neuronen beschermen tegen oxidatieve stress en 9 kunnen genereren nieuwe enterische neuronen in reactie op letsel 10,11. De informatie in deze technische beoordeling protocol voorziet in een eenvoudige en robuuste methode om de complexe interactie tussen neuronen en enterische glia gebruik in situ intracellulaire Ca 2+ imaging onderzoeken.

Ca 2+ is een alomtegenwoordige signaalmolecuul in exciteerbare cellen en speelt een essentiële rol in synaptische signalering gebeurtenissen in het zenuwstelsel 12. Excitatie van neuronen of enterische glia ontlokt een verhoging van de cytoplasmatische Ca2 + concentratie, hetzij door de instroom door Ca 2+ -doorlaatbare kanalen of Ca 2+ vrijlating uit de intracellulaire calcium winkels. Imaging Ca 2 + transiënten in neuronen en glia met fluorescente kleurstoffen is een gevestigde en algemeen toegepaste techniek om de functionele organisatie en dynamiek van studiede ENS 13-17. Ca 2+ imaging is aangetoond dat een belangrijk hulpmiddel bij het ​​bestuderen intacte GI weefselsegmenten de verspreiding van exciteerbaarheid helderen door ICC pacemaker netwerken 18 en darm gladde spier 19,20 zijn. Het stelt onderzoekers in staat om een ​​breed spectrum van fysiologische parameters peilen en geeft informatie over zowel hun ruimtelijke verdeling en temporele dynamiek. Cellen kunnen efficiënt worden gekleurd in een minimaal invasieve wijze door membraan-permeabel fluorescent indicatoren en geoptimaliseerd kleuringsprotocollen 21. Dit biedt de mogelijkheid om een groot aantal neuronen en glia in enterische functioneel geconserveerde preparaten 14-16,22 monitoren, alsook in vivo 23. Whole-mount weefselpreparaten zijn bulk geladen met een hoge affiniteit Ca 2+ indicator kleurstof zoals Fluo-4 dat zijn fluorescentie verhoogt wanneer gebonden aan Ca 2+. Veranderingen in fluorescentie worden opgenomen door een CCD-camera en anagelyseerd digitaal 6. De komst van Ca 2+ in de gelegenheid gesteld om neuron en glia cel interacties, responsiviteit op verschillende stimuli te monitoren, en de betrokkenheid van deze celtypen in de gastro-intestinale processen in real time.

In situ heeft Ca 2+ imaging veel inzicht opgeleverd in de mechanismen voor signalering van enterische neuronen en glia en bezit een aantal duidelijke voordelen ten opzichte celkweekmodellen 6,24. Ten eerste, in situ voorbereidingen onderhouden van de inheemse matrix omgeving van neuronen en glia en laat het grootste deel van hun verbindingen met weefsel intact te richten. Ten tweede, de genetica en morfologie van gekweekte enterische glia is significant veranderd in vergelijking met in vivo 6,24. Ten derde zijn veel heterotypische interactie verloren primaire celkweek en deze grenzen beoordelen cel-cel interacties. Hoewel gekweekte cellen goed zijn geschikt voor onderzoek naar fundamentele eigenschappen, hun usefulness voor de studie van complexe interacties tussen enterische glia en neuronen beperkt. Onderzoeken neuron-glia interactie toepassing van een in situ benadering meer fysiologisch relevant als de synapsen intact 25 blijft. Vergeleken met celkweek benaderingen in situ aanpak biedt verbeterde voorwaarden voor systematisch begrip van de complexe interacties tussen neuronen en enterische glia. Verder is de vlakke ordening van de ganglionated plexus geheel-mount preparaten ideaal voor fluorescentie beeldvorming van intracellulair Ca2 + transiënten en deze verschaffen een eenvoudige benadering voor het beoordelen van neuron-glia activiteit in de ENS.

Protocol

OPMERKING: De volgende procedures waarbij weefsel van proefdieren zijn consistent met de AVMA Richtlijnen voor de euthanasie van dieren 2013 en op voorhand werden goedgekeurd door de Michigan State University IACUC.

1. Tissue Voorbereiding

  1. Verdoven dierproeven in een kamer met 2,5% isofluraan in zuurstof of door het plaatsen van 3-5 ml vloeibaar isofluraan op een absorberend materiaal op de vloer van de kamer, zodat een fysieke barrière verhindert dieren direct contact met isofluraan. Test voor de diepte van de anesthesie door knijpen de voetzool.
    OPMERKING: De diepte van de anesthesie passend geacht wanneer er geen terugtrekking reflex van de achterste ledematen. Eenmaal op de juiste wijze verdoofd, euthanaseren de muis door cervicale dislocatie
  2. Plaats het dier in liggende positie en reinig buikhuid met 70% ethanol. Gebruik een tang om buikhuid knijpen in middellijn en het gebruik van chirurgische schaar om een ​​6 cm medial incisie langs de linea alba interne spijsverteringsorganen bloot.
  3. Gebruik botte tang te lokaliseren en het ileum in het buikvlies bloot. Snijd de ileal / dikke darm mesenterium met een schaar en begint het ontrafelen van de darm.
  4. Zodra de lengte van de darm voldoende is ontrafeld, snijd de darm distaal van de proximale maag en de blindedarm voor ileum bereiding. Voor een grote darm preparaat, snijd de dikke darm distaal van de blindedarm en proximaal van het rectum.
  5. Verwijder snel de intestinale segment en plaats deze in een bekerglas met DMEM / F12 medium aangevuld met 3 uM nicardipine hydrochloride en 1 uM scopolamine hydrochloride (hierna "media") op ijs. De toevoeging van deze remmers vergemakkelijkt microdissectie en latere beeldvorming verlammende de darm gladde spier.
  6. Cut segment van belang (bijvoorbeeld, jejunum, ileum, distale of proximale colon) op basis van vastgestelde anatomische markeringen. Typisch utilize weefsel van de distale ileum of distaal colon. Echter, gebruik van dezelfde basisprocedure te isoleren, belasting en imago myenterische neuronen en glia in alle intestinale regio.
  7. Verwijderen van een klein segment (4-6 cm) van de gewenste darm-segment en plaats in een Sylgard-gecoate petrischaal gevuld met gekoelde media.
  8. Zet de proximale en distale einden van de darm segment insecten pennen en open de intestinale buis door een rechte, overlangs snijden langs de mesenteriale rand.
  9. Pin weefsel vlak onder lichte spanning met slijmvlies zijde naar boven en zorgvuldig ontleden mucosale laag weg met behulp van fijne pincet (# 5 en # 5/45 werk best) en zeer fijn voorjaar schaar.
    OPMERKING: Het verwijderen van het slijmvlies kan heel traumatisch zijn voor de ENS als ze niet goed gedaan. Voor kwaliteit voorbereidingen, zorg abrupte verwijdering van het slijmvlies te beperken door het schillen of schrapen. De beste praktijk is om het slijmvlies te tillen en snijd onderaan met fijne schaar.
  10. Snijd het weefsel in kleinere voorbereidings (ongeveer 0,5 cm 2) en pin in beeldvorming gerechten (4 hoeken met cirkelvormige spierlaag naar boven) geplaatst op ijs met vers medium.
  11. Zorgvuldig ontleden weg kringspier door plagen elkaar met fijne pincet om de myenterische plexus bloot. Vermijd overmatige stretching.
  12. Plaats imaging gerecht terug op ijs en verandering oplossing met verse media.
  13. Bereid 2 ml enzymmengsel per schaal [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), collagenase type II 150 U / ml (5.45 mg / 8 ml) in media].
  14. Verwijder gerechten uit ijs en voeg het enzym mix van stap 1.13.
  15. Incubeer schotels bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met 5% CO2 / 95% lucht.
  16. Was weefselpreparaten met media 3 keer en re-pin hoeken.

2. Laden Fluo-4 Dye

OPMERKING: Vermijd photobleaching door te werken met weinig licht, terwijl het hanteren van fluorescerende kleurstoffen en weefsel geladen met indicator kleurstoffen.

  1. Bereid 4 pM Fluo-4 laden oplossing.
    1. Voeg 1,5 ml media en 1,2 pi van een 250 mM probenecide voorraad om een ​​1,5 pi hoeveelheid van 4 mM Fluo-4 voorraad. 4 mM Fluo-4 voorraad wordt bereid door 11,4 pl Pluronic F-127 (20% in DMSO, aangevuld met 0,25% Cremaphor-EL) 50 ug Fluo-4 AM.
  2. Incubeer bereidingen in Fluo-4 geladen oplossing gedurende 45 minuten in een donkere incubator bij 37 ° C.
  3. Verwijderen uit incubator en wassen preparaten media 3 keer.
  4. Uitwisselingsmedia media die 200 uM probenecide en incubeer 15 min bij 37 ° C voor de beeldvorming.
    OPMERKING: Probenecid is een geneesmiddel dat multidrug resistance transporters remt in neuronen. Toevoeging van dit geneesmiddel remt het vermogen van neuronen kleurstoffen extruderen en verbetert neuronale labeling. Bulk-laden van Ca2 + indicator kleurstoffen in afwezigheid van probenecide produceert gliale laden. De toevoeging van probenecide maakt visualisatie van de neuronale en gliale respons.
  5. Bereid Modified Krebs buffer.
    1. Voeg een gemodificeerde Krebs buffer zodat de uiteindelijke concentratie (in mM) van de componenten als volgt: 121 NaCl, 5,9 KCI, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH 2PO 4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO3 1 pyrodruivenzuur zuur en 8 glucose (pH ingesteld op 7,4 met NaOH). Voeg 3 uM nicardipine en 1 uM scopolamine spiercontracties remmen tijdens Ca 2+ imaging en hele-mount dissecties.

3. Beeldvorming en Analyse

OPMERKING: Gebruik minimaal een basis beeldvorming tuig met een tl-lichtbron, microscoop, een kwaliteit CCD-camera en passende acquisitie software. Varieer de toevoeging van andere componenten, afhankelijk van de lichtbron en de specifieke toepassing. Een filter wiel en de sluitertijd moet worden gebruikt met een traditionele xenonboog lichtbron. Echter, LED-lichtbronnen en verlichting systemen niet die componenten nodig.

  1. Plaats de recOrding kamer onder de microscoop en met behulp van een zwaartekrachtstroming perfusie systeem met meerdere verwarmde spuit reservoirs te stellen een continue perfusie snelheid van 2-3 ml / min van 37 ° C Krebs buffer. Zorg ervoor dat u luchtbel vorming in zowel de input en zuigleiding aangesloten op een vacuüm val te voorkomen.
  2. Breng de gewenste plexus in beeld bij helder veld verlichting. Overbelichting weefsel, wat kan leiden tot foto bleken.
  3. Onderzoek de Fluo-4 laden binnen ganglia en selecteer gezonde ganglia voor beeldvorming. Ongezonde / beschadigd ganglia zal autofluorescentie of punctata morfologie vertonen en mag niet worden gebruikt voor de beeldvorming.
  4. Zodra ganglion is geselecteerd, omleiden lichtpad naar de camera en livebeeld met afbeelding acquisitie software te verkrijgen. Zorg ervoor dat ganglion is scherpgesteld en stel beeldaanwinst tarief en belichtingstijden.
    OPMERKING: Beeldacquisitie tarieven en tijden zullen variëren afhankelijk van de gebeurtenissen onderzoekers wenst op te nemen. Voor de meeste experimenten afbeeldingenTraditioneel worden verworven bij 0,5-1 Hz voor gliacellen en tot 2-10 Hz voor neuronen omdat gliale Ca 2+ reacties zijn niet zo snel als Ca 2+ transiënten in neuronen.
  5. Begin experiment en stellen basislijn activiteit voor 30 sec.
  6. Breng voorverwarmde geneesmiddelen plaats als agonisten en antagonisten met de zwaartekracht perfusie systeem met een debiet van 2-3 ml / min. Volg de toepassing van agonisten / antagonisten van terugkeer naar een normale perfusie buffer en laat een was / herstelperiode van ten minste 10 minuten.
    OPMERKING: De drug applicatie tijden zullen variëren afhankelijk van de individuele verbinding en experimenteel design. In het algemeen 20-30 sec toepassing van agonist volstaat om G-proteïne gekoppelde receptoren in neuronen en gliale cellen te activeren. Echter, ligand-gated ionkanalen (zoals nicotine acetylcholine receptoren) vereisen verwerkingstijden van niet meer dan 5-10 sec. Verdere duur van de blootstelling zal veroorzaken ligand-gated ionkanalen snel desensitize. Antagonisten worden toegepast gedurende ongeveer 3-15 minuten om volledige blokkade van receptoren trajecten waarborgen. Dit is echter een grove generalisatie en onderzoekers moeten steeds geoptimaliseerd experimentele drug in hun specifieke paradigma.
  7. Stop de opname en weergave time-lapse film van het experiment. Zorgvuldig te selecteren regio van belang (ROI's) met behulp van de juiste software voor beeldanalyse.
  8. Gebruik software om te normaliseren en te vergelijken ROI fluorescentie-intensiteit tegen zijn oorspronkelijke uitgangswaarde tl-waarde. Veranderingen in genormaliseerde fluorescentie recht evenredig aan veranderingen in [Ca2 +].
    1. Gebruik een modificatie van een eerder beschreven werkwijze 26 met AF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) achtergrond, waarbij F1 de fluorescentie bij een bepaald punt en F0 is de basislijn fluorescentie, om de nauwkeurigheid evaluatie te verbeteren. Deze wijziging aidsin het verminderen van geluidsoverlast van fluorescentie veranderingen in weefsel voorbereidingen die beweging vertonen van de spierlaag grondslag liggen aan de myenterische plexus.

Resultaten

Correct gebruik van deze techniek kunnen onderzoekers nauwkeurig te meten intracellulaire Ca 2+ [Ca 2+] i transiënten in enterische neuronen en glia geheel-mount weefselpreparaten. Een representatief voorbeeld van een agonist opgewekte Ca2 + responsen in glia binnen myenterische ganglion van de muis colon weergegeven in Video 1. De volgende resultaten zijn bedoeld om enkele representatieve resultaten die we verkregen met deze methode te illustreren. Eerst Figuur 2 illustreert de resultaten van een experiment meten enterische glia [Ca 2+] i verandert in reactie op stimulatie door ATP in cavia dikke longitudinale spier myenterische plexus (LMMP) preparaten. Specifiek, deze figuur toont de werkwijze voor goede analyse van de experimentele protocol hoger, inclusief de omtrek van de geanalyseerde myenterische ganglion en sterretjes duiden de locatie van enterische neuronen opgenomen. Deze resultaten ook ide optimale dosis van honderd micromol ATP llustrate op de mobilisatie van [Ca 2+] i in cavia myenterische glia. Deze reactie kan worden gebruikt om enterische gliale stimulatie kalibreren en normaliseren reacties op stimuli testen. Vervolgens Figuur 3 verduidelijkt hoe goed selecteren regio van belang (ROI) omliggende gliacellen, getoond met omliggende gele cirkels. Deze resultaten tonen ook de gewenste fluorescentieveranderingen onder basale omstandigheden en in reactie op farmacologische stimuli. Figuur 4 tenslotte toont de ruimtelijke overwegingen bij het ​​kiezen enterische glia en neuronen voor [Ca 2,] responsen geheel-mount preparaten.

figure-results-1
Figuur 1. Organisatie van de ENS. De ENS bevat twee belangrijke ganglionated plexus. De myenterische plexus ligt tussen de longitudinal en circulaire spierlagen. De submucosale plexus ligt tussen de mucosa en de circulaire spierlaag. De ENS uitsluitend uit neuronen en enterische glia. Zenuwvezel traktaten sluit de ganglia. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Enterische glia in de cavia colon myenterische plexus reageren op ATP in situ. (A) Fluo-4 fluorescentie in een myenterische ganglion (geschetst door stippellijn) onder basale omstandigheden. Pijlen dikke interganglionic zenuwbanen. (B) na stimulatie met 100 umol / L ATP, gliacellen, maar niet neuronen, snel toenemen Fluo-4 fluorescentie wijst op een stijging van [Ca 2+] i. Merk op dat het reageren cellen zijn klein en rond de veel grotere neuronen (donkere ruimtes gemarkeerd met een asterisk). (C) Enterisch glia reageren op ATP in een dosis-afhankelijke manier met 1 mmol / L uitlokken maximale respons 24. Klik hier om een foto grotere versie van deze figuur.

figure-results-3
Figuur 3. Muizen S-100-GFP + cellen in de colon myenterische plexus reageren ATP in situ. (A) S-100-GFP + gliacellen (groen) in een muis colon myenterische ganglion (aangegeven door onderbroken lijn). Zes gebieden van belang (ROI) omringende gliale cellen in de ganglia worden als gele cirkels. Pijlen geven dikke vezel traktaten die leidt naar de ganglion. Sterretjes deNote plaats van 2 enterische neuronen. (B) Hetzelfde ganglion weergegeven Rhod-2 fluorescentie onder basale omstandigheden. (C) Na stimulering met 100 umol / L ATP, gliacellen reageren met verhoogde [Ca 2,] zoals getoond door verhoogde Rhod- 2 fluorescentie. (D) Sporen die overeenkomen met elke getoond in A-C ROI. (E) Averaged respons (gemiddelde ± SEM) van de 6 ROI getoond in D 24. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. In situ beeldvorming van enterische zenuw naar glia communicatie. (A) Vertegenwoordiger beelden (pseudocolored) uit een Ca 2+ imaging experiment waarbij een hele-mountvoorbereiding van de myenterische plexus werd uitgedaagd met het neuronale P2X7 receptor agonist BzATP (100 uM, 30 sec). Merk op dat de neuronale agonist veroorzaakt een toename Fluo4 fluorescentie in het neuron (A) voor de omringende enterische gliacellen (A "). (B) Analyse van de verandering in fluorescentie in de tijd glia (blauw) en neuronen (rode ) naar aanleiding van de toepassing van de neuronale agonist, BzATP. (C) neuronale en gliale reacties op BzATP in normale buffer (doorgetrokken lijnen) en in een buffer met lage Ca 2+ en Mg 2+ (stippellijnen) tot neuronale P2X7 receptoren 13 versterken. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Video 1.-agonist opgewekte Ca 2+ reactie in enterische glia insitu. Deze video toont een myenterische ganglion van de muis distale colon geladen met de Ca 2+ indicator kleurstof, Fluo-4. De gliale cel agonist, ADP, wordt toegevoegd aan het bad wordt aangegeven. ADP lokt een toename van de intracellulaire Ca 2+ in enterische glia zoals waargenomen door de voorbijgaande verhoging van Fluo-4 fluorescentie. Klik hier om deze video te bekijken.

Discussie

De methodologieën beschreven in dit manuscript bieden een consistente benadering om neuronen en enterische glia in het ENS effectief te bestuderen. Hoewel het beeldvormen van neuronen en enterische glia in cultuur een schat aan inzicht heeft opgeleverd in de functie van individuele cellen, is het bestuderen van deze cellen in hun natuurlijke, multicellulaire omgeving cruciaal voor ons begrip van hun fysiologie en pathofysiologie. Fluorescentiemicroscopie is een cruciale techniek voor het beoordelen van multidirectionele interacties van cellen in het ENS. Het laden van cellen van het ENS met selectieve fluorescente markers en beeldverwerving met hoge resolutie microscopie maakt kwantitatieve observaties van cellulaire activiteit in het ENS mogelijk. Het beeldvormen van levende weefselmonsters van het ENS wordt relatief snel uitgevoerd en genereert grote hoeveelheden diepgaande functionele en ruimtelijke gegevens. Muis myenterische en submucose plexus preparaten die in deze experimenten worden gebruikt, staan moleculaire en genetische manipulatie benaderingen toe. Ca2+ beeldvorming in whole-mount preparaten biedt een nuttig hulpmiddel voor de beoordeling van neuron-glia interacties.

In geavanceerde experimentele paradigma's kunnen verschillende sondes worden gecombineerd om informatie te verkrijgen over verschillende gebeurtenissen binnen de cellen. Fluorescentiemicroscopie kan beelden met verbeterde contrast van specifieke moleculen opnemen, als een geschikte fluorescente marker wordt gebruikt. Fluo-4 werd gekozen omdat het een groot dynamisch bereik heeft. Voldoende incubatietijd is essentieel bij het gebruik van de AM kleurstoffen in ENS. Kleurstofconcentratie en laadmethode kunnen moeten worden aangepast om de beste resultaten te bereiken. Ideale preparaten moeten worden geladen met voldoende kleurstof om veranderingen in fluorescentie te visualiseren, maar niet zo veel dat de kleurstof de doelwitten cheleert en interfereert met intracellulaire signalering. Blootstelling aan fluorescerend licht moet worden beperkt om fototoxiciteit in cellen en fotobleken van kleurstoffen te voorkomen.

Onderzoekers moeten voorzichtig zijn met verschillende stappen van dit experiment, vooral de oplossing en weefselvoorbereiding. Er moet bijzondere zorg worden besteed tijdens het verwerken en dissekeren van ENS weefsel om cellulaire functies te behouden. Het maagdarmkanaal bevat verschillende lagen en weefselvariëteiten, die uitdagingen opleveren voor dissectie en beeldkwaliteit in deze whole-mount preparaten 27. Verder zijn de interconnecterende vezelbanen van de MP breder en ganglia zijn groter dan die van de SMP 2. De neuronale dichtheid van de myenterische plexus is hoger vergeleken met die van de submucose plexus 28. Langzame en onnauwkeurige dissecties zullen schadelijke effecten hebben op de kwaliteit van de plexus preparaten en dus de algehele succes van de experimenten. Daarom zijn schone/ongeschadigde gereedschappen, oefening en handvaardigheid cruciaal voor deze procedure.

In whole-mount weefselpreparaten moet zorgvuldige overweging worden gegeven bij het tekenen van de regio's van belang (ROI) om de kinetiek en de mate van waargenomen verandering in fluorescentie-intensiteit van het gewenste celtype correct te beoordelen. Aangezien de ganglia zich op een contractiele spierlaag bevinden, zijn bewegingsartefacten veroorzaakt door darmmotiliteit een belangrijke zorg tijdens in situ beeldvorming. Dus, het onderdrukken van deze bewegingsstoornissen door herpinnig van weefselpreparaten na incubatie met enzymen en de toevoeging van farmacologische inhibitie (nifedipine/scopolamine) aan buffers, maakt heldere en betrouwbare beeldverwerving mogelijk. Naast farmacologische en mechanische benaderingen om weefselbeweging te voorkomen, illustreren recente studies de toepassing van geavanceerde softwaremethodologieën en celtyperesponskarakteristieken om te corrigeren voor resterende weefselbeweging in de opnames en de nauwkeurigheid van analyse te verbeteren 29. Afgezien van deze technische obstakels, biedt deze methode fysiologisch relevante omstandigheden om morfologische en kwantitatieve kenmerken van neuronen en enterische glia in het ENS te beoordelen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (aan B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) subsidie K12 HD065879 (B. Gulbransen) en opstartfondsen van de Michigan State University (B. Gulbransen).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BubbleStop Syringe Heater AutoMate Scientific10-4-35-G
CaCl2SigmaC3306
Collagenase, Type II, powderGibco17101-015
DispaseSigma-Aldrich42613-33-2
DissectiegereedschapRoboz 
DMSOSigma-AldrichD5879
Microscoop met vaste standOlympus BX51WI
Fluo-4 AM kleurstofInvitrogenF-14201
GlucoseSigmaG8270
InsectenpinsFine Science ToolsMinutien Pins
iQ Live Cell Imaging SoftwareAndorAndor iQ3
KClSigmaP3911
MgCl2SigmaM9272
NaClSigmaS9888
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaS6014
Neo sCMOS cameraAndorNeo 5.5 sCMOS
NicardipineSigmaN7510
PerfusiekamerAangepast
Peristaltische pompHarvard ApparatusModel 720
Pluronic F-127 InvitrogenP3000MP
ProbenecidMolecular ProbesP36400
ScopolamineSigmaS1013 
Sutter Lambda DG-4SutterDG-4
Sylgard Dow Corning184
TemperatuurregelaarWarner InstrumentsTC-344C

Referenties

  1. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  2. Furness, J. B. The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections. Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  3. Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).
  4. Nasser, Y., et al. Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).
  5. Glial cells in the gut. Neurogastroenterology & Motility. 17 (6), 777-790 (2005).
  6. Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. J. Physiol. 590, 335-350 (2012).
  7. Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon. J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).
  8. McClain, J. L., et al. Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
  9. Chandrasekharan, B., et al. Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress. Neurogastroenterology & Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55, 630-637 (2006).
  12. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).
  13. Gulbransen, B. D., et al. Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis. Nat Med. 18, 600-604 (2012).
  14. Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon. J Physiol. 588, 399-421 (2010).
  15. Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).
  16. Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation. J Physiol. 526, 375-385 (2000).
  17. Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system. Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).
  18. Hennig, G. W., et al. Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum. Neurogastro Motil. 14, 575(2001).
  19. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes. Nature. 399, 62-66 (1999).
  20. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine. Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).
  21. Jessen, K. R., et al. Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia. Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).
  22. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).
  23. Gomes, P., et al. ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice. Neurogastroenterology & Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).
  24. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system. Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).
  25. Ren, J., Bertrand, P. P. Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons. Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).
  26. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).
  27. Dongcheng, Z., et al. Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy. Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).
  28. Gershon, M. D. Behind an enteric neuron there may lie a glial cell. J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).
  29. Boesmans, W., et al. Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).

Herprints en machtigingen

Tags

Calcium-imagingwhole-mount preparatiefluorescente indicator kleurstoffluorescentiemicroscopiemyenterische plexusFluo-4 ladenfarmacologische stimulatiebeeldverwervinggliale celactiviteit
In Situ Ca 2+ Beeldvorming van het enterische zenuwstelsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.