Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in gekweekte zoogdiercellen

Samenvatting

Hier presenteren we technieken voor het beeldvormen van lokale IP₃-gemedieerde Ca²⁺-gebeurtenissen met behulp van fluorescentiemicroscopie in intacte zoogdiercellen die zijn geladen met Ca²⁺-indicatoren, samen met een algoritme dat de identificatie en analyse van deze gebeurtenissen automatiseert.

Samenvatting

Cytosolische Ca ²⁺ -ionen reguleren talrijke aspecten van de cellulaire activiteit in bijna alle celtypen, beheersen van processen zo breed als gen-transcriptie, elektrische prikkelbaarheid en celproliferatie. De diversiteit en specificiteit van Ca ²⁺ signalering is afgeleid van mechanismen die Ca2 ⁺ signalen worden gegenereerd om te handelen over verschillende tijd en ruimtelijke schalen, gaande van cel-brede trillingen en golven die zich over de perioden van minuten tot lokale voorbijgaande Ca ²⁺ microdomeinen (Ca ²⁺ pufjes) blijvende milliseconden. Recente ontwikkelingen in de elektron vermenigvuldigd CCD (EMCCD) camera's nu mogelijk voor de beeldvorming van de lokale Ca ²⁺ signalen met een 128 x 128 pixel ruimtelijke resolutie met een snelheid van> 500 frames sec ^-1 (fps). Deze aanpak is zeer parallel en maakt de gelijktijdige bewaking van honderden kanalen of bladerdeeg sites in een enkel experiment. Echter, de enorme hoeveelheden gegevens die worden gegenereerd (ca. 1 Gb per min) maken visuele identificatie en analyse van de lokale Ca ²⁺ gebeurtenissen onuitvoerbaar. Hier beschrijven we en demonstreren van de procedures voor de verwerving, detectie en analyse van de lokale _{IP-3-gemedieerde} Ca2 ⁺ signalen in intacte zoogdiercellen geladen met Ca ²⁺ indicatoren met behulp van zowel wide-field epi-fluorescentie (WF) en de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Verder beschrijven we een algoritme ontwikkeld binnen de open-source software-omgeving Python dat de identificatie en analyse van deze lokale Ca ²⁺ signalen automatiseert. Het algoritme lokaliseert websites van Ca ²⁺ release met sub-pixel resolutie; kan de gebruiker van de gegevens; en uitgangen tijd sequenties van fluorescentieverhouding signalen samen met amplitude en kinetische gegevens in een Excel-compatibele tafel.

Inleiding

Calciumionen (Ca ²⁺⁾ alomtegenwoordig reguleren een divers aanbod van biologische processen, met inbegrip van genexpressie, secretie en langdurige veranderingen in de synaptische plasticiteit ^1. Een manier waardoor Ca ²⁺ kan handelen in zo'n diverse manier is door middel van de verschillende ruimtelijke en temporele patronen van Ca ²⁺ signaleert een cel kan genereren. Bijvoorbeeld wereldwijde verhogingen in cytosolisch [Ca ^2+] trekker contractie van glad spierweefsel ² terwijl kleinere, plaatselijke voorbijgaande verhogingen (lokale Ca ²⁺ microdomeinen) stimuleren genexpressie essentieel voor leren en geheugen ^3.

Vrije cytosolische [Ca ^2+] wordt op ~ 100 nM in rust, maar snel oplopen tot verscheidene micro-molaire na de instroom van Ca2 ⁺ in het cytosol door Ca2 ⁺ -doorlaatbare ionenkanalen in het plasmamembraan en de bevrijding van Ca ²⁺ uit intracellulaire stores. Ons laboratorium richt zich op de inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptor (IP _3R) dat een Ca2 ⁺ afgifte kanaal in het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan vormt. Na binding van beide _IP-3 en Ca ²⁺ naar het cytosol activeren van websites van de receptor, de IP ₃ R-kanaal opent bevrijden Ca ²⁺ afgezonderd binnen het ER lumen. De afgifte van Ca2 ⁺ kan ruimtelijk beperkt blijven tot een klein cluster van _IP3 Rs een lokale microdomein cytosolische Ca ²⁺ genereren (Ca2 ⁺ bladerdeeg ⁴⁾ of, afhankelijk van de nabijheid van naburige clusters van _IP3 Rs, kan propageren gedurende een cel door het aantrekken van meerdere bladerdeeg sites door middel van een proces van Ca ²⁺ geïnduceerde Ca ²⁺ -release (CKP) ^5,6.

De invoering van fluorescerende klein molecuul Ca ²⁺ indicatorkleurstoffen ontwikkeld door Roger Tsien ^7, in combinatie met geavanceerde microscopie Imaging technieken sterk vergemakkelijkt ons begrip van Ca2 ⁺ signalering. Recente ontwikkelingen in de camera's gebruikt voor microscopie nu toe voor de beeldvorming van voorbijgaande lokale Ca ²⁺ evenementen zoals soesjes met ongekende ruimtelijke en temporele resolutie. Momenteel beschikbare EMCCD camera mogelijk beeldvorming met 128 x 128 pixels bij> 500 frames sec ^-1 (fps) en de nieuwe generatie Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) camera's hogere pixelresolutie, en zelfs hogere snelheid ten koste van iets hoger geluidsniveaus. In combinatie met de totale interne reflectie (TIRF) microscopie is het nu mogelijk om het beeld enkele Ca ²⁺ kanaal gebeurtenissen ^8,9. Deze benadering maakt de beeldvorming van honderden kanalen / gebeurtenissen gelijktijdig, terwijl het genereren van grote datasets (ca. 1 GB per minuut) dat automatische verwerking visuele identificatie en analyse onuitvoerbaar maken en plaats een last op de ontwikkeling van geautomatiseerde algoritmen.

Hier presenteren we procedures en protocollen voor het afbeelden lokale Ca2 ⁺ signalen in intacte zoogdiercellen behulp van fluorescente Ca2 ⁺ indicatoren. We verder aan te tonen een algoritme ontwikkeld in de open-source omgeving Python dat identificatie en analyse van de lokale Ca ²⁺ gebeurtenissen afgebeeld door zowel TIRF en conventionele brede veld epi-fluorescentie (WF) microscopie automatiseert. Hoewel we beschrijven deze benaderingen in de context van _IP3 -generated Ca2 ⁺ signalen, die zich gemakkelijk lenen om lokale wijzigingen in cytosolisch [Ca ^2+] afkomstig van verschillende Ca2 ⁺ -doorlaatbare ionenkanalen in ofwel de oppervlaktestudie membraan of intracellulaire organellen ^8-10.

Protocol

We presenteren gedetailleerde procedures voor de beeldvorming van de lokale Ca ²⁺ gebeurtenissen in de menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen. Deze procedures kunnen worden aangepast aan het intracellulaire Ca2 ⁺ signalen in veel celtypen ^8-10.

1. Bereiding van Cellen

1. De cultuur van de cellen af ​​te beelden volgens de instructies vermeld op de website van hun leverancier.
2. Een paar dagen voor beeldvorming, oogsten cellen gekweekt in weefselkweek kolf met 1 ml 0,25% trypsine / EDTA (2-3 min). Na onthechting, voeg een gelijk volume kweekmedium aan het trypsine te inactiveren.
3. Voer een celgetal met behulp van een hemocytometer en zaad cellen in glazen bodem beeldvorming gerechten bij een dichtheid van 3-7 x 10 ⁴ cellen per gerecht. Selecteer de cellen voor beeldvorming experimenten bij het bereiken van 60% samenvloeiing (2-3 dagen).

2. Voorbereiding van oplossingen en reagentia

1. Bereid een Ca ²⁺ bevattende HEPES gebufferdzoutoplossing (Ca2 ⁺ -HBSS) uit (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 HEPES, en 10 glucose; pH = 7,4 bij kamertemperatuur (RT) met NaOH. Bereid Ca2 ⁺ -HBSS zonder toevoeging van glucose en bewaar bij 4 ° C; voeg glucose om de oplossing onmiddellijk voor gebruik.
2. Oplosbaar membraan doordringende vormen van de fluorescente Ca2 ⁺ indicator Cal-520 (1 mM), _ci-IP3 (200 uM) en EGTA (100 mM) in dimethylsulfoxide (DMSO) met 20% Pluronic F-127. Aliquot deze reagentia in Eppendorf buizen en opslag, afgeschermd van licht en vocht, bij -20 ° C.

3. Laden Cellen met een membraan-permeant Cal-520, ci-IP ₃ en EGTA

1. Bereid de "laadbuffer" door verdunning van de voorraadoplossing van membraan-permeant Cal-520 en _ci-IP3 tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM en 1 uM, respectievelijk Ca ²⁺ -HBSS.
2. Aspireren culture media en spoel cellen door vervanging van media door Ca2 ⁺ -HBSS driemaal.
3. Verwijder Ca2 ⁺ -HBSS en incubeer cellen in laadbuffer gedurende 60 min bij kamertemperatuur in het donker.
4. Verwijder laadbuffer en spoel cellen door vervanging van media door Ca2 ⁺ -HBSS driemaal.
   1. Indien gewenst, bij deze stap, weegcellen met EGTA / AM door verdunning van de voorraadoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM in Ca2 ⁺ -HBSS en incubeer cellen gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na deze incubatie, spoel cellen drie keer met Ca ²⁺ -HBSS voordat u verder met stap 3.5.
5. Incubeer de cellen met Ca2 ⁺ -HBSS gedurende 30 min om voor de verestering van geladen reagentia.
6. Onmiddellijk voorafgaand aan beeldvorming vervangen Ca2 ⁺ -HBSS met "verse" Ca ²⁺ -HBSS om elke kleurstof die tijdens de laatste incubatie in het bad kan zijn gelekt verwijderen.

4. Ca ²⁺ Image Acquisition

1. Plaats een kleine druppel immersie olie op de 100X APO TIRF doelstelling (NA 1,49).
2. Monteer de beeldvorming schotel op het podium van de omgekeerde microscoop en breng de cellen in beeld met behulp van doorvallend licht. Het is belangrijk de beeldvormende schotel te bewegen tijdens de opname voorkomen beveiligen.
3. Verlichten cellen met een 488 nm laser om Cal-520 prikkelen en te verzamelen uitgezonden fluorescentie (λ> 510 nm) met behulp van een high-speed EMCCD camera.
   Opmerking: Het softwarepakket dat de microscoop werking kan de gebruiker vertaal een focusseerlens waarbij de laserbundel worden ingevoerd hetzij aan de uiterste rand van de doelstelling back opening (voor TIRF excitatie) of meer centraal (voor "WF" excitatie).
4. Met behulp van de EMCCD software, verminderen het beeldveld van de volledige 512 x 512 pixels, om gegevens te verzamelen bij de noodzakelijke temporele resolutie aan lokale Ca ²⁺ gebeurtenissen vast te leggen.
   OPMERKING: Bijvoorbeeld, centrum quadacquisitie van 256 x 256 pixels versnelt de overname tarief tot 66 fps. Het is ook mogelijk om verdere toename van de frame rate van de EMCCD camera tot 500 fps met behulp van een geïsoleerde Crop Mode functie.
5. Configureer de software enkele seconden basislijn activiteit automatisch opnemen geeft een met UV flash om de cellen en blijven opnemen voor een 10-30 sec.
   OPMERKING: Een UV-flitser wordt geleverd met behulp van een Xenon boog lichtbron geïntroduceerd door middel van een UV-reflecterende dichroïde spiegel in de achterkant haven van de microscoop. De duur en intensiteit van de UV flits empirisch op een gewenste frequentie van lokale Ca2 ⁺ gebeurtenissen roepen.
6. Bestanden opslaan als image stacks voor off-line analyse.

5. Geautomatiseerde Ca ²⁺ Image Analysis

OPMERKING: Het is mogelijk om te bekijken, te verwerken en te analyseren vastgelegde gegevens met behulp van veel commerciële softwarepakketten. We hebben echter een algoritme snel automatiseren identificatie een ontwikkeldd analyse van lokale Ca2 ⁺ signalen. Een gedetailleerde beschrijving van de ruimtelijke en temporele filters in dit algoritme kan genereren van de AF / F ₀ en identificatie / analyseroutines gevonden in ^11. Dit algoritme is ontwikkeld om te draaien op het open-source software platform Python, en kan verkregen worden, samen met het monster experimentele gegevens en gedetailleerde instructies voor de gebruiker, per e-mailen van de desbetreffende auteur (ismith@uci.edu).

1. Bestanden converteren naar de op maat geschreven algoritme om de multi-plane .tiff bestandsformaat te worden geïmporteerd.
2. Zoek de map met de analyse-algoritme en dubbelklik op het run.exe.
3. Selecteer de .tiff bestand te analyseren.
4. Kies analyse parameters in het dialoogvenster Openen. Zie figuur 2A voor standaard parameters voor de steekproef van gegevens.
5. Bepaal het zwartniveau worden gecompenseerd door de afbeeldingsstapel door ofwel de cursor naar een deel van het gezichtsveld dat n doetot bevatten een cel (zie figuur 2B) of door het handmatig invoeren van een zwart-niveau met behulp van de 'Set Black Level' prompt.
6. Observeren vier vensters op het scherm na analyse door de software (figuur 2C-F). C is een monochroom beeld van rustende fluorescentie van cellen geanalyseerd. Witte vierkantjes bovenop dit beeld zijn eventlocaties, bepaald als het zwaartepunt posities van tweedimensionale Gaussische functies gemonteerd gebeurtenissen.
7. Klik op elk evenement locatie of druk op de cursortoetsen om tussen gebeurtenissen. Op deze momenten de-achtergrond afgetrokken, Gauss gladgestreken fluorescentieverhouding veranderingen (AF / F ₀₎ op elk van deze sites update venster D.
   OPMERKING: Rood gemarkeerd gebeurtenissen zijn vastbesloten om zijn afkomstig uit die bepaalde site en niet uit 'doordrukken' van activiteit gelokaliseerd in aangrenzende sites. De onderste blauw spoor geeft aan waar het fluorescentiesignaal op de gekozen plaats boven het detectiedrempel, terwijl de zwarte lijn geeft gebeurtenissen afkomstig uit die plaats (corresponderend met de rode gemarkeerde events).
8. Klik op een rode gemarkeerde gebeurtenis bijwerken venster E dat de temporele evolutie van de gebeurtenis weergeeft, en raam F, die toont de ruimtelijke profiel van het evenement gemiddeld over het tijdsverloop, samen met de ruimtelijke profiel van de gemonteerde Gaussische functie.
9. Handmatig de gebeurtenissen die zijn geïdentificeerd, zodat artefacten uit de analyse kan worden afgewezen. Wis dergelijke evenementen door rechts te klikken op de rode gemarkeerd evenementen.
   LET OP: In onze handen, Ca ²⁺ flux door één _IP-3 R-kanalen oproept signalen met AF / F ₀ ongeveer 0,11, dus elke gedetecteerde 'events' aanzienlijk kleiner dan dit zijn waarschijnlijk valse positieven zijn.
10. Exporteer gegevens door te kiezen voor 'Save to Excel' of exporteren van gegevens op een per cel basis door het tekenen rond de cel van de rente en het selecteren van 'Save CellR17 ;.
    NB: De gegevens worden opgeslagen in dezelfde map als het originele beeld stapel.

Resultaten

Figuur 1A toont een WF beeld van rust Cal-520 fluorescentie in menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen ook geladen met _ci-IP-3. Blootstelling van deze cellen om een 100 msec UV flits van de foto-versie i-IP ₃ uitgelokt voorbijgaande Ca ²⁺ soesjes op discrete sites (opgemerkt door de witte cirkels in figuur 1A). Fluorescentie sporen gemeten in situ vond snelle stijgende fase wegens tijdelijke openingen van _IP3 Rs, gevolgd door een veel langzame...

Discussie

We beschrijven hier protocollen voor de beeldvorming van de lokale Ca ²⁺ gebeurtenissen in gekweekte zoogdiercellen met fluorescerende Ca ²⁺ indicatoren. Verder beschrijven we een algoritme met een intuïtieve gebruikersinterface die de identificatie en analyse van de verkregen data automatiseert. De hier beschreven procedure gebruik maken van de fluorescerende Ca ²⁺ indicator Cal-520, maar veel andere Ca ²⁺ gevoelige kleurstoffen zoals Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 en Oregon Green BA...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisfosfaat-Hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glazen bodem beeldvorming schalen	MatTek	P35G-1.5-14-C