Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat een hulpmiddel biedt om regulerende mechanismen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van de hippocampus te onderzoeken. Het gebruik van ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur maakt de op- en neerregulatie van de expressie van genen van belang in enkele cellen mogelijk en volgt hun lot tijdens de ontwikkeling.

Samenvatting

Muisgenetica biedt een krachtig hulpmiddel om de rol van specifieke genen tijdens de ontwikkeling te bepalen. Het analyseren van de resulterende fenotypes door immunohistochemische en moleculaire methoden levert informatie op over potentiële doelgenen en signaalroutes. Om specifieke regulerende mechanismen verder te verduidelijken, is een systeem nodig dat de manipulatie van slechts een klein aantal cellen van een specifiek weefsel mogelijk maakt door middel van overexpressie, ablatie of herintroductie van specifieke genen en het volgen van hun lot tijdens de ontwikkeling. Om dit te bereiken, biedt ex utero elektroporatie van hippocampale structuren, met name de dentate gyrus, gevolgd door organotypische plakcultuur, een dergelijk hulpmiddel. Het gebruik van dit systeem om mozaïekdeletiën te genereren, maakt het mogelijk om te bepalen of het gen van belang celautonoom ontwikkelingsprocessen reguleert, zoals proliferatie van voorlopercellen of neuronale differentiatie. Bovendien vergemakkelijkt het het redden van fenotypes door de herintroductie van het verwijderde gen of zijn doelgenen. In tegenstelling tot in utero elektroporatie verbetert de ex utero benadering de snelheid van succesvol targeten van diepere hersenlagen zoals de dentate gyrus. Over het algemeen bieden ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur een krachtig hulpmiddel om regulerende mechanismen te bestuderen in een semi-natuurlijke omgeving die endogene omstandigheden weerspiegelt.

Inleiding

De hippocampus speelt een belangrijke rol in het geheugen en het leren evenals emotioneel gedrag. Een hoofdfunctie bestaat uit de consolidatie van kortetermijngeheugen in lange termijn geheugen, die een hoge plasticiteit van het zenuwstelsel vereist. De dentate gyrus van de hippocampus treedt op als eerste gateway voor ingangsinformatie en is één van twee hersengebieden met voortdurende neurogenese volwassen leeftijd ^1,2. De ontwikkeling van de hippocampus constructie optreedt tijdens de late embryogenese en vooral tijdens de eerste 3-4 weken postnatale ^3. Tijdens de vroege ontwikkeling van de gyrus dentatus een stamcel zwembad gevestigd is, is vereist voor postnatale evenals volwassen neurogenese ^4. Het ontwikkelen van neuronen passeren verschillende stadia, van de stamcel door verschillende stadia van voorlopercellen naar het onvolwassen en tenslotte de volwassen neuron tijdens postnatale evenals volwassen neurogenese. In verschillende stadia van de expressie van neurogenesespecifieke genen is vereist om de rijping en integratie van nieuwe neuronen in de hippocampus circuits ^5,6 toe.

Met muisgenetica en fenotype analyse met immunohistochemie en moleculaire methoden toegestaan ​​definieert het expressiepatroon en functie van vele van deze genen. Daarnaast microarray analyse als chromatine immunoprecipitatie (chip) verstrekt informatie over mogelijke directe en indirecte targetgenen ^7,8. Echter, er zijn nog veel open vragen met betrekking tot de regulerende mechanismen van de hippocampus ontwikkeling, met name de ontwikkeling van de dentate gyrus. Om verder inzicht hoe specifieke genen worden gereguleerd een systeem nodig waarmee de manipulatie van een klein aantal cellen krijgen door neerwaartse of opwaartse regulatie van het gen van interesse en / of de doelwitgenen en volgen hun lot tijdens de ontwikkeling. In utero elektroporatie van shRNAs, cDNA van genen van belang of Cre recombinase biedt een dergelijk instrument. Om de aanwezigheid van het gewenste DNA of kleine RNA expressie plasmiden worden gebruikt voor elektroporatie waarborgen. Deze benadering is zeer succesvol geïmplementeerd bestuderen Corticale ^9,10, maar is moeilijker benadering waarin de ontwikkeling van de dentate gyrus door de positie van de hippocampale structuren in diepere lagen hersenen.

Ex utero elektroporatie gevolgd door organotypische slice cultuur is een aanpak van dit probleem ^11,12 omzeilen. In tegenstelling tot in de baarmoeder elektroporatie niet het hele embryo, maar alleen het hoofd wordt gebruikt waardoor dus de elektroden te plaatsen in een gunstiger manier om direct de shRNA / DNA in de richting van de hippocampus en dentate gyrus. Onze groep succes toegepast ex utero elektroporatie om de rol van de transcriptiefactor Bcl11b bestuderen tijdens dentate gyrus ontwikkeling ^8. Bcl11b heeft een dubbele rol in de gyrus dentatus ontwikkeling door regulating voorlopercellen celproliferatie evenals differentiatie zoals werd aangetoond door immunohistochemie. Een mechanisme voor Bcl11b betrokkenheid bij deze processen verder te definiëren, werden protocollen van de Polleux groep ^11,12 aangepast aan de dentate gyrus zoals hieronder beschreven in de paragraaf protocol bestuderen. In een eerste benadering werd de vraag aan bod of Bcl11b is het reguleren van neuronale celdifferentiatie cel autonoom. Een tweede benadering onderzocht of Desmoplakine een direct doelwit gen Bcl11b, is voldoende om de Bcl11b fenotype te redden.

Protocol

OPMERKING: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wet worden uitgevoerd en werden goedgekeurd door de regering kantoren in Tübingen.

1. Bereiding van Micropipetten, oplossingen en Membranen

1. Bereiding van Micropipetten
   1. Trek glas micropipetten met behulp van een micropipet trekker met het volgende programma: Hitte: 540, Pull: 125, Snelheid: 20 en Vertraging: 140. De naald lengte bedraagt ​​5,5 cm.
   2. Bevel naalden met behulp van een microgrinder om een ​​geschikte tip grootte van 4 mm te verkrijgen. Bewaar de naalden in een doos of 15 cm petrischaal beschadiging van de uiteinden te voorkomen.
2. Voorbereiding van Solutions
   1. Plasmide DNA Solution
      1. Bereid plasmide DNA dat het gewenste cDNA construct middels endotoxine vrij Maxi-prep kit volgens protocol van de fabrikant.
      2. Pas plasmide-DNA-oplossing tot een eindconcentratie van 3 ug / ul (zonder GFP spike vector) of 4 ug /pl (bij 1 ug GFP aar vector) in endotoxine vrij Tris-EDTA-buffer die snel groen (eindconcentratie 0,05%).
   2. Laminin Stock oplossing
      1. Los 1 mg laminine in steriel water tot een eindvolume van 1 ml. Bereid 100 ul aliquots en bewaar bij -80 ° C.
   3. Poly-L-Lysine voorraadoplossing
      1. Los 50 mg van poly-L-lysine in 50 ml steriel water tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml. Bereiden 1 ml porties en bewaar in -20 ° C.
   4. Voltooien Hank's Balanced Salt Solution (Complete HBSS)
      1. Bereid Compleet HBSS door het combineren van 100 ml 10x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES buffer (pH 7.4), 30 ml 1 M D-glucose, 10 ml 100 mM _CaCl2, 10 ml 100 mM _MgSO4 en 4 ml 1 M _NaHCO3. Voeg steriel water tot 1 l en bewaar bij 4 ° C.
         OPMERKING: Autoclaaf alle oplossingen verwachten 1 M HEPES buffer en 1 M D-glucose, die fil zijnter gesteriliseerd.
   5. Slice Cultuur Medium
      1. Bereid slice kweekmedium door toevoeging van 35 ml basismedium Eagle 12,9 ml compleet HBSS (1.2.4), 1,35 ml 1 M D-glucose, 250 ul 200 mM L-glutamine, en 500 pl van penicilline-streptomycine op verkrijgen van een eindvolume van 50 ml. Voeg paardenserum tot een eindconcentratie van 5% en bewaar bij 4 ° C.
   6. Lage smeltpunt (LMP) Agarose
      1. Bereid een 4% LMP agarose door toevoeging van 2 g LMP agarose 50 ml compleet HBSS (1.2.4), gevolgd door verwarmen in een magnetron gedurende 1-2 minuten bij een hoog vermogen. Bewaar deze oplossing in een waterbad bij 37-39 ° C. Bewaar de oplossing bij 4 ° C en hergebruik.
   7. Paraformaldehyde Solution
      1. In een zuurkast stelt een 4% paraformaldehyde (PFA) door toevoeging van 4 g paraformaldehyde 100 ml 1x PBS. Verwarm de oplossing tot 60 ° C en enkele druppels van 1 N NaOH totdat de oplossing clear.
   8. Permeabilisatie Solution
      1. Oplossen in 300 ml 1X PBS dat 0,3% Triton X-100 en bewaar bij 4 ° C 9 g BSA. Voeg 10% natriumazide voor lange termijn opslag.
3. Coating van Membraan Inserts
   1. Verdun een aliquot van laminine stamoplossing (1.2.2) en een aliquot van poly-L-lysine voorraadoplossing (1.2.3) in steriel water tot een eindvolume van 12 ml.
   2. Plaats membraan inserts in 6 well platen met elk putje dat 2 ml steriel water. Voeg 1 ml bekledingsoplossing bovenop het membraan en geïncubeerd O / N bij 37 ° C in een 5% _CO2 incubator.
   3. Na incubatie was de membraan inserts driemaal met 1 ml steriel water en droog. Gebruik gecoat membraan inserts op dezelfde dag of bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal vier weken in een droge plaat met 6 putjes.

2. DNA-injectie en elektroporatie van E15.5 en E18.5 embryo

1. Verdoven tijd bevruchte muis door het in een verlamming kamer verzadigd met 5% isofluraan en verbonden met een verdamper. Circuleren isofluraan en zuurstof met een snelheid van 1 l / min. Houd het dier in de box voor 2-4 minuten of totdat onbewuste die wordt getest door knijpen tussen de poten van de muis.
2. Euthanaseren het onbewuste muis door cervicale dislocatie op embryonale dag (E) 15.5 of 18.5. Prepareer de baarmoeder met de embryo's ¹³ en plaats deze in een petrischaal met 15-20 ml koud volledig HBSS.
   LET OP: Vanaf dit punt, houdt de embryo's en weefsels op ijs.
3. Gebruik een schaar om elk embryo uit de baarmoeder hoorn en plaats te scheiden in een tweede petrischaal met koud compleet HBSS.
4. Onder een stereomicroscoop, scheiden de baarmoeder spierwand en de placenta met een paar fijne pincet (# 55) en schaar. Zorgvuldig het embryo uit de dooierzak los.
5. Gebruik een paar van Bonn schaar om decapitate het embryo boven de voorpoten bij een hoek van 60 °. Als het experiment vereist genotypering van de embryo's, het verzamelen van een weefselmonster voor genomische DNA-isolatie (een klein stukje van de staart).
6. Breng het hoofd naar een schone en droge petrischaal. Omdat de kop werd onthoofd in een hoek van 60 °, moet het hoofd opzij kantelen wanneer geplaatst dorsale zijde naar boven.
7. Plaats een naald voorzichtig in het midden van de halve bol nabij de bregma (Figuur 1A, B). Injecteer ongeveer 2-3 ul (3 of 4 ug / ul) van DNA oplossing voet op het pedaal van de picospritzer III toepassing van 30 kilo druk gedurende de duur van 10-15 msec per puls aanbrengen 5-8 pulsen. De duur en het aantal pulsen afhankelijk van de diameter van de naald opening met kleinere openingen meer tijd nodig. Het interval tussen elke puls bedraagt ​​1 sec.
8. Voor het plaatsen van de elektroden, enkele druppels volledig HBSS op het hoofd van de embryo. Plaats de elektroden zodanig dat de "negatieve" terminal aan dezelfde kant als het geïnjecteerde ventrikel en de "positieve" elektrode aan de tegenoverliggende zijde van de geïnjecteerde ventrikel onder het oor van het hoofd van de embryo's (Figuur 1C, D). Solliciteer 5 pulsen van 50 V.
   1. Gebruik 3 mm elektroden voor E 15,5 en 5 mm elektroden voor E 18,5.

3. Dissectie van de hersenen

1. Na de elektroporatie, loslaten van de huid van het hoofd met behulp van een paar fijne pincet. Met een paar veer schaar een kleine incisie in het midden van het cerebellum op de middenlijn van de schedel.
2. Plaats de veer schaar in de incisie en snijd in de lengte langs de pijlnaad. Schil van de schedel en verwijder de hersenen uit de schedel door het gebruik van fijne pincet. Breng de hele brein in 15-20 ml koud volledige HBSS oplossing.
3. Ondertussen giet 4% LMP agarose,bij 37-39 ° C bewaard in een waterbad, in een peel-away schimmel.
4. Neem de hersenen uit de volledige HBSS door een klein bolletje spatel en afvoer van overtollig HBSS met behulp van fijne papieren zakdoekje of Kimwipes.
5. Plaats het hele brein voorzichtig in de agarose en zijn positie met een fijne naald aan te passen. Houd de mal op ijs tot de agarose is gestold en het blok is verdeeld (voor coronale secties de olfactorische bollen omhoog wijzen).

4. Vibratome Sectioning en Slice Cultuur

1. Trim de LMP agarose blokken en lijm ze met het model podium met behulp van 'super lijm'. Nadat de lijm is droog overdracht het monster etappe naar de buffer lade van de vibratome en vul met ijskoud voltooien HBSS totdat het blok wordt ondergedompeld in de oplossing.
   OPMERKING: Steriliseer alle instrumenten en apparatuur oppervlakken met 70% ethanol voor het snijden.
2. Bereid 250 micrometer dik vibratoomcoupes behulp van een nieuw blad zoals gevolgd.
   1. Trim het blok wiste de volgende instellingen; frequentie - 60 Hz, amplitude - 0,7 micrometer, snelheid 16-18 mm / sec. Snijd de gedeelten met het gewenste weefsel met bovenstaande hier op lage snelheid (9 mm / sec). Vanaf het snijden van de achterhersenen, het verzamelen van 5-7 secties van de grote hersenen.
   2. Breng de sectie om een schone 6 putjes schotel met 5 ml ijskoud compleet HBSS met behulp van een gebogen spatel en op ijs bewaren totdat alle secties verzameld (figuur 1E).
3. Bevochtig de membraan in een kruis wijze met 100 pl volledig HBSS alvorens de onderdelen over de membraan, de oriëntatie van de delen te vergemakkelijken.
4. Breng de secties met behulp van een gebogen spatel op het membraan (pick-up een hoek van de sectie met een pincet en trek op de spatel en vervolgens met de tang om de sectie te duwen op het membraan). Plaats maximaal vijf secties op een membraan en regelen met behulp van een pincet (Figuur 1F). Niet overlappen de secties met elkaar.
   1. Neem het overtollige van HBSS uit het membraan met behulp van een pipet. De specifieke membranen hier gebruikt zijn bevestigd aan een frame en ingebracht in het weefsel kweekplaat, waardoor het weefsel in contact, maar niet in het medium.
5. Plaats het membraan inserts in een 6-wells plaat met 1,8 ml slice kweekmedium (1.2.5) (figuur 1 G, H). Incubeer de kweekschaal bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 11 DIV of 14 DIV. Wijzig de helft van het medium (0,9 ml) om de dag.
   Opmerking: In dit stadium reagentia wil toevoegen Bromodeoxyuridine (BrdU; 10 uM eindconcentratie) etikettering prolifererende cellen aan de media voor de eerste 20 uur van de kweekperiode.

5. Bevestiging van de secties Gevolgd door immunofluorescentiekleuring

1. Gebruik een schone en scherpe scalpel te snijden en trimmen van de membranen, afhankelijk van de oriëntatie vande secties.
2. Breng de delen samen met het membraan van een 24 wells plaat met 1 ml 4% PFA (1.2.7). Incubeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gevolgd door 3 wasbeurten met 1x PBS gedurende 15 minuten elk. Incubeer de secties O / N met permeabilisatie oplossing bij 4 ° C onder zacht schudden.
3. De volgende dag, incubeer de gedeelten met geschikte primaire antilichamen verdund in permeabilisatie oplossing, O / N of gedurende 48 uur bij 4 ° C onder zacht schudden.
4. Was de secties 3 keer voor 15 minuten met 1x PBS en incubeer O / N bij 4 ° C met de juiste secundaire antilichamen verdund in permeabilisatie oplossing.
5. Na de incubatie met secundaire antilichamen, was de secties eenmaal met 1x PBS gedurende 15 minuten gevolgd door DAPI kleuring gedurende 10 min.
6. Was de secties 3 keer met 1x PBS gedurende 15 minuten elk en over te dragen aan dia microscoop. Voeg ImmunoMount en voorzichtig plaats een dekglaasje op de top van de secties. Droog de glaasjes aan O / N bij 4 ° C en seal met nagellak.
   OPMERKING: Houd de dia's altijd bij 4 ° C.
   1. Analyseer de slice culturen door confocale microscopie (Figuur 1I).

Resultaten

Ablatie van de transcriptiefactor Bcl11b veroorzaakt aantasting van voorlopercellen celproliferatie en neuronale differentiatie hetgeen afbreuk dentate gyrus grootte en aantal cellen. Verder mutant neuronen niet te integreren in de hippocampus circuits waardoor leren en geheugen impairment ^8. Om vragen over de regulerende mechanisme (s) van Bcl11b in deze processen ex utero elektroporatie werd tewerkgesteld beantwoorden.

Het aanpakken van de vraag of Bcl11b cel-autonoom r...

Discussie

De hippocampus is een belangrijke functie bij het leren en het geheugen. De dentate gyrus is één van twee hersengebieden waar neurogenese treedt niet alleen tijdens de ontwikkeling, maar ook op volwassen leeftijd. Postnatale en volwassen hippocampale neurogenese verloopt op soortgelijke wijze waarbij veel gemeenschappelijke kenmerken. Het definiëren van de regulerende mechanismen van deze factoren zal zeer nuttig zijn bij het begrijpen van neurodegeneratieve ziekten, die op zijn beurt zal leiden tot nieuwe therapieën en...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Flaming/ Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments Company (USA)	P-97
Fine Glass Pipettes	Warner Instruments	G100F-4
Microgrinder	Narishige, Japan	EG-44
Anesthetic Bracket unit	Harvard Apparatus	PY2 34-0412
Halovet Vaporizer	Harvard Apparatus	PY2 34-0398
Fluovac System	Harvard Apparatus	PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Harvard Apparatus	PY2 34-0415
Anesthetizing Chamber	Harvard Apparatus	PY2 34-0460
Electroporator	BEX Company	CUY21 EDIT
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P3	3 mm electrodes for E15.5
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P5	5 mm electrodes for E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V	Thermo Scientific	920120
Dissection Microscope	Carl Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
Inverted Microscope	Leica	Leica DM IL LED
Confocal Microscope	Leica	Sp5II
6 well dish	BD Falcon	#353502
6 well dish	CELLSTAR	#657160
Tissue culture inserts	BD Falcon	#353090
Fast Green	Sigma	F7252
Laminin	Sigma	#L2020
Poly-L-lysine	Sigma	#P5899
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Forceps	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Life Technology	14180-046
BME	Life Technology	41010-26