Methodenartikel

Busulfan als myelosuppressieve Agent voor het genereren van een stabiel hoog niveau beenmergchimerisme in Muizen

13.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52553

⸱

1 april 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University, 2The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 3Division of Neurology, Department of Medicine, Neuromuscular Disease Unit, VHHSC

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol waarbij busulfan-conditionering het mogelijk maakt om het beenmerg van een ontvangende muis te vervangen door beenmergcellen van donormuizen die alomtegenwoordig groen fluorescent eiwit vertonen, zonder bestraling. Deze techniek is nuttig om de ophoping van beenmergcellen in het centrale zenuwstelsel te bestuderen.

Samenvatting

Mergsel van beenmerg (BMT) wordt vaak gebruikt om het beenmerg (BM) compartiment van ontvangende muizen te vervangen door BM-cellen die een aparte biomarker uitdrukken, geïsoleerd van donormuizen. Deze techniek maakt identificatie van donor-afgeleide hematopoëtische cellen binnen de ontvangende muizen mogelijk, en kan worden gebruikt om donorcellen te isoleren en te karakteriseren met behulp van verschillende biochemische technieken. BMT vertrouwt typisch op myeloablatieve conditionering met totale lichaamsbestraling om niche-ruimte binnen het BM-compartiment van ontvangende muizen te genereren voor donorcel-aanplant. Het protocol dat we hier beschrijven, gebruikt myelosuppressieve conditionering met het chemotherapeutische middel busulfan. In tegenstelling tot bestraling, die het gebruik van gespecialiseerde faciliteiten vereist, wordt busulfan-conditionering uitgevoerd met intraperitoneaal geïnjecteerde 20 mg/kg busulfan tot een totale dosis van 60-100 mg/kg is toegediend. Bovendien kan myeloablatieve bestraling toxische bijwerkingen hebben en vereist het succesvolle aanplant van donorcellen voor het overleven van ontvangende muizen. In tegenstelling hiermee wordt busulfan-conditionering met deze doses over het algemeen goed verdragen en overleven muizen zonder donorcel-ondersteuning. Donor-BM-cellen worden geïsoleerd uit de femurs en tibiae van muizen die ubiquitair groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengen, en geïnjecteerd in de laterale staartader van geconditioneerde ontvangende muizen. BM-chimerisme wordt geschat door het aantal GFP+ cellen in het perifere bloed na BMT te kwantificeren. Niveaus van chimerisme >80% worden typisch waargenomen in het perifere bloed 3-4 weken na transplantatie en blijven gevestigd gedurende minimaal 1 jaar. Net als bij bestraling, maakt conditionering met busulfan en BMT de accumulatie van donor-BM-afgeleide cellen binnen het centrale zenuwstelsel (CZS) mogelijk, met name in muismodellen van neurodegeneratie. Deze door busulfan gemedieerde CZS-accumulatie kan fysiologischer zijn dan totale lichaamsbestraling, omdat de busulfan-behandeling minder toxisch is en CZS-ontsteking lijkt minder uitgebreid te zijn. We veronderstellen dat deze cellen genetisch kunnen worden gemanipuleerd om therapeutische middelen aan het CZS te leveren.

Inleiding

Recentelijk is er aanzienlijke belangstelling geweest voor de rollen van microglia en beenmerg (BM)-afgeleide cellen (BMDC's) in het centrale zenuwstelsel (CZS), zowel tijdens ziekte als bij normaal verouderen. Microglia, de residente immuuncellen van het CZS, zijn nu bekend om zich in het CZS te ontwikkelen na de binnenkomst van primitieve myeloide voorlopercellen tijdens de embryogenese1. Microglia behouden aspecten van hun myelomonocytaire lijn tot ver in het volwassen leven. Hoewel bewijs suggereert dat de bijdrage van BMDC's aan de microgliale pool minimaal is bij gezonde volwassen dieren1, blijft de rol die BMDC's spelen in de progressie van verschillende neurodegeneratieve ziekten onduidelijk. Deze onzekerheid wordt nog verergerd door het feit dat het moeilijk is om BMDC's die zich ophopen in het CZS te onderscheiden van endogene residente microglia, aangezien er geen universeel aanvaarde discriminerende immunohistochemische marker is geïdentificeerd. Om BMDC's in vivo te monitoren, schuiven we een BM-transplantatie (BMT) protocol aan waarbij endogene BM-cellen van een ontvangende muis worden vervangen door die van een donormuis die ubiquitair groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt onder controle van de β-actine promotor. Dit protocol maakt de bepaling van zowel de lokalisatie als de morfologie van GFP+ BMDC's in de ontvangende muis mogelijk met behulp van immunohistologie, en vergemakkelijkt verdere karakterisering van deze cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gevolgd door daaropvolgende biochemische assays.

Voor een succesvolle BMT moeten de BM-cellen van de ontvangende muis worden afgenomen (termijn myeloablatie) om nicheruimte in het ontvangende BM te genereren om donorcel aanplanting mogelijk te maken. Vaak wordt myeloablatie bereikt met behulp van totale lichaams gammabestraling die dubbele strengbreuken in DNA veroorzaakt die leidt tot celdood, met name bij actief delende cellen zoals hematopoëtische voorlopercellen2,3. De bestralingsprotocollen worden uitgevoerd om voldoende BM-celdood te induceren, zodat de dierlijke letaliteit optreedt als het ontvangende dier geen adequate donorcel aanplanting uit BMT bereikt (de zogenaamde ‘dodelijke bestraling’). Echter, bestraling vereist een gespecialiseerde faciliteit en apparatuur, samen met veterinaire en dierhouderijbronnen die niet beschikbaar zijn voor onderzoekers bij alle instellingen. Bovendien kan myeloablatieve bestraling potentieel dodelijke schade aan andere weefsels veroorzaken, en vanwege immunosuppressie zijn bestraalde dieren vatbaarder voor secundaire infecties3. Als zodanig zijn gereduceerde intensiteit conditionering (zogenaamde ‘RIC’ protocollen) regimens ontwikkeld die bedoeld zijn om potentieel toxische bijwerkingen van het conditioneringsprotocol bij patiënten te minimaliseren, met name voor gebruik bij risicopopulaties zoals kinderen en ouderen4.

Sommige RIC-protocollen zijn afhankelijk van chemotherapeutica zoals busulfan om het BM-compartiment te conditioneren. Busulfan is een bifunctioneel DNA-alkylerend middel dat klinisch vaak wordt gebruikt als alternatief voor bestraling5,6. Opmerkelijk is dat busulfan veilig kan worden toegediend aan muizen door intraperitoneale (IP) injectie en geen gespecialiseerde faciliteiten en apparatuur vereist om muizen te bestralen. Busulfan-conditioning is uitgebreid gebruikt in ons lab7, evenals in verschillende andere recente publicaties8–11. Wanneer doses van 60-100 mg/kg worden gebruikt, kunnen hoge graden van stabiele chimerisme (>80% GFP+ cellen) worden vastgesteld in het perifere bloed en BM7. Belangrijk is dat bij deze doses myeloablatie niet compleet is en als zodanig kunnen muizen overleven zonder ondersteunende BM-cellen te ontvangen (K. Peake, J. Manning, C. Lewis, en C. Krieger, ongepubliceerde observaties). Bovendien is er bij myelosuppressieve busulfan-conditioning een snelle reconstititutie van perifere bloed myelomonocytaire cellen door donorcellen. Echter, de vervanging van perifere bloed lymfocyten door donorcellen is langzamer, wat de gebrek aan immunosuppressie aantoont die optreedt bij 60-100 mg/kg doses van busulfan vergeleken met totale lichaamsbestraling7.

We hebben succesvol busulfan-geïnduceerde chimerisme gebruikt om BMDC's te onderzoeken in wild-type muizen, evenals in muismodellen van de neurodegeneratieve stoornissen amyotrofe laterale sclerose (ALS)7 en Alzheimer-ziekte. Het is waargenomen dat onder bepaalde omstandigheden significante aantallen GFP+ BMDC's zich ophopen in het CZS7,12. Belangrijk is dat, net als myeloablatieve conditionering met bestraling, busulfan-conditioning gevolgd door BMT voldoende is om GFP+ BMDC-accumulatie binnen het CZS mogelijk te maken in zowel wild-type muizen als muizen met neurologische stoornissen7–11. Aangezien een groot obstakel bij de behandeling van neurodegeneratieve stoornissen de mogelijkheid is om therapeutische moleculen uit de circulatie in het CZS te krijgen waar ze gunstige effecten kunnen uitoefenen, roept dit de mogelijkheid op dat BMDC's kunnen worden ontworpen om therapeutische moleculen tot expressie te brengen, en vervolgens worden gebruikt als een voertuig om therapeutica af te leveren aan het CZS van busulfan-geconditioneerde ontvangers, een mechanisme dat we actief onderzoeken. Hoewel we hebben gevonden dat myeloablatieve conditionering met bestraling leidt tot een grotere accumulatie van GFP+ BMDC's in het CZS vergeleken met busulfan-conditioning7, kan bestraling aanzienlijke toxiciteit hebben bij patiënten met neurodegeneratieve stoornissen en bij muismodellen van CZS-ziekte.

Terwijl wij en vele anderen BMT-modellen hebben gebruikt om BMDC's in neurodegeneratieve stoornissen te bestuderen, is de mogelijkheid om het BM-compartiment van een ontvangende muis grotendeels te vervangen door een dui

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Ethiek Verklaring: Dit protocol is beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care Committee van Simon Fraser University goedgekeurd (UACC; toestaan ​​nummers 1037K-12 en 1060K-03) en is in overeenstemming met de Canadese Raad over Animal Care, de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, en de Europese richtlijn EEG.

1. Speciale overwegingen

OPMERKING: busulfan is cytotoxische. Gehanteerd en afgevoerd volgens de veiligheidsinformatieblad en institutionele richtlijnen.

  1. Voer alle technieken aseptisch in een laminaire stroming kap.
  2. Steriliseer instrumenten voor gebruik door wikkelen in een geschikt verpakkingsmateriaal, zoals een schil pakket en autoclaveren.
  3. Hoewel het risico op infectie lager met busulfan conditioning vergelijking met bestraling behandelen dieren slechts in een laminaire stroming kap voor de eerste 2 weken na transplantatie.

2. Conditionering vanOntvanger Muizen

  1. Verdun busulfan tot 3 mg / met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ml.
    OPMERKING: Het is belangrijk om een ​​frisse verdunning van busulfan net voor elke dag van de injectie gebruiken.
  2. Dien 20 mg / kg verdunde busulfan aan ontvangende muizen via IP-injectie dagelijks.
  3. Herhaal dagelijks IP injecties van 20 mg / kg busulfan tot een totale dosis van 60-100 mg / kg is geleverd (dwz een 80 mg / kg totale dosis toedienen 20 mg / kg busulfan gedurende 4 opeenvolgende dagen).

3. Isolatie van Donor Bone Marrow Cells

OPMERKING: Dit protocol is met succes gebruikt voor het isoleren en bereiden BM cellen van maximaal 5 donor muizen. Typisch de cel opbrengst per muis is ongeveer 30-40.000.000 BMDCs, wat voldoende is om 12-16 ontvanger muizen te transplanteren. Als er meer donormuizen nodig zijn het protocol moet mogelijk worden aangepast.

  1. Na de laatste dag van busulfan conditionering euthAnizé een GFP donor muis (1-6 maanden oud) met behulp van CO 2 (of door andere euthanasie procedure geaccepteerd bij instelling). Om te voorkomen dat graft complicaties te gebruiken syngeen donoren die hetzelfde geslacht als de ontvangers zijn.
  2. Spray muis met 70% ethanol. Til huid op de buik en met chirurgische schaar een insnijding door de huid van de buikholte het been naar de enkel. Houden van de voet, stevig trek de huid van de enkel in de richting van de heup het blootstellen van de been weefsel.
  3. Trim weg spier- en vetweefsel van het dijbeen naar het heupgewricht bloot.
  4. Terwijl zachtjes te trekken op de voet aan het been te verlengen, drukt u op de schaar tegen het heupgewricht. Juist boven de kop van het dijbeen maar zorg er voor het dijbeen zelf snijden.
  5. Om u te helpen de steriliteit te behouden, houdt het been van de voet en verwijder eventuele resterende weefsel van de botten door te wrijven op het bot oppervlak met geautoclaveerd weefsels.
  6. Scheid de femur en tibia door doorsnijden van het kniegewricht enPlaats het dijbeen in een cultuur schotel met steriele PBS. Incubeer op ijs.
  7. Verwijder de fibula gooi door te snijden op de punten waar de fibula verbinding met de tibia. Plaats de tibia in de cultuur schotel met het dijbeen en incubeer op ijs.
  8. Herhaal stap 3,2-3,7 voor het andere been, en eventueel extra donor muizen. Na verwijdering van de botten, steriliseren chirurgische instrumenten met een hete kraal sterilisator of een nieuwe set van steriele instrumenten voor de volgende stappen.
  9. Voor scheen-, houdt het dijbeen met een pincet en het gebruik van chirurgische schaar zorgvuldig 'scheren' de distale uiteinden van het bot. Verwijder zo weinig van het bot nodig de BM holte bloot.
  10. Vul een spuit met 3 ml steriele PBS en bevestig een 23 G naald. Zorgvuldig droeg de naald in de BM holte en spoel de BM in een steriele cultuur schotel. Zorg ervoor dat u de mergholte schraap met de punt van de naald om de verwijdering van alle gewenste cellen te waarborgen. Na extractie,waarborgen dat de rode BM niet meer zichtbaar en het bot wordt nu wit.
  11. Herhaal stap 3,9-3,10 voor daaropvolgende scheen-, pooling alle BM in dezelfde kweekschaal.
  12. Voor de tibiae, houd de tibia met een pincet en zorgvuldig 'scheren' het einde waar het scheenbeen was verbonden aan de knie voor de BM holte bloot. Maak een tweede snede langs het bot waar de zichtbare rode BM eindigt.
  13. Vul een spuit met 3 ml steriele PBS en bevestig een 25 G naald. Steek voorzichtig de naald in de BM holte (vanaf het einde, dat was verbonden aan de knie) en spoel de BM in de cultuur schotel met de BM van de dijbenen. Schraap de wanden van de BM holte met de naald om alle cellen te verwijderen. Na extractie ervoor dat de rode BM niet meer zichtbaar en het bot wordt nu wit.
  14. Herhaal stap 3,12-3,13 voor daaropvolgende tibiae, pooling alle BM in dezelfde kweekschaal.
  15. Zachtjes vermaal de BM met een 1 ml pipet tip om de c distantiërenells.
  16. Leid de celsuspensie door een 40 uM mand filter in een steriele 50 ml centrifugebuis. Spoel de schaal met PBS om alle resterende cellen af ​​en breng deze door de filter in de centrifugebuis.
  17. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
  18. Resuspendeer de pellet in 3 ml erytrocyt lyserende buffer. Incubeer op ijs gedurende 8,5 min.
  19. Voeg ~ 30 ml steriele PBS om de lyserende buffer blussen.
  20. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
  21. Resuspendeer de pellet in 1 ml steriel PBS. Houden op het ijs.
  22. Neem een ​​kleine hoeveelheid van het celhomogenaat en verdund met PBS (1: 100 voor 1 muis, 1: 200 voor 2 muizen, etc.) om het aantal cellen te kwantificeren met behulp van een hemocytometer.
  23. Verdun de celsuspensie tot 8 x 10 6 cellen / ml en incubeer op ijs tot injectie.

4. Bone Marrow Transplantation

  1. Fill een 0,5 ml spuit (met een 28 G naald insuline) met 300 pl verdunde celsuspensie voor elke muis worden geïnjecteerd. Zorg ervoor dat alle luchtbellen in de spuit te verwijderen.
  2. Plaats de muis kooi met daarin de geconditioneerde ontvanger muizen op een verwarming pad en laat de staart aderen te verwijden.
  3. Neem een ​​ontvanger muis en plaats in het beveiligingssysteem. Veeg de staart met chirurgische gaasje gedrenkt met 70% ethanol.
  4. Stevig vast te houden de staart en met de schuine kant naar boven, voorzichtig steek de naald in een van de laterale staart aderen en injecteer de celsuspensie.
  5. Houd chirurgische gaas op de injectieplaats tot bloeden stopt vóór het inbrengen van de muis in een nieuwe schone kooi.

5. Het inschatten van de omvang van BM Chimerisme

OPMERKING: Chimerisme niveaus zijn meestal variabele in het perifere bloed op 1 week na BMT, en als zodanig chimerisme niveaus gewoonlijk geschat tenminste 2 weken na BMT. Niveaus van Chimerism moet> 80% GFP + cellen in het perifere bloed te bereiken binnen 3-4 weken na BMT.

  1. Bereid FACS buffer (2 mM EDTA + 2% foetaal runderserum in PBS).
    OPMERKING: FACS buffer kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken.
  2. Plaats de muis op een straatverbod buis en scheren de vacht op het achterste been naar de laterale saphena bloot.
  3. Dunne vacht van de been met vaseline en doorboren de vena saphena met een 25 G naald.
  4. Verzamel ongeveer 50 ui bloed met heparine beklede capillaire buisje. Voeg het bloed naar een micro-centrifugebuis bevattende 1 ml FACS buffer. Meng de buis door omkeren en op te slaan op ijs.
  5. Houd chirurgische gaas op de injectieplaats totdat bloeden stopt alvorens terug te keren muis terug naar de kooi.
  6. Centrifugeer de bloedmonsters gedurende 5 min bij 900 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
  7. Re-schorten de pellet in 500 pi van erythrocyten lyseren buffer. Incubeer op ijs gedurende 8,5 min.
  8. Voeg 1 ml FACS buffer om de lyserende buffer blussen.
  9. Centrifugeer de monsters gedurende 5 min bij 900 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
  10. Voer een tweede lysis stap in 500 ui van erytrocyt lyserende buffer. Incubeer op ijs gedurende 8,5 min.
  11. Voeg 1 ml FACS buffer om de lyserende buffer blussen.
  12. Centrifugeer de monsters gedurende 5 min bij 900 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof. Controleer of de pellet is nu wit.
    OPMERKING: Als de pellet verschijnt nog steeds rood, kan een extra lysisstap nodig zijn voordat u verder gaat met de volgende stap.
  13. Resuspendeer de pellet in 1 ml FACS buffer. Centrifugeer de monsters gedurende 5 min bij 900 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
  14. Resuspendeer de pellet in 300 ui FACS-buffer en gekwantificeerd GFP + cellen middels flowcytometrie (NB: Op dit moment elke gewenste immunokleuring van de cellen kan worden uitgevoerd met standaard technieken voor cytometrische analyse stromen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De toediening van 60-100 mg / kg busulfan het algemeen goed getolereerd door muizen. Echter, dieren gewoonlijk afvallen tijdens de conditioneringsfase (~ 5-10%) en daarmee de voeding moet worden aangevuld met behandelt zoals bestraald zonnebloempitten te eten te stimuleren. Niveaus van chimerisme van> 80% GFP + cellen in het perifere bloed en BM consequent haalbaar met 60-100 mg / kg busulfan 7 zijn. Ons laboratorium heeft succes gebruikt dit protocol dan 100 chimere muizen met> 80% GFP + cellen in het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Busulfan conditionering maakt de productie van hoog niveau BM chimerisme in muizen met hematopoietische cellen die gemakkelijk detecteerbaar. Deze conditionering kan worden uitgevoerd zonder bestralingsinstallaties. Bovendien is myelosuppressie met doses busulfan die in dit protocol goed verdragen minimaliseren toxische bijwerkingen veroorzaakt door myeloablatieve doses van bestraling, en kan dus een geschikte techniek BM chimerisme bij jonge, oude of zieke muizen die beter genereren gevoelig voor bestraling myeloablati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Onderzoek (voor KP) en een Neuromusculaire Onderzoekspartnerschapsprogramma-subsidie van de CIHR, de ALS Society of Canada en Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) aan CK en FMR. Aanvullende ondersteuning werd ook verleend door de ALS Society of America (57969). We willen Dr. R. Keith Humphries van het Terry Fox Laboratory/Department of Pathology, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada en het personeel van de Simon Fraser University Animal Care Unit bedanken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BusulfexOtsuka Canada Pharmaceutical Inc.DIN 02240602Verdunn busulfan tot 3 mg/mL met steriel PBS vlak voor gebruik. Busulfan is cytotoxisch. Afhandelen en weggooien volgens de MSDS en institutionele richtlijnen.
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01Andere lyse buffer kan worden vervangen, maar de incubatietijden moeten mogelijk dienovereenkomstig worden aangepast
Fetal Bovine SerumLife Technologies12483-020

Referenties

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239 (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48 (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21 (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2 (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9 (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8 (4), e60661(2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21 (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. , 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8 (3), e58544(2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77 (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32 (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8 (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4 (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30 (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55 (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Conditionering met busulfanbeenmergtransplantatieflowcytometrie analyseGFP positieve cellenisolatie van beenmerginjectie in de staartveneanalyse van perifeer bloedaccumulatie in het centraal zenuwstelsel

Gerelateerde artikelen