Methodenartikel

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52556

⸱

12 maart 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Samenvatting

Toxoplasma gondii, de veroorzaker van toxoplasmose, is een obligate intracellulaire protozoaire ziekteverwekker. De parasiet dringt binnen en repliceert zich in vrijwel elk warmbloedig werveldierceltype. Tijdens het binnendringen van de parasiet in een gastheercel, creëert de parasiet een parasitoforous vacuoole (PV) die afkomstig is van het gastheercelmembraan, onafhankelijk van fagocytose, waarin de parasiet zich repliceert. Terwijl IFN-afhankelijke aangeboren en celgemedieerde immuniteit belangrijk is voor uiteindelijke controle van de infectie, kunnen aangeboren immuuncellen, inclusief neutrofielen, monocyten en dendritische cellen, ook dienen als voertuigen voor systemische verspreiding van de parasiet vroeg in de infectie. Er wordt een aanpak beschreven die het aangeboren immuunrespons van de gastheer, in dit geval macrofagen, gebruikt in een forward genetische screen om parasietmutanten te identificeren met een fitnessdefect in geïnfecteerde macrofagen na activering, maar normale invasie en replicatie in naïeve macrofagen. Dus, de screen isoleert parasietmutanten die een specifiek defect hebben in hun vermogen om de effecten van macrofaagactivering te weerstaan. Het artikel beschrijft twee brede fenotypes van muterende parasieten na activering van geïnfecteerde macrofagen: parasietstasis versus parasietdegradatie, vaak in amorfe vacuolen. De parasietmutanten worden vervolgens geanalyseerd om de verantwoordelijke parasietgenen te identificeren die specifiek belangrijk zijn voor resistentie tegen geïnduceerde bemiddelaars van celautonome immuniteit. Het artikel presenteert een algemene aanpak voor de forward genetic screen die, in theorie, kan worden aangepast om parasietgenen te targeten die belangrijk zijn voor resistentie tegen specifieke antimicrobiële bemiddelaars. Het beschrijft ook een aanpak om de specifieke macrofaagantimicrobiële bemiddelaars waarvoor de parasietmutant vatbaar is, te evalueren. Activering van geïnfecteerde macrofagen kan ook parasietdifferentiatie bevorderen van de tachyzoite naar de bradyzoite fase die chronische infectie onderhoudt. Daarom wordt methodologie gepresenteerd om de belangrijkheid van het geïdentificeerde parasietgen voor het vestigen van chronische infectie te evalueren.

Inleiding

Toxoplasma gondii (T. gondii) is een obligaat intracellulaire, protozoaal ziekteverwekker. Het is de verwekker van toxoplasmose, een gevaar voor de gezondheid in immuungecompromitteerde personen. Ook is het modelsysteem voor andere apicomplexa pathogenen die personen zoals Cryptosporidium en Cyclospora infecteren. Toxoplasmose wordt meestal verkregen door het eten van voedsel of water besmet met de bradyzoite of oocyst stadium van de parasiet. Bij inname, deze stadia te zetten naar de tachyzoite stadium van de parasiet die repliceert binnen gastheercellen en verspreidt systemisch. T-cellen, IFN-γ en, in mindere mate, stikstofmonoxide 1-4, zijn belangrijk voor de controle van de infectie, maar zijn niet in staat elimineren van de ziekte, als percentage van tachyzoïeten converteren naar het bradyzoite fase die beschermd in weefsel cysten resulterend in een langlevende chronische infectie. In feite zijn er geen therapieën effectief tegen chronische cyste stage van de ziekte. Ernstige toxoplasmose is meestal te wijten aan de reactivering van persisterende infectie, met de bradyzoite stadium van de parasiet het omzetten terug naar de snel repliceren tachyzoite stadium kenmerk van primaire en acute infectie.

Overleving in gezicht van de aangeboren immuunrespons is belangrijk dat de parasiet voldoende aantal parasieten te bereiken, alsook distale plaatsen te bereiken, de vestiging van chronische infectie mogelijk. T. gondii geëvolueerd strategieën gastheer afweermechanismen die waarschijnlijk bijdragen aan het vermogen tot replicatie en verspreiding vroeg in infectie tegengaan. Ten eerste, T. gondii vormt een unieke PV tijdens parasiet invasie die grotendeels gescheiden van de endocytische en exocytose proces van de gastheercel in vergelijking met andere intracellulaire pathogenen 5-9. Ook, net als alle succesvolle intracellulaire pathogenen T. gondii wijzigt haar gastheercel om een tolerante omgeving te creëren fof groei. Dit omvat herprogrammering gastheercel genexpressie door het veranderen gastheercel transcriptiefactoren waaronder die belangrijk voor het reguleren celactivering 10-15. ROP16 16-19 GRA15 20, GRA16 21 en GRA24 22 zijn allemaal aangetoond belangrijk te zijn bij het ​​reguleren van de transcriptionele respons en signaaltransductie cascades gastheercellen geïnfecteerd met T. gondii. Recente studies met behulp van genetische kruisingen tussen parasiet stammen met verschillende fenotypes zijn uiterst productief op het identificeren van de parasiet genen die parasiet genotype-afhankelijke eigenschappen, waaronder ontduiking van de immuniteit gerelateerde GTPasen (IRGs) 16,19,23-26 grondslag liggen geweest. Bij muizen immuniteits- GTPases (IRGs) cruciaal zijn voor de bestrijding van type II en III genotypen van de parasiet, terwijl het virulente type I genotypen mechanismen hebben ontwikkeld om de murine IRGs onttrekken. Het is echter ook duidelijk dat de parasiet mechanismen geëvolueerd antimicrobiële media onttrekkentors naast de IRGs en sommige van deze mechanismen kunnen worden bewaard in parasiet genotypen 27,28. Daarnaast, zeer weinig bekend over de kritische mediatoren van cel autonome immuniteit tegen T. gondii tijdens menselijk toxoplasmose. Parasite genen betrokken resistentie tegen bemiddelaars van cel- autonome immuniteit kunnen ook belangrijk zijn voor overleving gedurende tachyzoite conversie die ook kan worden veroorzaakt door gastheer immuunreacties bradyzoite. Zo kan stikstofmonoxide hoog niveau parasiet replicatie in geïnfecteerde macrofagen onderdrukken maar kan ook tachyzoite stimuleren omzetting resulteert in cystenproduktie 30-32 bradyzoite.

ToxoDB is een functionele genomische databank voor T. gondii, dat functioneert als een belangrijk hulpmiddel voor het gebied in termen van het verstrekken van sequentie-informatie voor de parasiet genoom en de toegang tot gepubliceerde en ongepubliceerde genomische schaal gegevens inclusief gemeenschap annotaties, gen exp ression en proteomics data 33. Net als vele protozoaire pathogenen, het merendeel van het genoom bestaat hypothetische genen zonder informatie gebaseerd op gen homologie inzicht verschaffen in de mogelijke functies. Dus vooruit genetica is een krachtig instrument om nieuwe parasiet genen belangrijk zijn voor het immuunsysteem fraude, cyste conversie en andere functies van cruciaal belang voor parasiet pathogenese, alsook voor de omrekening tussen verschillende ontwikkelingsstadia te identificeren. Een extra sterke forward genetics is dat het kan worden gebruikt als een relatief niet-voorgespannen benadering van de parasiet ondervragen om de genen die belangrijk zijn voor specifieke taken in pathogenese, waaronder immuun fraude en vorming van cysten zijn. Recente verbeteringen in next generation sequencing voor mutatie-profilering hebben het tot een methode van keuze voor de identificatie van de verantwoordelijke parasiet genen van forward genetics studies met behulp van zowel chemische als insertiemutagenese 34-37 gemaakt.

ntent "> Het is belangrijk om kwetsbaarheden T. gondii die kunnen worden benut om de doeltreffendheid van cel autonome afweermechanismen tegen de parasiet name die ook actief tegen de resistente cyste fase zijn. Tegen dit doel een in vitro muizen kan worden verbeterd macrofaag infectie en activering model ontwikkeld om mutaties in de parasiet die specifiek beïnvloeden T. gondii conditie na activering van geïnfecteerde macrofagen maar niet in naïeve macrofagen herkennen. Deze macrofaag scherm werd toegepast om een bibliotheek van T. gondii insertie mutanten ondervragen om uiteindelijk identificeren T. gondii genen betrokken resistentie tegen stikstofoxide 27,28. De isolatie van een panel van T. gondii mutanten met verminderde weerstand activering van geïnfecteerde macrofagen, in het bijzonder een duidelijke gevoeligheid voor stikstofoxide, bleek het nut van het scherm te identificeren parasiet genen die belangrijk zijn voor de weerstandbemiddelaars van cel- autonome immuniteit dan de resistentiemechanismen beschreven voor muizen IRGs 28. Mutagenese heeft voordelen boven chemische mutagenese in termen van het genereren van een beperkt aantal willekeurige mutaties in elke kloon en parasieten, in theorie, snellere identificatie van de plaats van mutatie. Het identificeren van de genomische plaats van plasmide invoeging in T. gondii insertie mutanten, in de praktijk is verrassenderwijs moeilijk in veel gevallen 37. Het inbrengen van een plasmide in een gen waarschijnlijk ook de functie van een gen te verstoren in tegenstelling tot chemische mutagenese die resulteert gewoonlijk in enkele nucleotide veranderingen. Echter, chemische mutagenese met ofwel N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of ethylmethaansulfonaat (EMS) een versterkt vermogen om een ​​groter deel van de parasiet genoom analyse bieden, vergeleken mutagenese, zoals maakt meerdere single nucleotide polymorphisms ( geschat op 10 -100) per mutant 34, 38. Bovendien recente vooruitgang geheel genoom profilering heeft het mogelijk gemaakt de volgende generatie sequencing gebruiken om de meest waarschijnlijke kandidaat genen voor de geïdentificeerde fenotype van een gemuteerde parasiet 34,38 identificeren. Ongeacht de mutagenesebenadering bevestiging van de rol van de parasiet gen resistentie tegen macrofaag activatie uiteindelijk vereist gendeletie en complementatie moleculaire Koch's postulaten voldoen.

De mogelijkheid om de functie van een gen door genetische manipulatie van zowel de parasiet en de macrofaag ontleden is belangrijk omdat vele genen geïdentificeerd via forward genetics T. gondii, evenals andere pathogenen, nog steeds sprake als hypothetisch genen met weinig tot geen sequentie homologie met andere eiwitten met bekende functies. Het huidige document wordt een algemene aanpak die kan worden gebruikt voor het identificeren of het verstoorde gen in een mutant is belangrijk voor resistentie tegen bekende ofonbekend mediator van cel autonome immuniteit. De eerste analyse van gastheer antimicrobiële factoren wordt uitgevoerd door het evalueren van de overleving van wild-type en mutante parasieten in macrofagen van wild-type muizen versus die met een specifiek gen deleties in induceerbare stikstofmonoxide synthase (iNOS), gp-91 phox (NADPH oxidase), en specifieke immuniteit gerelateerde GTPasen (IRGs). Dit bepaalt of de geïdentificeerde parasiet genen belangrijk voor resistentie stikstofoxide, reactieve zuurstofintermediairen respectievelijk of een onbekend immuun mechanisme betrokken immuniteit gerelateerde GTPases 28. Activering van geïnfecteerde macrofagen zowel IFN-γ en LPS in het huidige protocol beschreven, resulteert voornamelijk in de isolatie van genen betrokken parasiet resistentie tegen stikstofmonoxide 28. Het gebruik van farmacologische middelen die stikstofoxide induceren in de afwezigheid van activering van macrofagen (stikstofoxide donoren) bevestigden dat de meerderheid van de genen die belangrijk waren voor hergebruikresistentie tegen stikstofoxide in plaats van stikstofmonoxide in overleg met extra mediators in verband met macrofaagactivering 28.

Stap één en twee beschrijven een forward genetics scherm ontworpen om parasiet mutanten te isoleren met een fitness defect na activering van geïnfecteerde beenmerg-afgeleide macrofagen in vitro. Stap één beschrijft een dosistitratie analyse een dosis van IFN-γ en LPS empirisch bepaald moet worden voor macrofaag activatie parasiet replicatie vermindert maar niet volledig replicatie van de wildtype T. remmen gondii ouderlijke stam die wordt gebruikt voor het maken van de bibliotheek van mutanten parasiet. Stap twee beschrijft de voorwaartse genetische screen van de mutante klonen in macrofagen in 96-well platen. Stap drie schetst een aanpak die het fenotype van elke mutant die in het scherm van de 96 putjes en beoordelen of het defect in elke mutant beïnvloedt parasiet overleving, replicatie bevestigenof cyste productie in respons op macrofaag activatie. Stap vier beschrijft het gebruik van beenmerg afgeleide macrofagen van muizen met deleties specifieke antimicrobiële routes naar de immuunmediatoren waarop het parasiet mutant specifiek gevoelig identificeren. Stap vijf schetst een benadering te bepalen of een parasiet mutant ook gecompromitteerd in vivo pathogenese geëvalueerd door cystenproduktie in de hersenen van geïnfecteerde muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Alle protocollen die het gebruik van dieren te betrekken werden uitgevoerd in overeenstemming met de uiteengezet door de New York Medical College's Animal Care en gebruik Comite richtlijnen en voorschriften.
OPMERKING: Gedetailleerde protocollen voor chemische mutagenese 38 isolatie van parasieten door beperkende verdunning 38, isolatie van muizen beenmerg afgeleide macrofagen 39, groei van T. gondii in menselijke voorhuid fibroblast (HFF) cellen en cyste productie in macrofagen en basic immunofluorescentieanalyse (IFA) 32 wordt verwezen. Voer alle celkweek bij 37 ° C in 5% CO2 in D10 medium (Dulbecco's gemodificeerd High Glucose Eagle Medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) . Houd alle reagentia steriele hele cel isolaties en celkweek.

1. Dosis Titratie van IFN-γ en LPS aan Bepaal de Concentraties te gebruiken om Infected Macrofagen voor de Forward Genetica scherm te activeren

  1. Cultuur muizen beenmerg afgeleide macrofagen O / N in acht kamer objectglaasjes in een concentratie van 3 x 10 5 cellen / ml in 250 pl D10 media per kamer. Gebruik macrofagen 1-2 weken na isolatie uit beenmerg.
    OPMERKING: Kamer dia's worden gekocht die een groeibevorderende RS wassen hebben.
  2. Gebruik een hemocytometer met wild type parasieten geoogst uit menselijke voorhuid fibroblast (HFF) cellen gekweekt in een T25 weefselkweekkolf tellen. Resuspendeer parasieten bij een concentratie van 5 x 10 5 wildtype parasieten per ml in D10 media. Deze concentratie zal leiden tot een multipliciteit van infectie van ongeveer 1: 1 als macrofagen zal verspreid O / N. Gebruik polystyreen of PET-buizen voor alle manipulaties met parasieten als de parasiet stokken te polypropyleen.
  3. Verwijder de D10 media in de kamer glijbanen en vervangen door 250 ul van deopschorting van wild type parasieten. Voeg voorzichtig de parasiet schorsing voor elke kamer van de dia door te laten stromen naar beneden de binnenkant van elke kamer. Sta niet toe dat macrofagen uit te drogen op enig moment tijdens het protocol.
  4. Cover kamer dia's besmet met parasieten bij de kamer schuif deksel en plaats het in een incubator bij 37 ° C in 5% CO 2 voor 4 uur de tijd te geven de parasiet binnen te vallen en stellen een PV.
  5. Maak verdunningen van LPS en IFN-γ in 1 ml D10 medium in steriele buizen voor doseringstitraties. Voor doseringstitraties houden ofwel LPS of IFN concentratie constant en variëren van de andere stimulus 40.
    1. Bijvoorbeeld, constant houden LPS bij 10 ng LPS per ml en varieert de concentratie van IFN-γ (0, 1 eenheid / ml, 10 eenheden / ml, 100 eenheden / ml, 1,000 eenheden / ml). Houd IFN γ constant op 100 eenheden / ml en varieert de concentratie van LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Kort sonicaat LPS voorraad voor 2 min zonderverwarming in een badsonificeerinrichting (niet met een tip sonicator) voorafgaand aan verdunning.
      OPMERKING: Sonicatie wordt aanbevolen om micellen aggregaten gevormd door LPS die niet goed binden aan gastheercellen verstoren.
  6. 4 uur na aanvang van de co-cultuur tussen de parasieten en aanhanger macrofagen in de kamer glijbaan, gooi de D10 media in elke kamer en te vervangen door 300 pl van de geschikte verdunningen van IFN-γ en LPS in D10 media. Neem een ​​controle met alleen D10 media parasieten replicatie evalueren afwezigheid van macrofaag activatie.
  7. Re-cover kamer dia's met de kamer schuif deksel en plaats het in een incubator bij 37 ° C in 5% CO 2 voor 24 tot 30 extra uur.
    OPMERKING: Incubatietijd is afhankelijk van de verdubbelingstijd van het wildtype stam parasiet die kan variëren 6-12 uur, afhankelijk van de parasiet stam. Een tijdstip wordt vooraf gekozen om lysis van naïeve macrofagen parasiet, maar lang genoeg om minstens 3-4 dou mogelijkbling tijden.
  8. Voeg een 2,5% formaldehyde oplossing in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gooi de media in de kamer glijbaan en te vervangen door 300 ul van de 2,5% formaldehyde-oplossing. Oplossing voor 20 min bij kamertemperatuur.
  9. Rinse slide (s) tweemaal met 300 ul van PBS per kamer. Voor elke spoeling, gooi het PBS in de dia en voeg nieuwe PBS voorzichtig langs de binnenkant van elke dia kamer om te voorkomen dat het verstoren van de macrofagen gehandeld op grond van de dia. Voeg 300 ul van PBS per kamer en plaats deksel op kamer dia naar dia's niet uitdroogt voorafgaand aan kleuring.
    OPMERKING: slides kunnen worden geplaatst bij 4 C gedurende maximaal 3 dagen op dit punt voor de kleurreactie.
  10. Kleuringsprotocol voor T. gondii detectie door immunofluorescentie microscopie (IFA).
    1. Voeg een 0,2% Triton X-100 oplossing in PBS (permeabilisatie buffer). Plaats de oplossing in een buis in een 37 ° C waterbad en kort vortex om de verzekering de Triton X-100 in oplossing gaat. Gooi dePBS in de kamer glijbanen en vervangen door 300 ul van de permeabilisatie buffer. Laat bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    2. Voeg een oplossing van 10% geit serum in PBS (blokkerende oplossing). Gooi de permeabilisatie buffer in de glijbaan en te vervangen door 300 ul van het blokkeren oplossing per kamer. Laat bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
      OPMERKING: Foetaal kalfsserum kan vervangen geit serum in alle kleuringsprotocollen.
    3. Voor één stap IFA kleuringsprotocol, maak een 1: 1000 verdunning van een fluorescerend geconjugeerd antilichaam tegen T. gondii in blokkeeroplossing. Verwijder het blokkeren oplossing van dia en voeg 150 ul van antilichaam-oplossing per kamer. Plaats het deksel dia op kamer dia om cellen niet uitdrogen. Incubeer gedurende 1 uur bij KT.
      OPMERKING: Antilichaam concentratie moet empirisch worden bepaald afhankelijk van de bron. Antilichaam wordt gekocht rechtstreeks geconjugeerd aan een fluorochroom of geconjugeerd aan een fluorochroom door de gebruiker.
      1. Voor een twee-staps IFA vlekkenprotocol met een geconjugeerd antilichaam tegen T. gondii en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam, vlek dia's met 150 ul van ongeconjugeerde primaire antilichaam tegen T. gondii in blokkerende buffer gedurende 1 uur bij KT. Spoel 3x met 300 ul van PBS plus 1% geit serum (wasbuffer).
      2. Voeg 150 ul van fluorescent-geconjugeerd secundair antilichaam specifiek voor de soort van oorsprong voor het primaire antilichaam. Plaats het deksel dia op kamer dia om cellen niet uitdrogen. Incubeer gedurende 1 uur bij KT.
    4. Spoel de objectglaasjes 3x met PBS plus 1% geit serum (wassen buffer). Voor elke spoeling, verwijdert u de oplossing in de kamer dia's door storting op de inhoud en te vervangen door 300 ul van het wassen buffer.
    5. Spoel de objectglaasjes 2x met 300 pi PBS.
    6. Verwijder de kamer uit de kamer glijbaan volgens de instructies van de fabrikant.
    7. Mount glijdt met montage media met DAPI (4'6-diamidino-2-fenylindool, dilactate) en een 22 mm x 50 mm dekglaasje.
  11. Onderzoeken dia's met behulp fase contrast en fluorescentie microscopie. Bepaal het gemiddelde aantal parasieten per vacuole door het onderzoeken van een minimum van 100 PV's per kamer ook. De gekozen dosis IFN-γ en LPS voor het scherm moet voldoende onderdrukken, maar niet voorkomen replicatie van wildtype parasieten (zie figuur 1).

2. Isolatie van Parasite Mutanten met een fitnesscentrum Defect na activering van geïnfecteerde macrofagen

OPMERKING: Een bibliotheek van willekeurige T. gondii mutanten is vereist voor de voorwaartse genetica scherm. Willekeurige mutagenese van T. gondii kan worden uitgevoerd door chemische (ENU / EMS) of insertiemutagenese 27,28,38. Na mutagenese, kloon parasieten door beperkende verdunning en groeien afzonderlijke klonen in 96 putjes bevattende hechtende HFF cellen in een volume van 200 ui D10 media 32,38.Het is essentieel dat 96-well platen voor het screenen van parasieten in macrofagen door microscopie moeten optische bodems microscopisch onderzoek mogelijk. Fase contrast en fluorescentie microscopie screenen gekleurd met 96 putjes vereist een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met fasecontrast 4, 10, 20 of 40x objectief uitgerust lange werkafstand. Een 4X doelstelling is handig voor het zien van de gehele aardig maar betere resolutie van de parasieten wordt bereikt met de 20X objectief.

  1. Breng 50 pl tachyzoite mutanten gekweekt in confluente HFF cellen in 96-putjes weefselkweekplaten in twee repliceren 96 putjes bevattende murine beenmerg afgeleide macrofagen (1-2 weken na isolatie) in 100 pl D10 media.
    Opmerking: Voer het beginscherm in 96-putjesplaten van de parasiet op basis van volume van parasiet cultuur te voorkomen dat het aantal parasieten overgedragen per elk putje te tellen. Zo wordt de microscopie analyse in 2.6 kwalitatief gebaseerd op whether parasieten algemeen gerepliceerd of niet gerepliceerd. Stap 3 beschrijft de aanpak van het fenotype van de mutanten in kamer slides bevestig met gelijke aantallen wilde type of mutant parasieten macrofagen infecteren.
    1. Direct parasieten toe te voegen aan de D10 media reeds in elk putje. Infect twee putjes met wildtype tachyzoiten als een positieve controle voor parasiet replicatie.
  2. Plaats de geïnfecteerde cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2) gedurende 4 uur tot parasieten voldoende tijd om de cellen binnendringen en creëren hun PV.
  3. Verwijder het afdrukmateriaal uit één plaat door het dumpen van de inhoud van de plaat. Gebruik één polsbeweging naar de media in de plaat te dumpen in een discard bassin met daarin een reinigingsmiddel cide voor de parasieten.
    1. Voeg 100 ul van "macrofaagactivering media" met behulp van een steriele bassin voor de media en een multichannel pipet. Met de optimale concentratie van LPS en IFN-γ bepaald uit stap 1 van de macrophage activering media. Zo ook materiaal uit de dubbele controle bord en te vervangen door 100 ul van D10 media.
  4. Plaats de geïnfecteerde cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2) gedurende nog 24-30 uur.
  5. Kleuringsprotocol 96-well platen voor IFA.
    1. Gooi de media in de plaat en vervangen door 100 ui 2,5% formaldehyde in PBS. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een steriele bassin voor de formaldehyde en een multichannel pipet.
    2. Gooi de formaldehyde oplossing in de plaat en voeg 100 ul PBS om de formaldehyde van de plaat te spoelen.
    3. Gooi de oplossing in de plaat en voeg 100 pl permeabilisatie buffer (PBS met 0,2% Triton X-100) aan elk putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Gooi de oplossing in de plaat en voeg 100 ul van blokkeeroplossing (PBS met 10% geit serum) aan elk putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Gooi de oplossing in de plaat. Voeg 50 ul / putje van een fluorescent-geconjugeerde anti- T. gondii antilichaam verdund 1: 1000 in PBS plus 1% geit serum. Incubeer gedurende 1 uur bij KT met de plaatafdekking op en op een rocker.
      1. U kunt ook gebruik maken van een niet-geconjugeerd primair antilichaam tegen T. gondii gevolgd door kleuring met fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam zoals beschreven in 1.10.3.1.
    6. Gooi het antilichaam oplossing in de plaat en vervangen door 100 ul / putje PBS + 1% geit serum. Voer deze spoeling 3x gevolgd door 2 extra spoelgangen met PBS alleen. Verlaat 200 ul van PBS in elk putje en plaats de deksel op de plaat met 96 om te voorkomen dat de putten uit drogen.
      OPMERKING: De plaat met het deksel op kan worden verpakt in parafilm en geplaatst bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen vóór analyse door microscopie.
  6. Onderzoek cellen onder een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met een 20-40X doel. Selecteer mutanten die repliceren in de na &# 239; ve macrofaag plaat maar vooral niet te repliceren dan een parasiet / vacuole in "geactiveerde macrofagen" of dat amorf of afgebroken in "geactiveerde macrofagen" verschijnen.
    Opmerking: Het aantal wildtype parasieten per vacuole is afhankelijk van de dosis van IFN-γ en LPS gebruikt, maar idealiter ongeveer 4 parasieten per vacuole; een getal die de groei onderdrukken, maar niet volledige remming van replicatie van het activeringsstimulus weerspiegelt.

3. Evalueer de mutanten te bepalen of het defect wordt op het niveau van Parasite Survival of Replication Na activering van geïnfecteerde macrofagen

  1. Transfer gekozen parasiet mutanten van 96-well platen (volledige inhoud van het putje) aan T25s die HFF cellen en laat replicatie.
  2. Cultuur beenmerg afgeleide macrofagen O / N 8 kamer objectglaasjes in een concentratie van 3 x 10 5 cellen / ml in 250 pl D10 media. Bereid een dia om te vergelijken parasite replicatie in naïeve macrofagen en een extra dia om te vergelijken parasiet replicatie na activering van geïnfecteerde macrofagen.
  3. Oogst tachyzoite parasieten en te tellen in een hemocytometer. Voeg 5 × 10 4 T. gondii parasieten naar een kamer putje met macrofagen in D10 media en cultuur voor 4 uur. Inclusief een putje met wildtype ouderlijke parasieten als controle. Te enten een identieke repliceren dia met dezelfde parasiet kloon die niet activering media zullen ontvangen om replicatie van parasieten in naïeve macrofagen bewaken.
  4. Gooi D10 media uit 1 van de repliceren kamer glijbanen en te vervangen door 250 ul van "activering media". Gooi D10 media uit de andere repliceren kamer glijbaan en te vervangen door 250 ul van D10 media. Incubeer zowel "geactiveerd" en "naïeve" macrofaag dia met de kamer schuif op bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende een additionale 24-30 uur.
  5. Fix, doorlaatbaar en blok glijbanen voor IFA kleuring en analyse van parasieten zoals beschreven in stap 1. Voer IFA kleuring met de kamers intact.
    1. Co-vlek cellen met een antilichaam aan membraangebonden 1 (LAMP1) of Lysotracker en antilichaam lysosomale T. gondii te beoordelen of activatie van geïnfecteerde macrofagen activeert fusie van de mutant PV met lysosomen (figuur 4).
    2. Gebruik antilichamen tegen specifieke vakken / organellen binnen de parasiet / PV voor het kleuren door IFA aan veranderingen in de parasiet mutant die evident zijn begin volgende macrofaagactivering 28 identificeren.
      OPMERKING: Dergelijke wijzigingen kunnen inzicht geven in het mechanisme dat de gebrekkige survival / replicatie van de mutant volgende macrofaagactivering ten grondslag ligt.
  6. Onderzoeken dia's met behulp van een 100X fase olie objectief en fluorescentie microscopie.
    1. Evalueer parasiet replicatie door bepaling van deaantal parasieten per PV in 100 willekeurige vacuolen. Voer tenminste 2 tellingen van 100 vacuolen elk voor statistische analyse.
    2. Evalueer algemene parasiet morfologie met behulp van zowel fluorescentie analyse als fasecontrastmicroscopie. Bekijk parasieten onder fase 100x objectief. Gezonde parasieten hebben parasieten strak omsloten door een nauwsluitende parasitophorous vacuole. Parasieten die amorfe ruime vacuolen met fase dichte velgen of amorf parasieten hebben suggereren parasiet dood in plaats van alleen een defect in replicatie (figuren 1 en 3).

4. Evalueer of de gevoeligheid van Mutant Parasieten aan Activering van geïnfecteerde macrofagen wordt geassocieerd met bekende anti-microbiële Mediators

  1. Isoleer beenmerg-afgeleide macrofagen van wild-type C57 / BL6 muizen, iNOS - / -, Gp91-phox - / - of Irgm1 / Irgm3 - / - muizen 32.
  2. Cultuur respectieve beenmerg afgeleide macmacrofagen van muizen O / N 8 kamer objectglaasjes in een concentratie van 3 x 10 5 cellen / ml in 250 pl D10 media.
  3. Doorgaan met parasiet uitdaging, IFA vlekken, en de analyse zoals beschreven in stap 3.
  4. Bepaal of het vermogen van de mutant parasieten te overleven en repliceren na activering van geïnfecteerde macrofagen wordt hersteld in afwezigheid van reactieve zuurstof of stikstof species of specifieke immuniteit gerelateerde GTPases 28.
  5. Gebruik farmacologische middelen, zoals stikstofoxide donoren te beoordelen of specifieke anti-microbiële mediators zich volstaan ​​om mutant parasieten in HFF cellen of macrofagen naïeve aantasting of ze werken alleen samen met andere mediatoren van macrofagen activeren 28.

5. Evalueer of het defect in de Mutant Parasite Compromissen chronische infectie

  1. Isoleer tachyzoiten van wild-type, mutant of gerichte gen verwijderd parasieten geteeld in T25s containing HFF cellen. Parasieten moeten vers worden gelyseerd van HFF culturen.
  2. Telling parasieten met een hemocytometer. Resuspendeer parasieten in Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in een concentratie per ml geschikt voor een subletale dosis van de parasiet geleverd in 200 pl door intraperitoneale (IP) injectie.
  3. Gebruik een 1 ml tuberculinespuit en 25 G naald om parasieten met een 200 ul volume intraperitoneaal (IP) te injecteren. De dosis is afhankelijk van de wild type stam van de parasiet en de muis genotype.
    OPMERKING: Type I genotypen van de parasiet zijn dodelijk voor muizen tijdens de acute fase van de infectie ongeacht parasiet dosis en zijn niet geschikt voor studies van chronische infectie in afwezigheid van chemotherapie voor T. gondii om parasiet replicatie te onderdrukken.
  4. Dertig dagen na parasiet uitdaging, offeren muizen door inademing van CO 2 uit een onder druk tank in een rustige kamer (een standaard formaat muis kooi mag niet meer dan 5 m bevattenice) gevolgd door cervicale dislocatie.
  5. Isoleer de hersenen van de muis volgens vaste procedures 41-43.
    1. Leg de muis op de voorzijde. Spuit de kop met 70% ethanol om het gebied te steriliseren.
    2. Gebruik een scherpe schaar door de hersenstam te snijden. Gebruik Prepareerschaar een ondiepe snede lateraal rond de rechter en de linker kant van de schedel vanaf de basis van de hersenstam maken. Gebruik een tang om voorzichtig te schillen terug de schedel naar de hersenen bloot te leggen.
    3. Til de hersenen en plaats een schaar tussen de hersenen en de basis van de schedel naar de olfactorische zenuw naar de hersenen vrij te snijden. Til de hersenen met een steriel pincet of een spatel en plaats in een bacteriologische Petri plaat met 10 ml steriel PBS.
  6. Snijd de hersenen helft met een steriele scalpel door het midden tussen de rechter en linker hemisferen.
  7. Voeg de helft van de hersenen om een ​​kleine mortier met 1 ml PBS. Met de vijzel en stamper ommaak een fijne weefsel schorsing van de hersenen dat kan passeren door een wijde boring 20-200 ul pipet tip.
    OPMERKING: De andere helft van de hersenen moet 2.5% formaldehyde worden vastgesteld gedurende 1 uur of weefselsecties nodig voor histopathologie.
  8. Breng 100 ui van de hersenen lysaat in een 1,7 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml 2,5% formaldehyde in PBS in de buis bevattende de hersenen lysaat naar de hersenen suspensie vast voor kleuring. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  9. Centrifugeer het lysaat bij 8000 xg gedurende 5 minuten in een microcentrifuge en de bovenstaande vloeistof voorzichtig verwijderen.
  10. Voeg 1 ml permeabilisatie / blokkeerbuffer aan het lysaat (10% geit serum, 0,2% Triton X-100 in PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  11. Centrifuge lysaat bij 8000 xg gedurende 5 minuten en verwijder supernatant.
  12. Voeg 200 ul FITC-geconjugeerd Dolichos biflorus agglutin (DBA). Gebruik een 1: 100 verdunning van het lectine in PBS plus 10% geit serum. Voorzichtig resuspendeer de lysaat door pipetteren. Broedengedurende 1 uur bij KT.
    OPMERKING: DBA is een ligand dat bindt aan CST1 de parasiet cystewand.
  13. Centrifuge lysaat bij 8000 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 1 ml PBS aan de pellet. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Herhaal PBS wassen 3x. Verwijder de bovenstaande vloeistof na de laatste wassing met een pipet.
  14. Gebruik een wijde boring 20-200 ul pipettip tot het opstellen van 5 pl van de gebrandschilderde hersenen lysate en leg ze op een microscoop dia. Monteer de dia met een 25 x 25 mm dekglas op een natte mount te maken van de hersenen lysaat. Voeg 3 repliceren objectglaasjes met 5 gl van elk lysaat hersenen.
  15. Tel het aantal cysten per elke 5 pl aliquot van fluorescentie microscopie met een 10X objectief (figuur 6).
    OPMERKING: Sommige cysten zijn groot (8 of meer parasieten ongeveer) terwijl sommige zijn erg klein (1-2 parasieten per cyste). Count totaal aantal cysten per elke dia maar documentnummer van grote versus aantal kleine cysten.
  16. Voeg het aantal cysten detecteerd in drie verschillende 5 ul aliquots en vermenigvuldigen met de totale verdunningsfactor x 2 (slechts de helft van de hersenen werd een lysaat) het schatten van het totale aantal cysten per brein.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Toxoplasma gondii repliceert vrij in naïeve macrofagen en een verdubbelingstijd tussen 6-12 uur afhankelijk van de stam van de parasiet. Figuur 1 toont representatieve parasieten in naïeve versus geactiveerde beenmerg afgeleide macrofagen. Figuur 2 toont de algemene morfologie van parasieten in HFF gastheercellen aan 2, 4, 8, 16 en 32 parasieten / PV. In het huidige protocol, wordt de parasiet mag naïef macrofagen binnen te vallen en stellen een ontluikende parasitophorous vacu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De beschreven protocol verschaft een onbevooroordeelde benadering dat activatie van muizen beenmerg afgeleide macrofagen en forward genetics isoleren T. gebruikt gondii mutanten met een defect in hun vermogen om activering van geïnfecteerde macrofagen overleven. Het fenotype van de mutanten volgende macrofaag activatie valt gewoonlijk in een van twee categorieën: 1) De parasieten verschijnen intact maar niet repliceren dan 1 parasiet per PV; 2) De parasieten verschijnen afgebroken en kan in ruime, amor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Bijzondere dank aan Dr. Peter Bradley voor het antilichaam om de T. gondii mitochondriën te detecteren. Het werk werd ondersteund door de National Institute of Health Grants AI072028 en AI107431 aan D.G.M en een genereuze donatie aan New York Medical College voor de studie van tropische geneeskunde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMHycloneSH3008101https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBSThermoSH3091003https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBSThermoSH3002802 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamineThermoSH3003401 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strepThermoSV30010 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSSThermoSH3003002https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPSLIST biologicals201http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γPepro Tech Inc50-813-664https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slidesThermo177402https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical platesThermo165306https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture platesFisher353072https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25Fisher156367https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%

Referenties

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483(2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589(2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236(2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14(2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784(2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091(2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354(2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180(2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807(2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966(2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348(2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225(2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358(2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927(2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Forward genetische screeningmacrofaagactivatieparasietmutantenIFN gamma resistentieparasitofore vacuoleparasietstasisparasietdegradatiechronische infectie

Gerelateerde artikelen