Een Hydrogel Construct en fibrine-gebaseerde lijm Aanpak Therapeutics leveren in een Murine myocardinfarct Model.

Samenvatting

Dit protocol heeft tot doel de beperking van slechte celaanplanting voor stamcelbehandeling van hartinfarcten te verlichten door het gebruik van een hydrogelsysteem en een op fibrine gebaseerde lijm. Met deze aanpak kan contact tussen cel en weefsel na het infarct worden gehandhaafd, waardoor het therapeutische potentieel van heilzame agentia op de plaats van de blessure wordt vergroot.

Samenvatting

Het muismodel voor MI wordt algemeen erkend op het gebied van hart- en vaatziekten en is consequent gebruikt als eerste stap om de werkzaamheid van behandelingen in vivo¹ te testen. Het traditionele, gevestigde protocol is verder verfijnd om de schade aan het dier te minimaliseren. Opmerkelijk is dat de pectorale spierlagen worden losgemaakt in plaats van ze eenvoudigweg door te snijden, en dat de thoracotomie intercostaal wordt benaderd in plaats van de ribben te breken bij een sternotomie, waardoor de integriteit van het ribbenkast wordt behouden. Met deze wijzigingen wordt de algehele stress op het dier verminderd.

Stamceltherapieën die bedoeld zijn om de schade veroorzaakt door MI's te verlichten, hebben door de jaren heen belofte getoond vanwege hun pro-angiogene en anti-apoptotische voordelen. Huidige benaderingen om cellen naar het hartoppervlak te brengen, omvatten doorgaans de injectie van de cellen dicht bij de beschadigde plaats, binnen een coronaire slagader of in de perifere bloedbaan^2-4. Hoewel de cellen zich hebben bewezen om naar het beschadigde myocardium te migreren, is de functionaliteit beperkt door hun slechte aanplanting op de plaats van verwonding, wat resulteert in diffusie in de bloedbaan⁵. Dit manuscript beschrijft een procedure die dit obstakel overwint met het gebruik van een cel-ingekapselde hydrogel-patch. De patch wordt vóór de chirurgische procedure vervaardigd en direct na de occlusie van de linker kransslagader op het beschadigde myocardium geplaatst. Om de patch op zijn plaats te hechten, wordt biocompatibel extern fibrinekleefstof direct bovenop de patch aangebracht, waardoor het zowel aan de patch als aan het hartoppervlak kan drogen. Deze aanpak biedt een nieuwe hechtingsmethode voor de toepassing van een delicaat cel-inkapseld therapeutisch construct.

Inleiding

Een myocardiaal infarct (MI) wordt gedefinieerd als de onderbreking van bloed aan een gebied van het hart veroorzaakt door occlusie van een grote kransslagader. De schade die voortvloeit uit een MI komt door de herinrichting van de levensvatbare hartweefsel in niet-functioneel littekenweefsel, die het vermogen van het hart of, specifieker, de linker ventrikel, goed slaan afneemt. Dit resulteert in een afname in de hoeveelheid bloed die kan worden afgegeven aan het lichaam met elke hartslag, bekend als het slagvolume en het percentage bloed dat uit het hart wordt gepompt bij elke hartslag, zogenaamde ejectiefractie ^6. Deze, samen met andere verminderde functies, verhoogt de spanning op de rest van het hart om voldoende blijft werken. Vaak kan deze verhoogde druk zo ernstig worden dat het een tweede hartaanval, een verschijnsel waargenomen bij ongeveer 10% van individuen ⁷ veroorzaakt.

Terwijl de medische praktijken hebben ontwikkeld om te behandelende onmiddellijke nasleep van een MI, is er geen techniek ontwikkeld om te stoppen, vertragen of omkeren van de negatieve bijwerkingen van het weefsel remodeling. Stamceltherapieën hebben zich ontwikkeld tot een mogelijke weg voor een dergelijke behandeling, maar ondanks hun veelbelovend potentieel stamcellen niet succesvol gebleken in de klinische setting. Eén theorie voor hun tekortkomingen is het onvermogen te zorgen voor de gunstige cellen blijven op de plaats van infarct lang genoeg om gunstige resultaten ⁵ genereren. Het is aangetoond dat niet meer dan 24% van de cellen die alleen worden geïnjecteerd in de plaats van infarct overleefd en bleef op het aangetaste locatie 1 dag na de oplevering ^2. Een mogelijke opsporing van deze kwestie retentie cel biocompatibele hydrogel systemen die cellen of geneesmiddelen, die de beschadigde locatie kan worden afgeleverd kapselen ontwikkelen. De hydrogel keuze in dit protocol is een poly (ethyleenglycol) dimethacrylaat vanwege de eerder gebruik in celinkapselende procedures echter een hydrogel staat inkapseling worden toegepast ^8. De afgifte van de pleister direct aan de plaats van letsel zorgt cel-weefselcontact over een langere tijdsperiode, waardoor de duur van de cellen kan gunstig factoren verlenen aan de onderliggende myocardium.

Een knelpunt de patch aanpak is de moeilijkheid van het hechten van de pleister op het hart oppervlak. Veel groepen hebben dit ondervangen door een verscheidenheid van technieken, de meest voorkomende zijn een eenvoudige hechting aan de constructie te koppelen aan het hart oppervlak ^9,10. Dit is succesvol in een aantal gevallen waarin het construct wordt gemaakt van een stijver materiaal bewezen, maar ontbreekt wanneer geprobeerd op een hydrogel systeem, vanwege de hoge waterconcentratie en delicate aard van de pleister construct. Om dit te voorkomen, hebben we een fibrinelijm externe lijmsysteem dat de chemie van stolselvorming nabootst gebruikt. Fibrinelijm is gebruikt in talrijke medische operaties, Inc.Luding dura tranen, bronchiale fistels, en hoornvliestransplantatie, aandacht voor de biocompatibiliteit van het product als een wond kit ^11-13. Daarnaast is fibrine gebruikt voor verschillende cardiale doeleinden, waaronder operatieve behandeling van linker ventrikel breuken en coronaire bypassoperaties is echter het gebruik als een adhesie lijm voor een cardiale patch gebruikelijke ^14-17. Een eenvoudige formulering van trombine en fibrinogeen resulteren in een biocompatibele lijm die direct aan de buitenzijde van een externe cardiale pleister kan worden aangebracht, die een levensvatbaar hechting systeem patch hart interactie garanderen.

Protocol

Procedure is volledig compatibel met IACUC protocol nummer 13302 en is van de deling van dierlijke bronnen goedgekeurd.

1. Instrument Voorbereiding

1. Autoclaaf alle niet-instrumentatie vóór gebruikt om de chirurgische procedure om steriliteit te waarborgen.
2. Steriliseren van instrumenten die worden gebruikt meerdere keren in een sessie met een glazen kraal sterilisator tussen toepassingen.

2. Hydrogel Voorbereiding

1. Ontdooi en plaat stamcellen ten minste 24 uur voorafgaand aan de totstandkoming van de hydrogel construct.
2. Bereid pleisters één dag voorafgaand aan de chirurgische procedure onder toepassing van een inrichting voor stereolithografie (of gelijkwaardig instrument) die in detail is beschreven in eerdere publicaties ^8,18.
3. Om de hydrogel te maken, eerst een computer-aided design (CAD) model van de gewenste patch te genereren en exporteren van het ontwerp aan stereolithografische formaat (STL).
4. Maak een pre-gel oplossing dissolving poly (ethyleen glycol) dimethacrylaat (PEGDMA) in steriele 1 x PBS tot een 20% w / v oplossing te verkrijgen. Tegelijkertijd Los de fotoinitiator 1- [4- (2-hydroxy- ethoxy) -fenyl] -2-hydroxy-2-methyl-1-propaan-1-on in DMSO. Voeg de fotoinitiator aan de PEGDMA oplossing bij een uiteindelijke w / v van 0,5%. Direct voor de crosslinking, voeg 100 ml van het gewenste dichtheid van de cellen. Opmerking: Een cel dichtheid tussen 2,0 x 10 ⁵ -2,0 x 10 ⁶ cellen / ml wordt aanbevolen.
5. Pipetteer de pre-geloplossing in een schaal in het midden van de SLA platform en voer de SLA software met de eerder geladen STL opmaak ontwerp.
6. Verwijder de patches van de inrichting en incubeer de hydrogels O / N in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine om voor cellen te passen het milieu in de pleister.

3. Animal Voorbereiding en Oral intubatiop

1. Evalueer elke muis voorafgaande aan teneinde ervoor te zorgen dat het dier in goede gezondheid, zoals bepaald uit de verzorging gewoontes en interacties met hun kooi mates. Opmerking: Vrouwelijke 8-10 weken oude C57BL / 6J-muizen werden voor deze procedure echter een muis leeftijd of type kan worden gebruikt.
2. Plaats de dieren in een verdoving kamer en bloot te stellen aan 5% isofluorane met een 1 L / min O ₂ ondersteuning. Toezicht op het niveau van de anesthesie door teen knijpen reflex.
3. Zodra het dier goed is verdoofd, wegen en plaats ze op de intubatie stand.
4. Direct een lichtbron richting borstholte van het dier en een tang om de larynx oppervlak trekken en bloot de stembanden. Leid een 20 G angiocath tussen de stembanden, en soepel in te voegen in de luchtpijp. Detect juiste aanbrengen door een mechanische beweging van de borstholte nadat de katheter is verbonden met het kleine dier ventilator.
5. Pas ventilatie instellingen aan The gewicht van het dier op basis van de richtlijnen van de fabrikant.
6. Eenmaal geïntubeerd, plaats het dier in rugligging op een verwarmingselement om onderkoeling te voorkomen. Zorg ervoor dat de verwarming pad niet meer dan 40 ° C. Indien nodig, plaats een barrière tussen het dier en de verwarming pad om de kans op brandwonden te minimaliseren.
7. Haal haar van de operatieplaats door het gebruik van een ontharingscrème. Steriliseer de site met 3 afwisselende scrubs van betadine en 75% ethanol om een ​​goede sterilisatie te verzekeren. Plaats een laken om alleen de operatieplaats bloot en plaats vet zalf op de ogen tot droog tijdens de procedure te voorkomen.

4. Chirurgische Procedure

1. De thoracotomie wordt uitgevoerd op de linkerzijde van het dier, dus maakt een incisie van ongeveer 1 cm links van het sternum, dat de lengte van het borstbeen loopt.
2. Een tang om de spierlaag te scheiden van de onderliggende ribbenkast in twee stappen. Observeer een DelineAting lijn die de grote borstspier spieren van het dier vertegenwoordigt. Til deze spier lichtjes, scheiden van de onderliggende externe schuine spier en trek mediaal. Vervolgens, vrij de externe schuine spier van de onderliggende ribbenkast op dezelfde wijze en intrekken lateraal, waardoor een vrij uitzicht op de tweede, derde en vierde ribben.
3. Voer de thoracotomie tussen de derde en vierde ribben. Til de vierde rib en gebruik een cauterizer de borstholte tussen de derde en vierde rib openen. Plaats retractors naar de holte verder te openen en het hart bloot te leggen.
4. Gebruik een tang om de dunne hartzakje van het hart te scheuren.
5. Afbinden de linker kransslagader met een 8-0 monofilament nylon hechtdraad. Plaats de hechtdraad ongeveer 4 mm van de apex van het hart, direct onder het onderste uiteinde van het linker atrium. Bepaal de juiste plaatsing hechtdraad door blancheren van het ventriculaire myocardium en een toename in de grootte van het linker atrium na Suture is gebonden.

5. Patch Plaatsing en Lijm

1. Houd pleisters bij 37 ° C en 5% CO ₂ voorwaarden tot gebruik.
2. Til de patch met een plat uiteinde spatel en plaats voorzichtig het op het oppervlak van het hart, op de plaats van infarct.
   Opmerking: Om afglijden van de linker hartkamer te voorkomen, kan de pleister op zijn plaats worden gehouden door licht contact te onderhouden met behulp van de spatel of de punt van een pincet.
3. Bereid de lijm door het mengen van een 4: 1 verhouding van fibrinogeen trombine. Meng de oplossing door herhaaldelijk pipetteren totdat het dikker wordt, wordt binnen 1 minuut na het begin van het preparaat.
4. Zodra de oplossingsviscositeit het gewenste niveau bereikt, snel ongeveer 10 ml dragen aan de patch oppervlak. Opmerking: de stollingstijd van de fibrine lijm is een snelle, die een kleine kans voor efficiënte overdracht van de lijm.

6. Hechten

1. Voer alle sluiten hechtingen met een 6-0 monofilament nylon hechtdraad.
2. Sluit de rib laag met 3-4 afzonderlijke onderbroken hechtingen.
3. Voor de volledige sluiting van de intercostale laag, plaatst u een PE-10 canule in de incisie aan de borstholte te evacueren na de afsluiting is voltooid en te herstellen juiste intrapleurale druk.
4. Sluit de borstspieren met 3-4 individuele onderbroken hechtingen.
5. Seal de huidlaag met een continue hechting.
6. Na volledige sluiting, bevestig een injectiespuit 1,0 ml aan het einde van de canule en gebruiken om de borstholte te evacueren.
7. Breng een weefsellijm de incisieplaats op de hechting plaats te versterken.

7. Post-operatieve behandeling

1. Geef muizen een injectie van buprenorfine (0,05-1,0 mg / kg) en carprofen (2,2 mg / kg) subcutaan onmiddellijk na de coronaire ligatie en minstens 20 min voor opwekking. Dien beide geneesmiddelen 6-8 uur na de operatie, En dan tweemaal daags te geven voor maximaal drie dagen om pijn en angst te beheersen.
2. Continu toezicht houden op de dieren tot bewuste en elk uur voor de eerste 4 uur na de operatie. Voer een tweede controle in de nacht van de operatie (2-4 uur later) naar een tweede dosis pijnstiller toedienen.
3. Dagelijks toezicht op de dieren na de tweede dag na de procedure, totdat dieren stabiel lijken.

8. Analyse van de hartfunctie en Histologie

1. Voer echocardiogrammen op de muizen 4 weken na de procedure voor het bepalen van de omvang van de schade na de MI.
2. Verdoven muizen met 4-5% isofluraan in een anesthesie kamer voor de inductie van inhalatie-anesthesie, en vervolgens 2% isofluraan via gezichtsmasker voor het onderhoud anesthesie.
3. Wis het imaging gebied met een ontharingscrème en gebruik een klein dier echografie om een ​​2D M-mode echocardiografie scan van het kloppende hart te verkrijgen en noteer de functionele parameters associated ermee.
4. Euthanaseren de muizen in een kamer kooldioxide, verzamel de harten van de dieren en in een 10% formaline-oplossing gedurende 24 uur. Na 24 uur en spoel de harten tot 70% ethanol en bewaren bij 4 ° C totdat weefselverwerking.
5. Verwerk de harten en insluiten ze in paraffine blokken.
6. Snij 5 mm doorsneden het ventriculaire gebied van het hart, te beginnen bij de top en eindigt op het atrium.
7. Stain doorsnede plakjes met beide Masson's trichroom en hematoxyline en eosine kleuring met behulp van standaard protocollen.

Resultaten

Gedurende de chirurgische procedure, kan ligatie van de linker kransslagader worden geïdentificeerd door een gemarkeerd blancheren stroomafwaarts van de afgesloten arterie. Als een test voor het binden van de knoop, kan de hechting kort worden aangescherpt om te controleren of het op de juiste plaats. Bovendien, aangezien occlusie van de slagader leidt bijna onmiddellijke vermindering van het vermogen van het linker atrium goed slaan, wordt het linker atrium te vergroten in reactie op een terugstroom van bloed in het sy...

Discussie

Met deze benadering van het murine model MI, hebben we een systeem dat de schade aan niet-myocardium gebieden die zijn geassocieerd met andere murine MI technieken minimaliseert ontwikkeld. Deze gebieden omvatten schade door een tracheostoma, het snijden van de spierlaag en het breken van ribben de borstholte bloot te leggen. Wij geloven dat deze veranderingen de algehele operatie resultaat dankzij de zorgvuldigheid om zoveel mogelijk van grote structuren, waaronde...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Harvard Model 687 Muisventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Droge Glaskralen Sterilisator	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 chirurgisch microscoop	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Fijne Pincetten - 0,4 mm Gebogen Tips	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor - 3,5 cm Breed	Fine Science Tools	17005-04
Verenschaar - 2,5 mm Rechte Blad	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Naaldhouder - met vergrendeling Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Irisschaar - Fijne Recht 10,5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament naald	Ethicon	8730P
6-0 Zijde naald	Ethicon	639G
Trombine	Sigma	T7009
Fibrinogeen	Sigma	F3879
Vetbond Weefsel Adhesief	3M	1469SB