Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en

14.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52564

⸱

8 april 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol om efficiënt huidresidente T-cellen te isoleren uit humane huidbiopsieën. Dit protocol levert voldoende aantallen vitale humane huidresidente lymfocyten op voor flowcytometrische analyse en ex vivo kweek.

Samenvatting

Menselijke huid een belangrijke barrière functie en bevat diverse immuuncellen die bijdragen aan weefsel homeostase en bescherming tegen pathogenen. Aangezien de huid is relatief gemakkelijk te bereiken, biedt een ideaal platform perifere immuun regulerende mechanismen te bestuderen. Immune resident cellen in gezonde huid gedrag immunosurveillance, maar spelen ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van inflammatoire huidaandoeningen, zoals psoriasis. Ondanks nieuwe inzichten, is ons begrip van de biologie onderliggende verschillende inflammatoire huidaandoeningen nog beperkt. Er is behoefte aan goede kwaliteit (interne) celpopulaties geïsoleerd uit biopsie huidmonsters. Tot dusver isolatieprocedures zijn ernstig gehinderd door het ontbreken van het verkrijgen van een voldoende aantal levensvatbare cellen. Isolatie en daaropvolgende analyse zijn ook beïnvloed door het verlies van immune cellijn markers, vanwege de mechanische en chemische stress veroorzaakt door de huidige dissociatie procedures ter verkrijgingenkele celsuspensie. Hier beschrijven we een gemodificeerde methode om T-cellen van zowel gezonde en betrokken psoriatische menselijke huid isoleren combineren mechanische dissociatie huid behulp van een geautomatiseerde weefsel dissociator en collagenase behandeling. Deze methode behoudt expressie van de meeste immune lineage markers zoals CD4, CD8, CD 11 c Foxp3 en op de bereiding van enkelvoudige celsuspensies. Voorbeelden van succesvolle CD4 + T cel isolatie en vervolgens fenotypische en functionele analyse getoond.

Inleiding

De huid, als de primaire interface tussen het lichaam en het milieu, biedt de eerste verdedigingslinie tegen externe fysische, chemische en biologische beledigingen zoals verwonding, ultraviolette straling en micro-organismen. Huid bestaat uit twee grote compartimenten, de epidermis en de dermis, en bevat een verscheidenheid van immuuncellen zoals Langerhans cellen, macrofagen, dendritische cellen (DC's), en ongeveer 20 miljard memory T-cellen bijna tweemaal zoveel in de totale bloedvolume 1 , 2. Een groeiende hoeveelheid gegevens ondersteunen het idee dat de huid essentiële immunologische functies, zowel tijdens weefsel homeostase en in verschillende pathologische aandoeningen. Immuuncellen in normale huid verblijfplaats wordt gedacht dat immunosurveillance 3 voeren en hebben aangetoond dat het een rol in de ontwikkeling van ontstekingsaandoeningen zoals psoriasis 4 spelen. In psoriatische letselhuid, zowel CD4 + als CD8 + T cellen geïnfiltreerd observed en werd aangetoond dat de verhouding van de CD4 en CD8 varieert afhankelijk van de ziektestatus 5. Echter, deze celpopulaties zijn moeilijk te bestuderen omdat de bestaande technieken maken het isoleren van slechts enkele cellen.

De momenteel op grote schaal gebruikt technieken voor het T-cel isolatie van de menselijke huid te combineren mechanische huid dissociatie met enzymatische behandeling. De menselijke huid biopten worden uitgebreid gehakt en geïncubeerd met enzymen zoals trypsine, collagenase en / of EDTA 6-8. Aangezien de huid een barrière weefsel dat zeer resistent is tegen trekkrachten en mechanische disaggregatie de gevestigde werkwijzen van T cel isolatie geproduceerd zeer weinig cellen, en zelfs lagere aantallen van levensvatbare cellen, die ex vivo celkweek maakt van deze celpopulaties moeilijk en uitdagend.

Hier melden wij een aangepaste methode om lymfocyten van zowel gezonde en betrokken psoriatische menselijke huid te isoleren door het combineren van mechansche dissociatie van de huid met behulp van een geautomatiseerde weefsel dissociator plaats van de gevestigde werkwijze van extensief hakken, met behulp van enzymatische digestie collagenase. Verschillende levensvatbare immuuncelsubklassen zoals DC en T-cellen werden na de bereiding van een enkele-celsuspensie. Vooral de expressie van de oppervlaktemarkers CD3, CD4 en CD8 was goed geconserveerd. Aldus bereide cellen, klaar voor gebruik in ex vivo celkweken of flowcytometrische analyse. Dit protocol is met succes toegepast voor de analyse van afzonderlijke huidbiopsies (4 mm) afkomstig van letselhuid van psoriasis. De resultaten toonden aan dat de huid inwoner patiënt T-cellen geproduceerd meer inflammatoire cytokines, zoals IL-17 en IFNy in vergelijking met gezonde vrijwilligers 9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Huid biopten van gezonde individuen werden verkregen uit buikhuid overgebleven van individuen die een electieve plastische chirurgie na mondelinge of schriftelijke informed consent voor wetenschappelijk gebruik. Het gebruik van menselijke huid werd goedgekeurd en in overeenstemming met de door de Medisch Ethische commissies ingesteld voor menselijke onderzoek van het medisch centrum Radboud Universiteit, Nijmegen, Nederland en Universiteit van Essen, Duitsland regelgeving.

1. Bereiding van suspensies van afzonderlijke cellen van menselijke huid (Werk Steriel in een flow-kast als Latere Cell Cultuur is vereist)

  1. Bereid celkweekmedium: RPMI 1640 + penicilline / streptomycine (eindconcentraties 100 eenheden / ml en 100 ug / ml) + pyruvaat (0,02 mM) en glutamax (0,02 mM), zonder serum toegevoegd.
  2. Bereid compleet kweekmedium: kweekmedium bereid in stap 1,1 + 10% humaan serum gepoolde (HPS); bewaren bij 4 ° C. Breng medium tot 20 ° C ± 2 voor onsing.
  3. Het verkrijgen van de huid biopsie met behulp van een 4mm round biopsie punch instrument en bewaar het in RPMI1640 compleet kweekmedium bij 20 ° C ± 2 tot 4 uur of bij 4 ° C ON. Verwerk de biopsie zo snel mogelijk na aankomst in het laboratorium.
    LET OP: Langere opslag van huid zal invloed hebben op de cel opbrengst en levensvatbaarheid van de cellen.
  4. Label een blauw-capped dissociatie buis en voeg 5 ml compleet kweekmedium in de gemerkte buis.
  5. Voeg 2 ml compleet kweekmedium in elk putje (in totaal 3 wells) van een steriele 6-well cultuur plaat. Gebruik steriele instrumenten om de biopsie te plaatsen in een enkele, goed afspoelen, verplaatsen naar een tweede put en herhaal deze stap nog een keer, dus een totaal van drie spoelingen bereiken.
  6. Breng de goed gespoeld huidbiopsie een steriele petrischaal, voeg 100 ul compleet cultuurmedium bovenop biopsie en voorzichtig afschrapen het onderhuidse vetweefsel via een roestvrij stalen wegwerp steriel scalpel.
    LET OP: This is een cruciale stap.
  7. Snijd elke huidbiopsie in 4 kleinere stukken op een steriele petrischaal. Doorvoermonsters (maximaal vier van 4 mm biopsies per buis) aan de bereide dissociatie buis met 5 ml compleet cultuurmedium.
  8. Nauw sluit de buizen met de dop en bevestig ondersteboven aan de mouw van de geautomatiseerde weefsel dissociator. Zorg ervoor dat alle monstermateriaal is gelegen in het gebied van de rotor.
  9. Start het dissociatieproces door uitvoering van de "programma m_spleen _01" (een vooraf bepaald programma door het interne geheugen van het instrument of de begeleiding programmeerkaart) aan de biopsie dissociëren op het geschikte rotatiesnelheid voor 56 sec.
  10. Na de verwerking, maak de dissociatie buis uit het dissociator en zorg ervoor dat al het gedissocieerde materiaal wordt verzameld op de bodem van de buis.
  11. Voeg 150 ul collagenase IA (80 mg / ml) in de dissociatie buis en incubeer het monster in een schuddend waterbad bij 37° C gedurende 60 minuten. Voeg 100 ul van DNase I (5 ME / ml) in thedissociation buis, meng goed.
    LET OP: hogere concentratie van collagenase of langere incubatietijd zal levensvatbaarheid van de cellen te veranderen.
  12. Bevestig de dissociatie buis aan de mouw van de geautomatiseerde weefsel dissociator en start het programma "m_ milt _01" om de biopsie distantiëren nog een keer.
  13. Plaats een 70 uM nylon cel zeef bovenop een 50 ml Falcon buis. Solliciteer gedissocieerde monster materialen om deze cel zeef naar cel klonten / weefsel vuil te verwijderen.
  14. Was cel zeef eenmaal met 5 ml compleet cultuurmedium. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 xg gedurende 10 min en zuig supernatant.
  15. Herhaal de wasstap nog een keer. Resuspendeer celpellets in 300 ul compleet cultuurmedium. Single-celsuspensies zijn klaar voor verdere analyse; verder met protocollen voor ex vivo celkweek of flowcytometrie analyse.
  16. Bij verdere intracellular cytokine kleuring, stimuleren cellen met PMA (12,5 ng / ml), Ionomycine (500 ng / ml) en Brefeldine A (5 ug / ml) gedurende 4 uur bij 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 4 uur voordat stroming cytometrie analyse.

2. Polyklonale Activering van Skin-Resident T-cellen (Ex Vivo Cultuur van de Cel)

  1. Aliquot 100 pi eencellige suspensies (bereid in stap 1,15) in een rond-bodem 96-well plaat.
    Opmerking: Voor elk van 4 mm huidbiopsie, kan de verkregen enkelvoudige celsuspensies worden gesplitst in ten minste twee putjes van een 96-wells plaat.
  2. Add anti-CD3 / anti-CD28 mAb-beklede microkorrels (parels 25.000 per putje), recombinant humaan cytokine rIL-2 (eindconcentratie 25 U / ml) en rIL-1β (eindconcentratie 50 ng / ml).
  3. Bedek de cultuur plaat met een goed gelabelde plaat deksel, incubeer in 5% CO 2, 100% vochtigheid, 37 ° C incubator. Verander medium wanneer het medium kleur verandert in geel.
    LET OP: A clear cell kolonie kan worden waargenomen vanaf de eerste dag 8 van celkweek.

3. Flowcytometrie Analyse van de Primary / gekweekte huid-resident T-cellen

  1. Bereid FACS buffer: PBS + 0,2% BSA.
  2. Transfer cellen van belang in een v-bodem 96-well plaat. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
  3. Resuspendeer de pellet in 100 pl PBS. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
  4. Vlek cellen met 100 pi bereid eFluorescence780 geconjugeerd fixeerbaar levensvatbaarheid kleurstof (1: 1000 verdunning gebruikt PBS) bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 100 gl FACS buffer, centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
  5. Gewenste celoppervlaktemarker mAbs, bijvoorbeeld: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 01:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), en cd1c-APC (AD5-8E7, 1:10), de voorbereiding van de mAbs-mengsel met behulp van FACS-buffer op basis van elke mAb verdunningsfactor getest. gate instellingen met behulp van isotype controle antilichaam samen met niet-vlek sample te definiëren.
  6. Voeg 25 ul van bereide mAbs-mengsel in elk putje. Incubeer 20 min bij 20 ° C ± 2, bescherming tegen licht.
  7. Voeg 100 gl FACS buffer, centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
  8. Voor monsters die alleen celoppervlak kleuring vereisen, verder met stap 3.16.
  9. In het geval van intra-cellulaire Foxp3 kleuring:
    1. Bereid fixatie en permeabilisatie buffer door het mengen van één deel concentraat met 3 delen van oplosmiddelen.
    2. Bereid 1x permeabilisatie buffer: 1 deel 10x permeabilisatie buffer + 9 delen gesteriliseerd H 2 O.
  10. Resuspendeer pellets in 100 ul van fixatie en permeabilinisatie buffer, meng goed, en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
  11. Voeg 100 ul permeabilisatie buffer aan elk putje centrifugeer bij 450 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, en zuig supernatant.
  12. Was de cellen met permeabilisatie buffer nog een keer.
  13. Selecteer gewenste intracellulaire mAbs bijvoorbeeld Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) en IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Bereid de mAbs mengsel met behulp van permeabilisatie buffer die 2% normale rat serum op basis van elke mAb verdunningsfactor getest. gate instellingen met behulp van isotype controle antilichaam samen met niet-vlek sample te definiëren.
  14. Voeg 20 ul van mAb-bereide mengsel in elk putje. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min, bescherming tegen licht.
  15. Na 30 minuten incubatie, voeg 100 ul van permeabilisatie buffer in elk putje. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
  16. Was de cellen met permeabilisatie buffer nog een keer. Resuspendeer pellet in 110 ui FACS buffer, en de overdracht celsuspensies in microFACS buis.
    LET OP: De steekproef is klaar voor de meting met behulp van 10-kleuren flowcytometrie.
  17. Bij exacte aantal cellen nodig, voeg 10 ul goed gemengd uniforme suspensie van FluoroSpheres in elk monster onmiddellijk voordat metingen met behulp van flowcytometrie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het protocol hier gepresenteerde zal opleveren tussen 2200 ± 615 (gemiddelde ± SEM, huid van gezonde vrijwilligers) tot 178.000 ± 760 (gemiddelde ± SEM, letselhuid van psoriasis patiënten) levensvatbare lymfocyten van menselijke huid bij het gebruik van een enkele 4 mm huid biopsie.

Verschillende typen CD45 + cellen werden in enkel-celsuspensies afgeleid van huid van gezonde personen, waaronder CD4 + T-cellen (~ 45%), CD8 + T-cellen (~ 30%) en CD11c +

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier presenteren we een protocol om de huid aanwezige T-cellen uit menselijke huid biopten efficiënt isoleren. Het voordeel van dit protocol is de isolatie van relatief grote aantallen levensvatbare lymfocyten en expressie relevant oppervlaktemerkers. De cel subsets geïdentificeerd waren: CD 11 c + DCs, CD4 + en CD8 + T-cellen en CD25 + Foxp3 + cellen. Belangrijk is dat ex vivo cultuur van geïsoleerde huid resident T-cellen was zeer goed haalbaar en liet vo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Huid biopten van psoriasis patiënten werden vriendelijk verschaft door Dr. Andreas Koerber (afdeling Dermatologie aan de Universiteit van Essen, Duitsland) na mondeling dan wel schriftelijk toestemming voor wetenschappelijk gebruik.

XH wordt ook ondersteund door NSFC 61263039 en NSFC 11.101.321.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Disposable Biopsy PunchKai EuropeBP-40F4 mm
Disposable sterile scalpelsDalhausen1100000510
gentleMACS C tubeMiltenyi Biotech130-093-237Blauw afgesloten, gebruikt als de dissociatiebuis.
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotech130-093-235Geautomatiseerde weefseldissociator. Gebruik het "programma spleen_01" voor het dissociëren van de huidbiopsie.
Cell strainer BD35235070 µm nylon
96-well U-bottom plateGreiner Bio-One650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
Sodium pyruvateLife Technologies11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140-122
Human Pooled Serum (HPS)in house prepared
Collagenase ISigma-AldrichC2674Type 1-A, geschikt voor celcultuur
DNase ICalbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780eBioscience65-0865-18Kleur dode cellen voorafgaand aan celfixatie; verdunnen met PBS op 1:1.000
Fixation/Permeabilization ConcentrateeBioscience00-5123-43
Fixation/Permeabilization DiluenteBioscience00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x)eBioscience00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45BD563879Clone: HI30; verdunningsfactor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14DakoT0844Clone: TUK4; verdunningsfactor 1:50
PE Mouse anti-human CD56DakoR7127Clone: MOC-1; verdunningsfactor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3Beckman - CoulterA07748Clone: UCHT1; verdunningsfactor 1:50 voor oppervlaktekleuring; verdunningsfactor 1:25 voor intracellulaire kleuring.
PC5.5 Mouse anti-human CD4Beckman - CoulterB16491Clone: 13B8.2; verdunningsfactor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11cBeckman - CoulterA80249Clone: BU15; verdunningsfactor 1:50
APC Mouse anti-human CD1cMiltenyi Biotech130-090-903Clone: AD5-8E7; verdunningsfactor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8Beckman - CoulterA66332Clone: B9.11; verdunningsfactor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19Beckman - CoulterA94681Clone: J3-119; verdunningsfactor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25eBioscienceAD5-8E7Clone: BC96; verdunningsfactor 1:50
 PE Rat anti-human CLAMiltenyi Biotech130-091-635clone: HECA-452; verdunningsfactor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3eBIoscience48-4776-42Clone: PCH101; intracellulaire kleuring; verdunningsfactor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17AeBioscience53-7179-42Clone: eBio64DEC17; intracellulaire kleuring; verdunningsfactor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNgeBioscience25-7319-41Clone: 4S.B3; intracellulaire kleuring; verdunningsfactor 1:400
Flow-Count FluorospheresBeckman - Coulter7547053Tellingkralen, voor flowcytometrie

Referenties

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

HuidbiopsieweefseldissociatiecollagenasebehandelingflowcytometriecelzeefcentrifugatieFACS analyseex vivo kweekimmuuncelmarkers
Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.