Het doel van dit protocol is om een driedimensionaal huidequivalent van volledige dikte op te bouwen, dat lijkt op natuurlijke huid. Met een speciaal geconstrueerd geautomatiseerd wondapparaat kunnen nauwkeurige en reproduceerbare wonden worden gegenereerd onder behoud van steriliteit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In vitro modellen zijn een kosteneffectieve en ethische alternatief om cutane wondgenezingsprocessen te bestuderen. Bovendien, door het gebruik van menselijke cellen, reflecteren deze modellen de menselijke wondsituatie beter dan diermodellen. Hoewel twee-dimensionale modellen wijd gebruikt worden om processen zoals cellulaire migratie en proliferatie te onderzoeken, zijn meer complexe modellen vereist om een diepere kennis over wondgenezing te verkrijgen. Naast een geschikt modelsysteem, is het genereren van nauwkeurige en reproduceerbare wonden cruciaal om vergelijkbare resultaten te garanderen tussen verschillende testruns. In deze studie wordt de generatie van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent gedemonstreerd om wondgenezing te bestuderen. Het dermale deel van de modellen bestaat uit humane dermale fibroblasten ingebed in een rat-staart collageen type I hydrogel. Na inoculatie met humane epidermale keratinocyten en daaropvolgende cultivering aan het lucht-vloeistof-interface, wordt een meerlagige epidermis gevormd bovenop de modellen. Om het wondgenezingsproces te bestuderen, hebben we bovendien een geautomatiseerd wondapparat ontwikkeld, dat gestandaardiseerde wonden genereert in een steriele atmosfeer.
Inleiding
De huid is het grootste orgaan van het lichaam. Het creëert een barrière tussen de externe omgeving en de interne organen. Bovendien is de huid beschermt het lichaam tegen vochtverlies, milieu-invloeden, verwondingen en infecties en helpt om de lichaamstemperatuur 1 reguleren. Door zijn open ligging, wordt de huid vaak beïnvloed door mechanische, thermische of chemische trauma. Hoewel de huid is over het algemeen in staat zichzelf te repareren, kan meerdere lokale factoren zoals infectie, zuurstof, en veneuze toereikendheid leiden tot verstoorde wondgenezing. Wondgenezing kan worden gestoord door systemische factoren zoals obesitas, alcoholisme, roken, med....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Het protocol is ontworpen voor de productie van 24 volledige dikte huid equivalenten. Humane dermale fibroblasten en epidermale keratinocyten werden geïsoleerd uit huidbiopsies volgens een eerder gepubliceerde protocol. 21,22 Informed consent werd vooraf verkregen en de studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische commissie op de menselijke onderzoek van het Julius-Maximilians-Universität Würzburg (182 stemmen / 10).
1. De productie van Dermal Component
- Los collageen met 0,1% azijnzuur tot een eindconcentratie van 6 mg / ml. Voor de gel neutralisatieoplossing, meng 232,5 2x ml DMEM, 7,5 ml foeta....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De geïsoleerde HDF en HEK verschillen zowel in morfologie en in de expressie van de typische markers. De HDF toonde typische spindel-vormige morfologie, terwijl de morfologie van Hek kan worden beschreven door een geplaveide morfologie. De cellen werden gekarakteriseerd door immunohistochemische kleuring (figuur 1) alvorens ze voor FTSE. De HDF zijn positief voor vimentine (figuur 1A), een marker voor fibroblasten. Primaire HEK zeer uiten vroege differentiatie eiwit cytokeratine-14
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In vitro cellen gewoonlijk uitgebreid tweedimensionale celculturen, waarbij cellen hechten aan kunststof oppervlakken. Echter, deze kweekomstandigheden niet de fysiologische driedimensionale omstandigheden waarbij cellen groeien in vivo. Onder driedimensionale omstandigheden kunnen cellen natuurlijke cel-cel en cel-matrix aanhangsels samen en migreren in drie dimensies. Vooral in de cutane wondgenezing de gelijkenis van de in vivo situatie is cruciaal om zinvolle gegevens te genereren, zoals c.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken het Fraunhofer ISC voor de samenwerking met betrekking tot de constructie van het geautomatiseerde verwondingsapparaat. Het project werd opgericht door het interne Fraunhofer-project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML |
Referenties
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
