Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om een driedimensionaal huidequivalent van volledige dikte op te bouwen, dat lijkt op natuurlijke huid. Met een speciaal geconstrueerd geautomatiseerd wondapparaat kunnen nauwkeurige en reproduceerbare wonden worden gegenereerd onder behoud van steriliteit.

Samenvatting

In vitro modellen zijn een kosteneffectieve en ethische alternatief om cutane wondgenezingsprocessen te bestuderen. Bovendien, door het gebruik van menselijke cellen, reflecteren deze modellen de menselijke wondsituatie beter dan diermodellen. Hoewel twee-dimensionale modellen wijd gebruikt worden om processen zoals cellulaire migratie en proliferatie te onderzoeken, zijn meer complexe modellen vereist om een diepere kennis over wondgenezing te verkrijgen. Naast een geschikt modelsysteem, is het genereren van nauwkeurige en reproduceerbare wonden cruciaal om vergelijkbare resultaten te garanderen tussen verschillende testruns. In deze studie wordt de generatie van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent gedemonstreerd om wondgenezing te bestuderen. Het dermale deel van de modellen bestaat uit humane dermale fibroblasten ingebed in een rat-staart collageen type I hydrogel. Na inoculatie met humane epidermale keratinocyten en daaropvolgende cultivering aan het lucht-vloeistof-interface, wordt een meerlagige epidermis gevormd bovenop de modellen. Om het wondgenezingsproces te bestuderen, hebben we bovendien een geautomatiseerd wondapparat ontwikkeld, dat gestandaardiseerde wonden genereert in een steriele atmosfeer.

Inleiding

De huid is het grootste orgaan van het lichaam. Het creëert een barrière tussen de externe omgeving en de interne organen. Bovendien is de huid beschermt het lichaam tegen vochtverlies, milieu-invloeden, verwondingen en infecties en helpt om de lichaamstemperatuur ¹ reguleren. Door zijn open ligging, wordt de huid vaak beïnvloed door mechanische, thermische of chemische trauma. Hoewel de huid is over het algemeen in staat zichzelf te repareren, kan meerdere lokale factoren zoals infectie, zuurstof, en veneuze toereikendheid leiden tot verstoorde wondgenezing. Wondgenezing kan worden gestoord door systemische factoren zoals obesitas, alcoholisme, roken, medicatie, voeding en ziekten zoals diabetes. ²

Het proces van wondgenezing kan worden verdeeld in 3 fasen: (i) de ontstekingsfase, (ii) de proliferatieve en (iii) remodelleringsfase. Bij schade aan de huid, een complex signaal cascade begint, waardoor de sluiting van de wond. ³Na een blessure, wordt de wond bloeden en een bloedstolsel wordt gevormd. Fibroblasten verhuizen naar het bloedstolsel en vervang het door nieuw weefsel dat vervolgens wordt verbouwd door de jaren heen.

Het huidige begrip van de biologische processen onderliggende huid herstel beperkt. Kleine dieren en varken modellen zijn gebruikt om wondgenezing te bestuderen. Echter, deze resultaten niet direct worden overgedragen op de mens als gevolg van species-specifieke verschillen. Naast deze in vivo modellen, kunnen bepaalde aspecten van wondgenezing worden bestudeerd door een gewikkelde toestand gesimuleerd door krassen in vitro monolaag kweken gebaseerd op geïmmortaliseerde cellijnen of primaire cellen. ⁴ Deze krassen modellen zijn zeer gestandaardiseerd, maar onvoldoende weerspiegelen de in vivo fysiologie. ⁵ Naast tweedimensionale modellen, zijn driedimensionale humane huid equivalenten ontwikkeld voor dermatologisch onderzoek. De dermale deel van deze modellen zijn gevergoede met behulp van diverse steigers inclusief gedecellulariseerde dermis, ⁶ collageen hydrogels, ^7,8 glycosaminoglycanen ⁹ of synthetische materialen. ¹⁰ Gebruikmakend van deze huid equivalenten, de rol van epitheliale-mesenchymale interacties ^11, de re-epithelialisatie, de cellulaire overspraak tussen fibroblasten en keratinocyten en de invloed van verschillende groeifactoren kunnen worden bestudeerd. Bovendien zijn deze modellen zijn nuttig om nieuwe kennis over hoe fibroblasten migreren naar de gewonde gebied en hoe chemotactische factoren beïnvloeden weefselregeneratie te krijgen. ¹²

Niet alleen genereren van de wondgenezing model zelf is uitdagend, maar ook om vast te stellen een zeer gestandaardiseerde wond model problematisch. Gebruikte technieken om te creëren wonden zijn krastesten, ¹³ brandwonden, ¹⁴ tape slijtage, ¹⁵ thermisch letsel, ¹⁶ zuig blaren, ¹⁷ vloeibare stikstof, ¹⁸ lasers, ¹⁹ scalpels, ¹⁸ meshers ⁶ en biopsie stoten. ²⁰ De meeste van deze methoden hebben dezelfde valkuilen. Blessures handmatig geïmplementeerd zijn moeilijk te standaardiseren en te reproduceren tussen meerdere tests. Grootte, vorm en diepte van de wond variëren tussen de studies en daarmee afbreuk doen aan de kwaliteit van de onderzoeksgegevens. Het gebruik van laser voor gedefinieerde huid verwonden kan relatief eenvoudig worden gestandaardiseerd, maar leidt tot een situatie nabootsen van brandwonden. Heat van laser toegepast kan eiwitdenaturatie, bloedplaatjes aggregatie of vaartuigen vernauwing, wat kan leiden tot necrotisch weefsel.

In een alternatieve benadering, een geautomatiseerde verwonding apparaat (AWD), die ons in staat stelt om te definiëren en de huidwonden onder steriele omstandigheden te genereren ontwikkelden we. Verwonding parameters, zoals diepte en snelheid van penetratie en toerental van de boorkop kan worden geregeld. In deze studie hebben we gecombineerd de AWD met in eigen huis ontwikkelde volledige dikte van de huid equivalenten (ftSE) die vergelijkbaar zijn met een protocol gepubliceerd door Gangatirkar et al. ⁸ de dermale laag van de huid equivalent uit humane dermale fibroblasten (HDF), die zijn ingebed in een collageen I hydrogel. Op de huid laag, humane epidermale keratinocyten (HEK) zijn gezaaid. Binnen twee weken aan de lucht-vloeistof-interface van de HEK opbouwen van een epidermis bestaat uit meerdere vitale cel lagen en een hoornlaag. Naast de generatie van dit model, deze studie toont het gebruik van de AWD te definiëren en de wonden te creëren in de FTSE.

Protocol

OPMERKING: Het protocol is ontworpen voor de productie van 24 volledige dikte huid equivalenten. Humane dermale fibroblasten en epidermale keratinocyten werden geïsoleerd uit huidbiopsies volgens een eerder gepubliceerde protocol. ^21,22 Informed consent werd vooraf verkregen en de studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische commissie op de menselijke onderzoek van het Julius-Maximilians-Universität Würzburg (182 stemmen / 10).

1. De productie van Dermal Component

1. Los collageen met 0,1% azijnzuur tot een eindconcentratie van 6 mg / ml. Voor de gel neutralisatieoplossing, meng 232,5 2x ml DMEM, 7,5 ml foetaal kalfsserum, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml chondroïtinesulfaat (5 mg / ml). Houd gel neutralisatieoplossing en collageen oplossing op ijs. Bereken 500 pi gel per insert / huid equivalent.
   OPMERKING: Als de gel neutralisatie oplossing zal worden gemengd met twee delen van collageen oplossing preparre dubbele hoeveelheid collageen.
2. Plaats 24 inserts in een 24 well plaat.
3. Resuspendeer humane dermale fibroblasten (HDF) in 10 ml DMEM, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 270 xg en tel de cellen. Extraheer de benodigde hoeveelheid HDF (5 x 10 ⁴ cellen per 500 ul collageen gel) en centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 270 x g.
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de HDF voorzichtig in 4 ml gekoelde gel neutralisatieoplossing zonder dat luchtbellen. Vanaf deze stap zorg ervoor om zo snel mogelijk te werken om voortijdig stollen van de collageengels voorkomen.
5. Resuspendeer de oplossing met 8 ml collageenoplossing.
6. Neem de collageen-cel-mengsel met een multistep-pipet en vul snel 500 pi van mengsel in elke insert. Incubeer de gels gedurende 20 minuten in een incubator (37 ° C, 5% _CO2) om de gels opstijven.
7. Dompel de gels in 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal kalfsserum (FCS) per putjeen incubeer het voor 24 uur in een incubator (37 ° C, 5% _CO2).

2. Toevoeging van humane epidermale keratinocyten (HEK)

1. Verwijder medium na 24 uur. Los fibronectine humaan eiwit met ultrazuiver water tot een eindconcentratie van 50 ug / ml. Bedek elk dermale equivalent ten 25 pl fibronectine oplossing. Incubeer de gels gedurende 30 minuten in een incubator (37 ° C, 5% _CO2).
2. Ondertussen resuspendeer de Hek 10 ml KGM-2 en zet celconcentratie 1 x 10 ⁶ cellen / ml met KGM-2 klaar + 5% FCS. Zaad 1 x 10 ⁵ hek op elke gel. Incubeer gels gedurende 45 min in de incubator (37 ° C, 5% _CO2) om cellen te hechten.
3. Onderdompelen de gels met KGM-2 klaar + 5% FCS en kweken ervan in de incubator (37 ° C, 5% _CO2).

3. Cultuur van de volledige dikte van de huid equivalenten (FTSE)

1. Cultuur FTSE voor 6-7 dagenaflopend FCS-concentratie (5%, 2% en 0% FCS). Verander het medium om de 2-3 dagen met de volgende lagere FCS concentratie. Voor deze, volledig te verwijderen het medium en voeg 1,6 ml vers medium.
2. Op dag 7, verwijder medium volledig.
   OPMERKING: Sluit de FTSE oppervlak niet aan met de punt van de pipet terwijl doen.
3. Plaats elke voegen in 1 put van een 6 wells plaat met een steriel pincet. Voeg 1,5 ml luchtbrug medium per well, ervoor te zorgen dat u de FTSE oppervlak nat. Veranderen medium om de 2-3 dagen voor een extra 14 dagen.
   Opmerking: Het niveau van het medium aan de meniscus van de FTSE.

4. Histologische analyse

1. Vaststelling en paraffine-inbedding van de FTSE
   1. Verwijder kweekmedium overdragen inzetstukken verse platen met 24 putjes en vast weefsel door toevoeging van 1,6 ml van 4% paraformaldehyde aan elk putje en incubeer de weefsels gedurende 2 uur bij KT. Let op! Paraformaldehyd is giftig, te bewerken onder zuurkast. Overdrachtde FTSE een weefselverwerkingsproces cassette. Verwijder resterende fixatief door wassen met water en uitdrogen van het weefsel met behulp van oplopende ethanolconcentraties.
   2. Verdeel de huid gelijk door een verticale snede in het midden. Leg de twee stukken in een paraffine gevulde metalen voet vorm met snijvlakken naar beneden. Voeg de weefselcassette bovenop de mal als rug.
   3. Snijd 3-5 micrometer plakjes en drijven ze op een 40 ° C waterbad voor straighten, monteren op geschikte microscoop dia dia's. Droge plakjes grondig.
2. Hematoxyline & eosine (H & E) en immunohistochemische (IHC) kleuring
   1. Plaats glijdt in rek en incubeer 1 uur bij 60 ° C. Zorg ervoor dat paraffine gesmolten. Vlek gerehydrateerde plakjes met H & E als een gestandaardiseerd overzicht vlekken.
   2. Voor H & E kleuring bereiden 4x glas kleuring cuvetten met xyleen, 3x met ethanol 96%, 2x met ethanol 70%, 1x met ethanol 50%, 4x gedemineraliseerd water, 1x hematoxylin, 1x HCl-ethanol (13,7 ml 1 M HCl ad 200 ml 50% ethanol), 1x tabblad water, 1x eosine (1 g eosine in 100 ml gedemineraliseerd water) en 2x 2-propanol.
   3. Plaats de glaasjes 10 min in xyleen I en 10 min in xyleen II bij deparaffinize en rehydrateren glijbanen. Dip glijdt 3x in ethanol 96% I, 3x in ethanol 96% II, 3x in ethanol 70% en 3x in ethanol 50%. Draai dia's in gedemineraliseerd water. Om hematoxylin dye, dip 2x in HCl-ethanol te differentiëren. Spoelen met gedemineraliseerd water. Voor blauwen, plaats schuift 5 min in tabblad water. Voor eosinekleuring, plaats schuift 1 min in eosine en was daarna in gedeïoniseerd water. Voor dehydratatie, dip slides 2x in ethanol 70%, 2x in ethanol 96% en plaats ze gedurende 5 min in 2-propanol I, gedurende 5 min in 2-propanol II, 5 minuten in xyleen I en 5 min in xylol II. Na H & E kleuring, zijn celkernen gekleurd in blauw, cytoplasma en extracellulaire matrix zijn gekleurd in het rood.
   4. Voor antigen retrieval, verwijderen paraffine met xyleen en rehydrateren plakjes voor het kleuren. Plaats plakjesin de stoomkoker en kook gedeparaffineerde en gehydrateerd plakken voor 20 min in voorverwarmde 10 mM citraat buffer (pH 6).
   5. Plaats de glaasjes in wassen (PBS-buffer + 0,5% polysorbaat 20) en cirkel plakken met een vloeistof afstotende dia viltstift of diamant stylus.
   6. Plaats dia's in een vocht kamer. Blokkeren endogene peroxidase, met toevoeging van 100 pi 3% waterstofperoxide-oplossing op elke plak. Let op! Zeer gevaarlijk in geval van huid- en oogcontact. Handvat met persoonlijke beschermingsmiddelen. Wassen glijdt bij het wassen buffer.
   7. Breng primair antilichaam en incubeer gedurende 1 uur bij KT. Was dia driemaal met wasbuffer. Vanaf hier moeten de monsters in het donker worden bewaard.
   8. Met biotine-streptavidine detectiesysteem voor detectie van antigeen-antilichaambinding.
   9. Tegenkleuring kernen met hematoxyline gedurende 1 minuut. Uitdrogen en mount dia's.
   10. Afbeelding monsters met behulp van een omgekeerde microscoop.

5. Letsel door gebruik van de Automated Verwonden Device (AWD)

1. Bereid de AWD door het desinfecteren van de werkplek met 70% ethanol en ultraviolet licht. Zorg ervoor dat de boorkop van de gewenste grootte (bijvoorbeeld 1 mm) wordt bevestigd.
2. Plaats huid equivalenten in aangewezen gebieden van de geautoclaveerd monster draagplaat met behulp van een steriel pincet. Plaats het monster draagplaat in de aansluiting onder de boorkop.
3. Gebruik de besturingssoftware te verwonden parameters in te stellen als volgt: rotatie snelheid: 15.000 rpm; penetratie: 1,5 mm; aandrijving: 100 Hz. Deze parameters moeten worden gedefinieerd voor elk monster afzonderlijk. Transfer verwonden parameters tot de AWD.
4. Start verwonden procedure. Verwijder monster draagplaat uit het stopcontact. Transfer gewonde FTSE terug in inserts gebruikt voor cultuur met behulp van een steriel pincet.
5. Ga verder met de cultuur van de gewonden FTSE in de incubator (37 ° C, 5% CO _2), voor onderzoek naar regeneratie. Alternatively, gebruikt de modellen voor histologische analyse op elk moment.

Resultaten

De geïsoleerde HDF en HEK verschillen zowel in morfologie en in de expressie van de typische markers. De HDF toonde typische spindel-vormige morfologie, terwijl de morfologie van Hek kan worden beschreven door een geplaveide morfologie. De cellen werden gekarakteriseerd door immunohistochemische kleuring (figuur 1) alvorens ze voor FTSE. De HDF zijn positief voor vimentine (figuur 1A), een marker voor fibroblasten. Primaire HEK zeer uiten vroege differentiatie eiwit cytokeratine-14

Discussie

In vitro cellen gewoonlijk uitgebreid tweedimensionale celculturen, waarbij cellen hechten aan kunststof oppervlakken. Echter, deze kweekomstandigheden niet de fysiologische driedimensionale omstandigheden waarbij cellen groeien in vivo. Onder driedimensionale omstandigheden kunnen cellen natuurlijke cel-cel en cel-matrix aanhangsels samen en migreren in drie dimensies. Vooral in de cutane wondgenezing de gelijkenis van de in vivo situatie is cruciaal om zinvolle gegevens te genereren, zoals c...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS	PAA	L11-003	0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
6 well plate	Nunc	140685
24 well plate	Nunc	142485
Microscope slides	R. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten culture medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93% (232.5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma	C4384-1g	1% (2.5 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	3% (7.5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7.5 ml)
Skin model submers medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Fetal calf serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0.62% (3.1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
CK14 antibody	Sigma	HPA023040-100µl
CK10 antibody	Dako	M7002
Filaggrin antibody	Abcam	ab81468
H&E staining:
Mayer´s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Mounting Medium	Sigma Aldrich	M1289-10ML