High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een qRT-PCR-assay met hoge doorvoer voor de analyse van type I en III IFN-expressiesignaturen. De assay onderscheidt verschillen van enkele basenparen tussen de zeer vergelijkbare transcripten van deze genen. Door batchassemblage en robotisch pipetteren zijn de assays consistent en reproduceerbaar.

Samenvatting

Beschreven in dit rapport is een qRT-PCR-test voor de analyse van zeventien menselijke IFN-subtypes in een 384-well plate-formaat dat zeer specifieke locked nucleic acid (LNA) en molecular beacon (MB) probes, transcriptstandaarden, geautomatiseerd multichannel pipetten en platendrogering omvat. Het bepalen van de expressie onder de type I interferonen (IFN), met name de twaalf IFN-α-subtypes, wordt beperkt door hun gedeelde sequentie-identiteit; evenzo zijn de sequenties van de type III IFN, met name IFN-λ2 en -λ3, zeer vergelijkbaar. Deze test biedt een betrouwbare, reproduceerbare en relatief goedkope manier om de expressie van de zeventien interferon-subtype transcripten te analyseren.

Inleiding

Type I en III interferonen (IFN) zijn cruciaal in de immuunrespons tegen virussen en andere pathogene stimuli en in alle vertebraten ^1. Immuun en niet-immuun cellen tot expressie en scheiden, en reageren op IFN ^2. Aangeboren immuunsysteem sensoren, zoals toll-like receptoren (TLR), Sting, en RIG-I, induceren type I en III IFN expressie bij detectie van pathogenen geassocieerde moleculaire patronen (PAMP) ^3,4. Bij mensen type I IFN omvatten IFN-β, -ω, -κ en 12 subtypen van IFN-α, en binden aan het IFNAR1 / IFNAR2 receptorcomplex ^2,5. Type III IFN onder IFN-λ1, -λ2 en -λ3 en binden aan de IL10RB / IL28RA receptor complex ^2. Klassiek, typen I en III IFN binden aan hun respectievelijke receptor complexen die vervolgens rekruteren STAT1 / STAT2 heterodimeren en initiëren transcriptie van interferon gestimuleerde genen (ISG) ^6. ISG zijn betrokken bij een breed scala aan functies, van antivirale en antiproliferatieve activiteit activatie van de adaptieve immuunrespons ^7.

De talrijke mechanismen pathogenen zijn geëvolueerd te ontwijken, ondermijnen en kapen elementen van het IFN signaalweg tonen het belang van IFN in de aangeboren immuunrespons ^8. Bijvoorbeeld vacciniavirus drukt een lokreceptor met IFNAR1 homologie dat sequesters type I IFN ⁹ terwijl een Yaba-achtig virus van de ziekte scheidt een glycoproteïne dat remt type I en III IFN eiwitten ^10. Naast hun rol bij de afweer worden IFN ook betrokken bij kanker surveillance en een aantal auto-inflammatoire aandoeningen: silencing van IFN expressie in borstkankercellen beperkt immunosurveillance ^11, overproductie van IFN-α is een mechanisme in de ontwikkeling van systemische lupus erythematosus ^12, en dolende activering van STING leidt tot systemische ontsteking veroorzaakt door overmatige hoeveelheden IFN in-STING geassocieerd vasculopathy13. Therapeutisch IFN gebruikt om multiple sclerose te behandelen ^14, chronische virale infecties zoals HBV en HCV ^{15 16,17} en kankers zoals hairy cell leukemie en ¹⁸ chronische myelogene leukemie ^19. Vragen over de relevantie van IFN in een bepaald fysiologisch proces continu onthullen de alomtegenwoordige karakter van dit cytokine familie.

Type I IFN, vooral IFN-α subtypen, worden vaak beschouwd als één entiteit ^20-23, in plaats van als een groep nauw verwante maar onderscheiden eiwitten. Het bestaan ​​en de persistentie van meerdere IFN species waaronder IFN-α subtypen gehele evolutie van vertebraten ²⁴ suggereert dat ten minste een subset van deze subtypen specifieke en unieke functies. Het is mogelijk dat het definiëren van patronen IFN expressie ontcijferen helpen karakteriseren de specifieke functies van één of meer van de ¹⁷ subtypes. De uitdaging van het bestuderen van de tHij type I en III IFN subtypen gebaseerd op hun gemeenschappelijke sequentie identiteit: de twaalf IFN-α subtypen delen> 50% ²⁵ en IFN-λ subtypen delen 81-96% ²⁶ van hun aminozuursequenties. In de beschreven qRT-PCR assay moleculaire beacon (MB) en vergrendeld nucleïnezuur (LNA) fluorescente probes onderscheid enkel basepaar verschillen tussen de zeer vergelijkbare IFN subtype sequenties en zorgen voor de karakterisering van de handtekening IFN expressie. 384-wells plaat formaat van de test omvat zowel kwantitatieve (transcript normen) en semi-kwantitatieve (het huishouden genen (HKG)) maatregelen, waardoor voor analyse door respectievelijk transcript aantal kopieën en ΔCq. Batch assemblage, gefaciliteerd door geautomatiseerde meerkanaals pipetteren, en lange termijn opslag, mogelijk door het drogen van de primer / probe (Pr / Pb) stelt op de platen, verbetering van de reproduceerbaarheid, het nut en de uitvoerbaarheid van de test.

Dit protocol beschrijft het procesvoorbereidende 384 putjes qRT-PCR assay platen (figuur 1) met tot zeventien verschillende Pr / Pb sets gericht humaan IFN subtypen (Tabel 1). Pr / Pb set werkvoorraad bronplaten (figuur 2) worden gebruikt om meerdere 384-well testplaten bereid in een proces dat kan worden geautomatiseerd met behulp van een robot multichannel pipet. Terwijl de initiële focus lag op het creëren van een protocol voor het bestuderen van de menselijke IFN expressie handtekening, is deze methode toegepast op resusmakaken ook. Hoewel de plaat indelingen zijn iets anders en Pr / Pb sets (tabel 2) gescheiden zijn, de algemene werkwijze voorbereiding voor het creëren van menselijke en rhesus platen identiek. Met minimale aanpassingen van het protocol, kan de werkwijze worden uitgevoerd om de ontwikkeling van assays voor andere groepen van nauw verwante genen te bestuderen.

Zie Figuren 1 en 2 hieronder

Zie de tabellen 1 en 2 Belau

Protocol

1. Voorbereiding van Standard seriële verdunningen (figuur 3A)

OPMERKING: Serial verdunningsreeks van gelineariseerde plasmiden die de sequenties doelwit van een Pr / Pb set worden gebruikt als kwantitatieve normen voor de qRT-PCR-test. Elke standaard seriële verdunning set voor de IFN subtypen bevat voldoende volume tot 90 assayplaten draaien. De vier punten van de standaard verdunningscurve gebruikt voor de test zijn geselecteerd Ct effectief mogelijk uit een reeks van 20-32 (tabel 3).

1. Ontdooi, vortex en centrifugeer kort de standaard (50 pM) en zalmsperma DNA (ssDNA, 10 mg / ml) voorraadoplossingen.
2. Bereid de ssDNA / water mix voor de 17 standaard verdunning sets door het mengen van 51 ul van ssDNA met 20,3 ml water.
3. Label een 8-tube PCR strip voor een standaard verdunning set.
   OPMERKING: Voorbereiding van de standaard seriële verdunningen van de voorraad oplossingen zal 2-3 uur duren.
4. Doseer 190 ul van de ssDNA / water mengsel aan de ferste buis in de strip en 180 ul van ssDNA- / water mix tussen de vijf overblijvende buizen.
5. Voer een 1:20 verdunning door de overdracht van 10 ul van de 50 pM standaard bouillon aan de buis met 190 ul van de ssDNA / water, meng; vortex en snel centrifuge de PCR-strip.
6. Voer een 1:10 verdunning van overdracht 20 ul van de laatst verdund buis de volgende buis in de serie; vortex en snel centrifuge de PCR-strip.
7. Herhaal stap 1.6 tot de laatste buis in de verdunningsreeks is de norm ontvangen.
8. Herhaal de stappen 1,3-1,7 voor elke standaard.

Zie onderstaande tabel 3

2. Voorbereiding van de primer / probe (Pr / Pb) en No Template Controle (NTC) werken Stock Mixes (figuur 3B)

OPMERKING: Elke 1,7 ml Pr / Pb set werkvoorraad en 128,6 ul Geen Template Controle (NTC) werkvoorraad mix zal 30 assayplaten maken.

1. Bereid de Pr / Pb set werkvoorraad mixen.
   NIETE: Voorbereiding van de Pr / Pb set en NTC werkvoorraad mengt uit de voorraad oplossingen zal 2-3 uur duren.
   1. Resuspendeer de primers en probes bij 100 uM met ultra-zuiver water voor de bereiding van de stockoplossingen.
   2. Bestempelen tot zeventien 2 ml buizen; één voor elk Pr / Pb set opgenomen in de test.
   3. Ontdooi, vortex, en kort gecentrifugeerd primers (100 uM), probes (100 uM) en ssDNA (10 mg / ml) voorraadoplossingen.
   4. Voeg 2 pi van ssDNA aan elke buis met 12,5 ui elektronische multichannel pipet. Voeg de juiste voorwaartse primer, reverse primer, en peilen naar elke Pr / Pb set werkvoorraad buis. Zie tabel 1 voor de Pr / Pb sets gerichte humaan IFN-subtypen en tabel 2 voor de rhesus macaque Pr / Pb sets. Voeg water toe om het volume van elk Pr brengen / Pb set werkvoorraad buis tot 200 ul.
      Opmerking: Het volume van primers, probe en water toe te voegen afhankelijk van de gewenste uiteindelijke concentratie reactie van een Pr / Pbset.
2. Bereid de NTC werkvoorraad mixen.
   1. Label twee 5-tube PCR-strips voor de NTC werkvoorraden mengt.
   2. Transfer 14,3 pi van elke Pr / Pb ingesteld op het juiste NTC werkvoorraad mix buis. Zie tabel 4 voor de Pr / Pb set combinaties voor NTC putten. Water Aan elk van de NTC werkvoorraad mengt om het uiteindelijke volume op 128,6 pl brengen.
   3. Vortex, kort centrifuge, en plaats de buizen in het donker op ijs of bij -20 ° C voor langdurige opslag.

Zie onderstaande tabel 4

3. Verdun de Pr / Pb ingesteld werkvoorraden.
   1. Na verwijdering van een hoeveelheid van de Pr / Pb sets nodig voor de NTC werkvoorraad mixen, voeg 1,5 ml water om het eindvolume van elk Pr / Pb brengen set werkvoorraad buis 1,7 ml.
   2. Vortex, kort centrifuge, en plaats de buizen in het donker op ijs of bij -20 ° C voor langere tijd te bewaren.

3. Bereiding van 384-well testplaten de geautomatiseerde multichannel pipet

1. Bereid een 96-well bronplaat van de Pr / Pb sets en NTC mixen voor aliquoting 384-well testplaten.
   OPMERKING: Voorbereiding van de bron plaat uit de Pr / Pb werking voorraad mixen zal minder dan 1 uur duren. Elke 96-well bron plaat is genoeg om zes 384-wells assay platen (Figuur 3C) te maken.
   1. Vortex en kort centrifugeren de Pr / Pb set werkvoorraden en NTC werkvoorraad mixen.
   2. Plaats een nieuwe 96-well plaat in een gekoelde 96 putjes koelblok en wijzen de putjes per Pr / Pb set of NTC meng de putjes ontvangen (zie figuur 2).
   3. Voeg water toe aan de plaat met 96 putjes met 250 ui elektronische multichannel pipet: Pipetteer 66 ul water te laten Pr / Pb goed opgezet (behalve 4 putjes Target 17). Doseer 82,5 ul van water om de 4 Target 17 putten. Doseer 27,5 ul van water om elke NTC mix goed.
   4. Voeg de juiste Pr / Pb set werkvoorraad op de aangegeven putjes van de plaat met 96 putjes: Pipetteer 54 ul van de juiste Pr / Pb set werkvoorraad voor de aangegeven Pr / Pb set putjes (behalve 4 putjes Target 17). Doseer 67,5 ul van de Target 17 Pr / Pb ingesteld werkvoorraad naar de aangewezen Target 17 Pr / Pb set putten. Voeg 22,5 ul van de juiste NTC werkvoorraad mix naar de aangewezen putten.
   5. Sluit de 96-well plaat met een plakplaat afdichting en centrifugeer gedurende 1 min bij 700 xg te zorgen voor de inhoud op de bodem van de putjes.
   6. Plaats de plaat met 96 putjes in de vortex menger met een 96-well plaat adapter en meng gedurende 1 min bij 1000 rpm. Centrifugeer de 96-well plaat gedurende 5 min bij 700 x g.
   7. Sla de 96-well bronplaat in het donker bij 4 ° C bij gebruik op dezelfde dag, of anders bij -20 ° C tot gebruik.
2. Bereid de 384-wells assayplaten door het toevoegen van de Pr / Pb-sets met behulp van de automatische multichannel pipet.
   OPMERKING: Voorbereiding van zes assayplaten van de 96-well bron plaat zal 3-4 uur duren.
   1. Voorafgaand aan het maken van platen, pre-chill de koeling nest tot 4 ° C en pre-Verwarm de plaatverdamper tot 125 ° C en de bodem warmte blok tot 80 ° C met een luchtstroom blaast tussen 20-25 liter per minuut (LPM).
   2. Schakel de automatische multichannel pipet en open het protocol voor het maken van IFN assayplaten door te dubbelklikken op de software-icoon.
   3. Voor het opzetten van het platform, plaats een volledig volle pipet tip box aan platform positie 1, de 96-well bron plaat in positie 4, en een nieuwe 384-wells plaat in positie 6. Begin de run door op de afspeelknop.
      OPMERKING: Na voltooiing van een run, elk goed zal 5 ul van Pr / Pb mix bevatten.
      OPMERKING: Het eindbedrag van ssDNA- toegevoegd per putje van de 384-wells testplaat is 0,025 ug.
   4. Tik de 384-well assay plaat op een vlakke ondergrond vocht garanderen onderaan de putten en een lijmplaat afdichting.
   5. Centrifugeer de plaat gedurende 1 min bij 700 x g. Verwijder de zelfklevende plaat afdichting, plaatst u de 384-wells testplaat in de plaat droger en de positie van de 384-wells spruitstuk direct boven de putten.
   6. Wanneer de inhoud van het 384-wells assayplaat's droog is, brengt een nieuwe lijm plaat seal, wikkel in folie, label, en op te slaan in het donker bij 4 ° C tot gebruik.
      OPMERKING: Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende ten minste 6 maanden.
   7. Herhaal stap 3.2.3-3.2.6 tot 6 x 384-well assay platen worden vervaardigd of de vloeistof in de 96-well plaat bron is uitgeput.
   8. Schakel de koeling nest, sluit de software, en schakel de automatische multichannel pipet. Schakel de plaat droger.

4. Laden en runnen van een 384-wells bepalingsplaat

1. Bereid twee huishouding gen (HKG) goed mixen, die bestaan ​​uit de Pr / Pb set voor een HKG, ssDNA, PCR master mix en water, om te worden toegevoegd aan een gedroogde 384-wells testplaat ( Figuur 3D).
   OPMERKING: Voorbereiding van het mixen en het laden van de testplaat zal 1-2 uur duren. Het uitvoeren van de test plaat zal minder dan 2 uur duren.
   1. Label een 1,5 ml buis voor elke HKG mix.
   2. Verdun 2 pl ssDNA (10 mg / ml) met 84,9 pl water. Voeg 2 pi van de verdunde ssDNA, 11,8 ul van water, 23 ul van master mix, en 9,2 ul van de juiste 20x HKG Pr / Pr ingesteld op elke buis, vortex, en kort centrifuge.
   3. Gebruik glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) en ubiquitine C (UBC) als HKG voor de humane assay (zie Materialen tabel). Gebruik GAPDH en 18S ribosomaal RNA als HKG voor de rhesus assay.
      OPMERKING: De HKG gebruikt om de test uit te voeren zijn flexibel en moet de genen die voor het type cel weerspiegelen wordt getest GAPDH-, UBC, en 18S zijn voorbeelden van veelgebruikte HKG;. andere HKG wellicht meer geschikt.
2. Bereid het monster en positive controlewell mengsels, die bestaan ​​uit het monster of positieve controle cDNA master mix en water, worden toegevoegd aan een droge 384-well assay plaat. Bereid de steekproef en de positieve controle mixen in voldoende hoeveelheid af te zien tot en met 21 putjes (Figuur 3D).
   1. Voorafgaand aan cDNA-synthese, de instructies van de fabrikant om de RNA-monsters te bereiden met een DNase digestiestap.
   2. Bereid de monsters en de controle vooraf van de cDNA synthese van ten minste 500 ng RNA, gevolgd door behandeling met RNase H (eindvolume van 24 ul per monster) volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar de bereide cDNA bij -20 ° C tot gebruik. Dooi, vortex, en kort centrifugeren het monster cDNA.
   3. Voeg 78,8 ul van master mix en 54,8 ul van water aan elkaar op 24 ul monster en positieve controle buis.
   4. Vortex en kort centrifugeren de buizen.
3. Bereid de normen en NTC goed mengt, consteld uit master mix en water, om te worden toegevoegd aan een gedroogde 384-wells testplaat (Figuur 3D). Voor de normen meng goed, voeg 165 ul van water tot 275 ul van master mix in een 1,5 ml buis. Voor de NTC meng goed, voeg 52,5 ul van water tot 52,5 pi master mix in een 1,5 ml buis. Vortex en kort centrifugeren de buizen.
4. Bereid een gedroogde 384-wells testplaat voor het laden van het mixen en samples.
   1. Verwijder een droge 384-well assay plaat bij 4 ° C en centrifugeer gedurende 1 min bij 700 x g.
   2. Leg de plaat op een gekoelde 384-wells koelblok, verwijder de lijm plaat afdichting en een overzicht van de putjes van de plaat aan te wijzen waar de verschillende mixen en monsters worden gepipetteerd (figuur 1).
5. Laad de 384-wells assay plaat met standaard goed mix, normen, NTC meng goed, monsters, positieve controle, en HKG mix (figuur 3E). Vortex en kort centrifuge alle oplossingen voor het afgeven aan de plaat.
   1. Doseer 6 pl van de normen meng goed aan elke standaard goed met de 30-ul elektronische meerkanaalspipet. Doseer 1,5 ul van de juiste standaard seriële verdunning om goed de aangewezen met de 12,5 ul elektronische meerkanaalspipet.
   2. Doseer 7,5 ul van NTC meng goed aan elke NTC goed met de 30-ul elektronische meerkanaalspipet. Verdeel 7.5 ul van het monster op de aangegeven putjes met 30 pl elektronische multichannel pipet. Doseer 2,5 ul van de HKG Pr / Pb mengt met de aangegeven putjes met de 12,5 ul elektronische meerkanaalspipet.
   3. Vul alle lege putten met 7,5 ul van het overgebleven water en master mix mengsel met de 30-ul elektronische meerkanaalspipet; 7,5 ul van water alleen zal ook werken.
   4. Sluit de 384-well assay plaat met de optische kleeffolie en centrifugeer gedurende 1 min bij 700 x g. Vortex de afgedichte 384-wells plaat in de vortex mixer gedurende 2 min bij 2600 rpmen centrifugeer 5 min bij 700 x g.
   5. Plaats de verzegelde 384-wells assay plaat in de qRT-PCR-apparaat, opent u de sjabloon voor de test layout en beginnen met de run.
      OPMERKING: De resultaten kunnen worden geëxporteerd als een spreadsheet of als een tekstbestand voor analyse.
   6. Gebruik de volgende optimale thermische cycler reactieomstandigheden voor de bepaling: i) 50 ° C gedurende 2 min, ii) 95 ° C gedurende 10 minuten, iii) 95 ° C gedurende 25 s, iv) 59 ° C gedurende 1 min. Herhaal stap iii en iv gedurende 40 cycli.
   7. De ruwe data van de qRT-PCR-platform te exporteren naar een spreadsheet-applicatie software. Plot elke 4 punts standaard ingesteld als een standaard bocht naar lineariteit te observeren. Uit te voeren analyse door het berekenen van de ΔCq of door het aantal kopieën op basis van de vier punt standaardcurven ^27.

Zie figuur 3 hieronder

Resultaten

De qRT-PCR assay beschreven kan worden toegepast om expressiepatronen van type I en III IFN analyseren verschillende celtypes en contexten. Bijvoorbeeld, humaan type I en III IFN expressie handtekeningen geanalyseerd perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) van 6 donors gestimuleerd met TLR liganden; poly I: C (25 ug / ml), LPS (10 ng / ml), imiquimod (10 uM) en CpG oligonucleotiden (1 uM) (figuur 4). De gegevens werden geanalyseerd met behulp van een spreadsheet-applicatie software en gepresenteerd als radar grafieken met de IFN-α-subtypen geregeld met de klok mee volgens de fylogenetische boom van hun proteïnesequentie ^27. De radar grafieken van de menselijke IFN expressie worden gepresenteerd in een log-schaal berekend met behulp van de twee verschillende analysemethoden opgenomen in de test ontwerp: absolute Cq waarde genormaliseerd naar HKG (ΔCq), en kopieer aantal template per microgram (ug) van totaal RNA . Kopieer aantal waarden worden berekend op basis van de resultaten o fa transcript's standaard curve. De gegevens tonen dat menselijke IFN expressie signaturen opgewekt door TLR-agonisten ligand specifiek.

Zie figuur 4 onder

Zoals aangetoond voor het menselijk IFN expressie handtekeningen, expressie handtekeningen van type I en III IFN in rhesus makaken waren ook TLR-ligand specifiek. PBMC van 3 donoren gestimuleerd met poly I: C (50 ug / ml), LPS (10 pg / ml), en imiquimod (10 ug / ml) gedurende 3 uur (Figuur 5). IFN subtype expressie in gestimuleerde cellen in de uitgangssituatie was laag. Een beperkt aantal IFN-subtypen werden uitgedrukt als reactie op LPS en poly I: C. Daarentegen IFN expressie in reactie op imiquimod was hoog en het subtype expressie breed. Expressie van IFN-β en IFN-λ1 was door alle drie TLR-agonisten ^28.

Zie figuur 5 hieronder

altijd ">
Figuur 1:. De lay-out voor een 384-wells assay plaat met zeventien Pr / Pb sets Target nummer verwijst naar een Pr / Pb set. De vierpunts standaard curves (donkergrijs driehoek) toegevoegd aan de kolommen 1-5. De HKG Pr / Pb sets (witte achtergrond) toegevoegd aan de kolommen 6 en 7. De overige kolommen, 8-24, zijn specifiek voor één van de zeventien Pr / Pb sets. Monsters worden toegevoegd aan rijen AP, van kolommen 6-24 (zwarte pijlen). De twee putten (O5, P5) op de bodem van kolom 5 ontvangen alleen water en master mix. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2:. De lay-out voor een 96-wells plaat met zeventien bron Pr / Pb sets Target nummer verwijst naar een Pr / Pbset. Zwarte pijlen geven wanneer een Pr / Pb set wordt toegevoegd om meerdere putten. NTC mengsels worden toegevoegd aan de aangeduide putjes (donkergrijze achtergrond). De twee putten (F3, G3) met diagonale lijnen ongebruikt zijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Schematische voorstelling van de specifieke stappen in de qRT-PCR-test protocol AE diagram selecteert delen van het protocol.. (A) Stap 1: Bereiding van standaard seriële verdunningen. (B) Stap 2: Voorbereiding van de Pr / Pb en NTC werkvoorraad mixen. (C) Stap 3.1: Bereiding van een 96-wells plaat werkvoorraden van de Pr / Pb sets en NTC mixen. (D) Stap 4,1-3: Voorbereiding van de mengsels voor het laden van de 384-wells assay plaat. (Estep 4.5: Het laden van de 384-wells assay plaat. Diagrammen worden gelezen van de linksboven naar rechtsonder. Reagentia voor de interferon (IFN) assay worden bewaard bij -20 ^{° C} en in de linker kolom; lijnen afzonderlijke acties in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: De menselijke IFN expressie signatuur in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verschilt in reactie op de TLR liganden voor stimulatie PBMC werden gestimuleerd met TLR-liganden en RNA werd geoogst voor qRT-PCR analyse.. De geometrische gemiddelden van de piek reacties op poly I: C (25 ug / ml) 8 uur (rode vierkanten), LPS (10 ng / ml) 4 uur (groen driehoeken), imiquimod (10 uM) en 16 uur ( paarse diamanten), CpG (1 uM) bij16 u (zwarte cirkels) en ongestimuleerde controle 16 uur (blauwe cirkels) van 6 donors wordt in _log10 schaal als functie van de expressie van het HKG UBC ΔCq (links) of kopieaantal per ug RNA (rechts) . IFN-α subtypen zijn gerangschikt volgens de fylogenetische plot van aminozuursequentiegelijkheid. Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in de immunologie en celbiologie ^27.

Figuur 5:. De rhesus macaque IFN expressie signatuur in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verschilt in reactie op de TLR liganden voor stimulatie PBMC van drie rhesus makaken (door het kwadraat, diamant en driehoek aangeduid) werden geïsoleerd uit volbloed en gestimuleerd met lipopolysaccharide (LPS) (10 ug / ml), poly I: C (50 ug / ml) of imiquimod (10 ug / ml). Cellen werden geoogst op 0 uur (open vormen) of na 3 uur van TLR stimulatie (gesloten vormen) voor het meten van IFN expressie. Transcriptniveaus van type I, II en III IFN worden in _log10 schaal als functie van de expressie van het GAPDH HKG ΔCq (links) of kopieaantal / ug RNA (rechts). Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Interferon en cytokine Research ^28.

Tabel 1:. Human IFN primer / probe set sequenties en reactie informatie Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken.

Tabel 2:. Resusaap IFN primer / probe set sequenties en reactie informatie Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken.

	Plasmide concentraties (fM)
	Een	B	C	D
IFN-α1	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α2	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α4	2500	250	25	2.5
IFN-α5	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α6	250	25	2.5	0.25
IFN-α7	250	25	2.5	0.25
IFN-α8	250	25	2.5	0.25
IFN-α10	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α14	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α16	250	25	2.5	0.25
IFN-α17	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α21	25	2.5	0.25	0.025
IFN-λ1	25	2.5	0.25	0.025
IFN-λ2	25	2.5	0.25	0.025
IFN-λ3	250	25	2.5	0.25
IFN-β	25	2.5	0.25	0.025
IFN-ω	250	25	2.5	0.25

Tabel 3: Standaard verdunning set concentratie informatie.

	IFN Pr / Pb Sets toegevoegd	Volume water toegevoegd (ml)
NTC 1	IFN-β, -ω, -λ3	85,7
NTC 2	IFN-α1, -α5	100.0
NTC 3	IFN-α2	114.3
NTC 4	IFN-α4	114.3
NTC 5	IFN-α7	114.3
NTC 6	IFN-α6, -α8, -α10	85,7
NTC 7	IFN-α14, -α16	100.0
NTC 8	IFN-α17	114.3
NTC 9	IFN-α21, -λ1	100.0
NTC 10	IFN-λ2	114.3

Tabel 4: NTC werkvoorraad mengt informatie.

Discussie

Dit rapport beschrijft het ontwerp, batch-productie, en benadering van de analyse van een test om de transcriptie van een reeks van zeer gelijkaardige genen in een onderzoekslaboratorium instelling te meten. De high-throughput qRT-PCR-test hier gemeld meet de IFN en - λ subtypes met een hoge specificiteit. Deze methode omvat twee belangrijke aspecten, het ontwerp van Pr / Pb sets die onderscheid maken tussen leden van een homoloog gen-familie en de ontwikkeling van een productie-platform voor de ontwikkeling van betrouwbare en consistente 384-wells assayplaten voorgeladen met de Pr / Pb sets. De qRT-PCR-sondes zijn voorzien van een structurele (MB) of chemische (LNA) benadering van het verbeteren van hun specificiteit ^29. Voor twee van de primer sets in de rhesus assay (tabel 2), de amplificatie-refractaire mutatiesysteem (ARMS) werd opgenomen in de primer sequenties verder te verbeteren specificiteit ^30. Hoewel het algemeen het beste om exon-exon overgangen naar ENHA richtennce specificiteit van een qRT-PCR-reactie, was dit niet mogelijk omdat de type I IFN genen ontbreken intronen. Daarom zal genomisch DNA worden geamplificeerd in de PCR reactie en worden afgebroken door DNase behandeling na RNA-extractie.

Het doelgebied van de Pr / Pb sets beperkt tot de coderende gebieden van de mature peptide voor elke IFN. Vanwege de hoge sequentieovereenkomst tussen de IFN-α subtypen, met name het rijpe peptide regio, was het soms noodzakelijk compromis gevoeligheid specificiteit te garanderen. Dit is vooral het geval bij IFN-α17, waarbij het rijpe peptide transcript vier unieke basen vergeleken met de andere IFN-α subtypen. Targeting IFN-α17 vereist primers die de transcripten van verschillende subtypes te binden, beperken specificiteit van de sonde. Bijgevolg zal de PCR reactie andere subtypen amplificeren dan IFN-α17, waardoor nuttigen van een aanzienlijk percentage van de PCR reagentia en lowering van de amplitude van het fluorescentiesignaal van de specifieke probe voor IFN-α17. Een extra uitdaging richting ontwerpen gevoelige en specifieke Pr / Pb sets voor zeer vergelijkbare genen zoals de IFN is de mogelijkheid dat de geannoteerde sequenties in de GenBank databank niet volledig of volledig te zijn op het moment van ontwerp. Nogmaals, dit was een uitdaging voor IFN-α17, waarbij nieuw geannoteerde sequenties niet perfect uitgelijnd met de versie van de sequentie in de databank op het moment van het ontwerp. Daarom is bij het ontwerpen van Pr / Pb sets voor genen die niet intensief bestudeerd, is het verstandig om regelmatig te controleren of de nieuwste geannoteerde sequentie van een target-gen. Tenslotte is het noodzakelijk dat de Pr / Pb sets niet pseudogenen die kunnen worden overgeschreven, maar niet vertaalde amplificeren.

Na het ontwerpen van de Pr / Pb sets, is de volgende uitdaging het optimaliseren van de PCR-condities van zeventien verschillende Pr / Pb zet op een 384-wells plaat. Transcript normen zijn belang-tant in het testen van de specificiteit van een Pr / Pb-toestel en van essentieel belang voor de harmonisatie van de qRT-PCR-condities van de vele verschillende PCR-reacties worden. Testen van een Pr / Pb set tegen de transcript normen vaststelt zijn efficiëntie en gevoeligheid; plasmiden die zeer soortgelijk pseudogenen expressie nodig zijn opdat de Pr / Pb set meet selectieve transcriptie van het functioneel gen. Het transcript normen bieden een kwantitatieve middel van analyse (aantal transcripten), naast de semi-kwantitatieve analyse ten opzichte van een huishoudgen (ΔCq).

Robotic meerkanaals pipetteren van een 96-well bronplaat in meerdere 384-well testplaten verbetert de nauwkeurigheid en consistentie van inter-plate resultaten. Zalmsperma DNA (ssDNA) wordt gebruikt als een drager die stabiliseert en behoudt de Pr / Pb sets voor langdurige opslag, evenals drogen reagentia afgegeven in de platen. Het drogen van de platen vermindert ook het volume van het reactiemengselnoodzakelijk reproduceerbare resultaten, waardoor bewaart kostbare monsters en vermindert het gebruik van dure reagentia. Door middel van deze stappen, worden batches van platen gemonteerd die precisie en consistentie bieden voor meer dan zes maanden.

Volgende plaat voorbereiding, kwaliteitscontrole maatregelen zijn cruciaal voor de consistentie van een partij van platen controleren. Hiertoe worden vier extra sets normen uitgevoerd op een plaat. De "5x standaard" plaat volgt de prestaties en zorgt voor een dataset aan welke normen een individuele plaat's worden vergeleken. Terwijl tien 10-voudige verdunningen van elk standaard worden gebruikt tijdens testontwerp, ruimte overwegingen dient vier punten worden gebruikt voor de standaardcurve op elke testplaat en de 5x standaardplaat. Daarnaast moet een positieve controle worden opgenomen op elke plaat om de geldigheid van de plaat waarborgen.

Gewoonlijk duurt 3-4 uur met zes testplaten bereiden van een Pr / Pb source plaat; Het is mogelijk om twaalf petrischaal in één dag in een onderzoekslaboratorium. Aangezien elke menselijke IFN subtype testplaat onderzoekt zeventien Pr / Pb sets en geschikt vijftien proefmonsters, een dag van verzameling geeft een partij van platen met de capaciteit om te genereren tot 3060 experimentele gegevenspunten. Ruwe gegevens van de qRT-PCR platform kan worden verwerkt geassembleerd uit programmering scripts in een spreadsheet software een voorgedefinieerde analyse sjabloon automatisch vullen. Deze methode minimaliseert hands-on data entry, waardoor het voorkomen van het kopiëren fouten en stelt de onderzoeker zich richten op data-analyse plaats van gegevens montage. Zoals hier beschreven, kan deze high-throughput qRT-PCR worden toegepast om de expressie van interferon subtypes menselijke of rhesus macaque monsters gemeten en kan worden aangepast voor andere soorten of homologe genen sets. De flexibiliteit van de plaatindeling kan de gebruiker veranderen primer / probe sets voor de genen van maatbelang naar een bepaald celtype of modelsysteem. Deze test kan worden toegepast IFN expressie signaturen meten celcultuurmodellen studeren pathogenen of patiëntmonsters in het kader van ziektemodellen de signalering mechanismen van immuunrespons helderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2 ml PCR Tube Strips	Eppendorf (Westbury, NY, USA)	E0030 124 286
12-kanaals 384 Equalizer elektronische pipet, 0,5-12,5 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-139	*Discontinued
12-kanaals 384 Equalizer elektronische pipet, 1-30 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-137	*Discontinued
12-kanaals elektronische pipet, 5-250 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-118	*Discontinued
2.0 ml Micro Centrifuge buis, sterieel	Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)	229446
8-kanaals elektronische pipet, 15-1250 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-115	*Discontinued
Vloeibare reagent reservoirs	VWR International (Radnor, PA, USA)	89094-668	25mL reservoirs met 2 verdelers
E-Centrifuge	Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)	1090003
Eukaryotisch 18S rRNA (18S)	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	Hs99999901_s1	Rhesus HKG Primer/probe set
Fixed Speed Mini Vortexer	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	02-215-360
Gas doorlatende kleefplatenseal	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	AB-0580	Weggeef platenseal gebruikt tijdens het platen voorbereidingsproces
Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH)	FBR (Silver Spring, MD, USA)	Custom Order	Human HKG Primer/probe set
Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH)	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	Rh02621745_g1	Rhesus HKG Primer/probe set
Hudson Solo geautomatiseerde multikanaals pipettor	Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)	800200	Gemodificeerd met een 384-well koelnest
Lineaire plasmiden (IFN genen)	Aldevron (Fargo, ND, USA)	Custom Order	Item 3000, 3580; gebruikt voor assay standaarden
LNA remmers	Exiqon (Woburn, MA, USA)	Custom Order	Item 500100
LNA Probes	Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)	Custom Order	Materiaalnummer VC00023
Matrix Gefilterde Pipet Tips, 12,5 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-193
Matrix Gefilterde Pipet Tips, 30 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-196
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1.250 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-160
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ul	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-152
MicroAmp Optical 384-Well Reactie Plaat met Strijkcode	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	4309849
MicroAmp Optical 96-Well Reactie Plaat	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	4311971	Adhesive film gebruikt voor het verzegelen van de plaat voor de qRT-PCR run
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet	Microsoft (Redmond, WA, USA)	Office 2010	Visual Basic programmeertaal
MixMate Vortex Mixer	Eppendorf (Westbury, NY, USA)	5353 000.014	2 dimensionale plaat vortex apparaat
Molecular Beacon Probes	FBR (Silver Spring, MD, USA)	Custom Order
PCR Cooler, ijsvrije koude opslag systeem voor 96 well platen en PCR buizen	Eppendorf (Westbury, NY, USA)	Z606634-1EA
Plate Dryer (manifold)	Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)	Custom Order
Primer sets	FBR (Silver Spring, MD, USA)	Custom Order
pUC57 plasmid DNA	Genescript (Piscataway, NJ, USA)	SD1176
Rnase-vrije 1.5 ml Microfuge Tubes	Life Technologies (Grand Island, NY, USA)	AM12400
RNase-vrije DNase Set (50)	Qiagen (Valencia, CA, USA)	79254
RNase H	New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)	M0297L
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen (Valencia, CA, USA)	74106
Robot Tips (heldere tip voorgesteriliseerde pipet tips)	Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)	800350-S
Salmon Sperm DNA Solution	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	15632-011
SoftLinx Version V	Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)	Custom Order	Software voor het programmeren van pipetteringsstappen
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), geen AmpErase UNG	Life Technologies (Grand Island, NY, USA)	4352042
ABgene Adhesive Plate Seals	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	AB0580
Ubiquitin C (UBC)	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	Hs01871556_s1	Human HKG Primer/probe set
Verso cDNA synthese Kit	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	AB1453B
ViiA 7 Real-Time PCR Systeem	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	4453536
Water-Ultra Puur	Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)	351-029-101
Zipvap 384 (plate dryer verwarmingselement)	Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)	384-109A	Plate Dryer