Drijvende mammosfeer-assays kunnen de subset van stamcel-achtige borstkankercellen onderzoeken die overleven in suspensie-omstandigheden en verhoogde tumorigenese vertonen wanneer ze in muizen worden geïmplanteerd. Dit protocol biedt een handige in vitro maatstaf voor sfeervormingsvermogen, een proxy voor in vivo tumorigenese, terwijl het de analyse van het stamcel-geassocieerde transcriptionele landschap vergemakkelijkt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Net als bij gezonde weefsels, veel bloed en solide tumoren zijn nu gedacht aan hiërarchisch georganiseerd worden, met een subset van stamcellen-achtige kankercellen die zichzelf te vernieuwen, terwijl die aanleiding geven tot meer gedifferentieerde nageslacht. Het begrijpen en zich richten op deze kankerstamcellen bij borstkanker, die verbeterde chemo- en radio-weerstand ten opzichte van de niet-stam tumor bulk kunnen bezitten, is uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied. Markers zoals CD44, CD24 en ALDH activiteit kan beoordeeld worden met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om prospectief isoleren cellen die verbeterde tumorigeniciteit weergegeven wanneer geïmplanteerd in immunodeficiënte muizen: de mammosphere test ook worden veel gebruikt voor zijn vermogen om achteraf identificeren sphere- vormende cellen die zich ontwikkelen uit enkele stamcel-achtige klonen. Hier schetsen we benaderingen voor de juiste kweken van mammospheres uit cellijnen of primaire monsters van patiënten, hun passage, en berekeningen te schatten bol forming efficiëntie (SFE). Eerst bespreken we de belangrijkste overwegingen en valkuilen in de juiste planning en interpretatie van mammosphere experimenten.
Inleiding
Het bestaan van de tumor cellijnen onder leiding van de stam-achtige kanker stamcellen is sterk toegevoegd aan ons begrip van de tumor heterogeniteit. Terwijl sommige fenotypische diversiteit in tumoren komt voort uit de klonale uitgroei van genetisch verschillende klonen, verschijnt er een substantieel onderdeel te vloeien uit epigenetische verschillen: kankercellen kan (soms reversibel) overgang tussen stam, stamvader, en gedifferentieerde staten via activering of onderdrukking van specifiek gen expressie programma's 1-3. Dit kan cel intrinsieke of extrinsieke factoren weerspiegelen, die de genexpressie programma dat momenteel wordt uitgedrukt in een cel met de resulterende autocriene signalering in samenhang met paracrienen van naburige kanker, stromale of immuuncellen leveren modulerende factoren en microenviromental omstandigheden zoals de mate van hypoxie 2,4,5.
Hoewel innovatieve lineage tracing benaderingenrukken ons vermogen om vermeende kanker stamcellen bestuderen in hun in vivo niche 6-8, bol vorming assays steeds een populaire en handige op mogelijke borstkankercellen 'schatten gedragen als stamcellen, althans onder de assay omstandigheden. Het wordt vaak gebruikt naast achteraf werkwijzen voor het zuiveren van kanker stamcellen, hun expressie van membraan merkers CD44 en CD24 9 en activiteit van het enzym ALDH (aldehyde dehydrogenase) 10 markers die zijn voorgesteld overeenkwam met meer mesenchymal- en epitheliale -achtige kanker stamcellen respectievelijk 11. De bol vorming benadering werd eerst ontwikkeld als neurosphere assay, waardoor de groei van putatieve stamcellen uit één klonen in niet-hechtende, serumvrije omstandigheden met de toevoeging van epitheliale groeifactor (EGF) 12, later wordt nuttig toegepast om de normale en kankerachtige borstweefsel.
De identiteit van de bol vormende grondlegger cel en de gemengde celtypen waaruit de bol massa, zijn relevant voor de gevolgtrekkingen kunnen worden gemaakt van mammo- of andere bol vormende assays. Langlopende latente bot fide stamcellen, dacht te rusten in G0 fase, zal niet de ervaring van de precieze combinatie van factoren die activering in vivo zou bevoordelen. De mammosphere test plaats maakt de groei van cellen ofwel klaar voor mitotische deling of reeds verdelen 13. Deze progenitors, hoewel niet echt rustende cel, kan de cel stadium dat proliferates met EGF en basische fibroblast groeifactor (bFGF) mitogenen in de assay. Niettemin, ze bevatten een reeks van geactiveerde stamcellen geassocieerde signaaltransductiewegne 14. Bovendien is de snelheid van hun vorming betreft de tumorigeniciteit van het weefsel van opname van, gemeten door hun vermogen in beperkte verdunning assays muis xenotransplantaten 2,15,16 </ Sup>.
Hier geven we gedetailleerde protocollen enkele cellen isoleren en te kweken primaire mammospheres zowel humane borstkankercellijnen en klinische monsters van borsttumoren. We beschrijven ook hoe seriële passages van primaire mammospheres voeren om zelf-vernieuwing te beoordelen, en hoe te berekenen bol vormen efficiëntie die vergelijking over verschillende zaaien dichtheden (zie schema in figuur 1) mogelijk maakt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De onderstaande procedures zijn ethisch goedgekeurd door het Imperial College in Londen.
1. Generatie van Primaire Mammospheres van Human Breast Cancer Cell Lines
OPMERKING: Voer de volgende stappen onder een steriele cultuur kap.
- Bereid Mammosphere media DMEM / F12 aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine. Bereid compleet medium onmiddellijk vóór gebruik door toevoegen van 20 ng / ml recombinant humane epidermale groeifactor (EGF; Sigma), 10 ng / ml humaan recombinant basische fibroblast groeifactor (bFGF; R & D Systems) en 1 x B27 supplement.
- Zuig media van kolf met aanhangend MCF-7 of MDA-MB-231 cellen (of een borstkanker cellijn van uw keuze; 70-80% samenvloeiing), was twee keer in 1x PBS, en trypsinize cellen.
- Centrifugeer cellen bij 200 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Giet supernatant en resuspendeer cellen in 1-5 ml mammosphere media. Pipetop en neer en gebruik zo nodig een 40 micrometer cel zeefdop filter om eencellige suspensie te verkrijgen. Gebruik een hemocytometer te zorgen voor een enkele cel suspensie gevormd (niet genummerd, gebruik een 25 G naald aan de celsuspensie spuit tot 3 maal).
- Indien nodig, CD44 + CD24- cellen deelverzameling via FACS met anti-CD24-fycoerythrine (PE) en anti-CD44-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) monoklonale antilichamen 9. Alternatief, isoleren dergelijke populatie met een magnetische-geactiveerde celsortering (MACS) systeem met anti-CD44 en anti-CD24-biotine gecombineerde microbolletjes volgens de instructies van de fabrikant. Voeren positieve selectie met behulp van LS kolommen, en negatieve selectie met behulp van LD kolommen en bevestig de fenotypes van alle geïsoleerde cellen door flowcytometrie 17.
- Bereken het aantal levensvatbare cellen per ml met trypan blauw.
OPMERKING: Cellevensvatbaarheid wordt berekend als het aantal levensvatbare cellen gedeeld door het totale aantal cellen in de roosters op de hemocyTometer. Cellen die nemen trypaanblauw worden beschouwd als niet-levensvatbaar zijn. De volgende procedure wordt toegepast voor percentage levensvatbare cellen nauwkeurig bepalen.- Bereid een oplossing van trypan blauw in PBS 0,4%. Voeg 0,1 ml van trypan blue voorraadoplossing tot 1 ml cellen. Plaats een hemocytometer en onmiddellijk te onderzoeken onder een microscoop bij een lage vergroting. Tel het totale aantal cellen en het aantal blauwe kleuring cellen.
Levensvatbare cellen = [1,00 - (Aantal blauwe cellen ÷ Aantal totaal cellen)] × 100. - Om het aantal levensvatbare cellen per ml van de cultuur te berekenen, gebruik dan de onderstaande formule. Vergeet niet om te corrigeren voor de verdunningsfactor.
Aantal levensvatbare cellen × 10 4 × 1,1 = cellen / ml cultuur
- Bereid een oplossing van trypan blauw in PBS 0,4%. Voeg 0,1 ml van trypan blue voorraadoplossing tot 1 ml cellen. Plaats een hemocytometer en onmiddellijk te onderzoeken onder een microscoop bij een lage vergroting. Tel het totale aantal cellen en het aantal blauwe kleuring cellen.
- Resuspendeer een vooraf bepaalde hoeveelheid cellen in 2 ml compleet mammosphere medium in elk putje van een 6-well ultralage hechtende plaat. Het zaaien dichtheid is normaal gesproken 500-4,000 cellen / cm 2 cel per putje. Eventueel gebruik low attachment 24 putjes terwijl enten cellen bij dezelfde dichtheid in 0,5 ml medium.
OPMERKING: Wij raden aan de optimalisatie van het zaaien dichtheid en de tijd van de cultuur voor elke cellijnen van belang. - Incubeer ultra low-attachment 6-well platen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5-10 dagen (afhankelijk van de cellijn en de omvang van mammospheres) zonder de platen, vooral tijdens de groeifase van de eerste 5 dagen .
2. Generation of Primary Mammospheres van menselijke borstkanker klinische monsters
OPMERKING: Menselijke borstkanker weefsel kan worden verkregen van patiënten die een chirurgische ingreep voor de verwijdering van borsttumoren. WINKEL weefsel op ijs gedurende 24 uur in 50 ml steriele buizen in kweekmedium bevattende 100 U / ml penicilline en 100 U / ml streptomycine. Voer de volgende stappen onder een steriele cultuur kap.
- Breng het monster in een 100 mm petrischaal tissue met een klein volume media. Afneeme het vetweefsel met behulp van een steriele schaar, Scapel en pincet.
- Voeg 2-3 ml DMEM / F12 en gehakt van het monster in 1 mm 3 stuks met een steriele scapel of scheermesje tot er geen grote stukken blijven.
- Resuspendeer de weefselstukken in voorverwarmde 10 ml DMEM dat proteolytische enzymen (3000 U / ml collagenase en 1000 U / ml hyaluronidase) en incubeer bij 37 ° C in een roterende schudder totdat alle weefsel fragmenten worden gedigereerd. Meestal volledige vertering duurt 1-3 uur. Pas de spijsvertering tijd volgens pathologische tekens van tumoren. (Bijvoorbeeld borstadenocarcinoomcellijn is meestal moeilijker te verteren in vergelijking met mucineus carcinoom dat is meer kwetsbaar en moet korter spijsvertering tijd). Beoordeel de mate van vertering elk half uur door het observeren van 20 ui schorsing onder hemocytometer.
- Laat de fragmenten te sedimenteren gedurende 5 minuten, breng de bovenstaande vloeistof in een 15 ml conische polypropyleen buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur temtuur. Decanteren voorzichtig de supernatant en resuspendeer cellen in 1-5 ml mammosphere media.
- Volg de stappen 1.1-1.4 hierboven beschreven cellijnen te verkrijgen en plaat enkelvoudige celsuspensies. Passeren cellen door de 25 G maximaal 2 keer spuit indien nodig te beschadigen cellen te beperken.
3. Mammosphere Forming Efficiency (%) Berekening
- Na de kweekperiode, tel de mammospheres (groter dan 40 micrometer) diameter onder een microscoop bij een vergroting van 40x. Beeld digitaal 5 willekeurige velden met behulp van een digitale camera op een lichtmicroscoop en bepalen de mammospheres maat aan de hand van de acquisitie software. Gebruik geen software voor beeldanalyse.
- Bereken Mammosphere Vormen Rendement (MFE%) met de volgende vergelijking:
MFE (%) = (# van mammospheres per putje) / (# cellen per well) x 100
4. Serial passage van de Mammospheres voor de Beoordeling van Self-verlenging
- Pipette de media waarop de mammospheres uit elk putje in een 15 ml buis. Was de putjes met PBS en aan de verzamelde media. Centrifugeer bij 115 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ul voorverwarmde 0,5% trypsine / 0,2% EDTA. Incubeer gedurende 2-3 min.
- Voeg 500 ul van FCS trypsine te neutraliseren. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 100 ul mammospheres media, pipetteren op en neer om sferen disaggregeren.
- Tellen cellen met hemocytometer en bepalen of cellen in enkele celsuspensie. Indien niet door een 25 G spuit tot 3 keer om enkele cellen te verkrijgen. Zaad de cellen in een nieuwe ultra low-attachment 6-well plaat bij dezelfde dichtheid die bij de eerste generatie.
- Na 5-10 dagen, te tellen sferen> 40 micrometer en bereken bol vormen efficiency met behulp van de formule vóór gemeld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Verschillende monsters of die aan verschillende behandelingen kunnen variëren in het aantal mammospheres> 40 urn die ontstaan na normaliseren initiële cellen gezaaid. Bereken mammosphere vormende efficiëntie (MFE) voor elke behandeling gekweekt in drievoud. Dit maakt experimenten met verschillende dichtheden zaaien te vergelijken. Gegevens best weergegeven op een staafdiagram, idealiter met positieve en negatieve controles, en tonen de standaardafwijking over de drievoudige putjes. Consequent overdracht hechtende c...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Succesvolle evaluatie van de primaire en secundaire mammospheres vertrouwt op cellen worden uitgeplaat bij voldoende lage dichtheden die vorm mammospheres van enkele klonen, met minimale bol aggregatie. Maar op dichtheid te laag zijn, te weinig mammospheres kunnen vormen om de effecten van behandelingen statistisch onderscheiden. Zaaien dichtheid moet worden geoptimaliseerd voor elke cellijn gebruikt omdat ze aanzienlijk in hun bol vormen efficiëntie kan variëren (die uitdrukken lage E-cadherine kan minder stabiel en ko...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict bestaat dat kan worden gezien als nadelig voor de onpartijdigheid van dit artikel.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door de Keizerlijke BRC, het National Institute for Health Research, en kankerbestrijding met speciale vermelding voor Hilary Craft en Sir Douglas Myers.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Referenties
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59(2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209(2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281(2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
