Gebruik van de zachte agar Colony Formation Assay aan Remmers van tumorigeniciteit in borstkankercellen Identificeer

Samenvatting

Hier documenteren we het gebruik van de zachte agar-kolonievormingstest om de effecten van een peptidylarginine deiminase (PADI) enzymremmer, BB-Cl-amidine, op de tumorigeniteit van borstkanker in vitro te testen.

Samenvatting

Gezien de inherente moeilijkheden bij het onderzoeken van de mechanismen van tumorprogressie in vivo, blijven op cellen gebaseerde assays, zoals de soft agar kolonievormingstest (hierna genoemd de soft agar test), die het vermogen van cellen om te prolifereren in semi-solide matrixen meet, een handelsmerk van kankeronderzoek. Een belangrijk voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele 2D monolaag of 3D sferoïde celkweekassays is de nauwe mimicry van de 3D cellulaire omgeving zoals die in vivo wordt gezien. Belangrijk is dat de soft agar test ook een ideaal hulpmiddel biedt om de effecten van nieuwe verbindingen of behandelingscondities op celproliferatie en migratie rigoureus te testen. Bovendien maakt deze test de kwantitatieve beoordeling van het celtransformatiepotentieel mogelijk binnen de context van genetische verstoringen. We hebben recentelijk peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) geïdentificeerd als een potentiële borstkankerbiomarker en therapeutisch doelwit. Hier benadrukken we de bruikbaarheid van de soft agar test voor preklinische anti-kankerstudies door de effecten van de PADI-remmer, BB-Cl-amidine (BB-CLA), op de tumorigeniteit van humane ductale carcinoom in situ (MCF10DCIS) cellen te testen.

Inleiding

Zowel niet-getransformeerde (normale) als getransformeerde cellen kunnen gemakkelijk prolifereren in een 2D-monolayercultuur. Deze vorm van adherante celgroei verschilt aanzienlijk van wat zich voordoet in vivo waar, bij afwezigheid van mitogene stimulatie, cellen niet vaak snel delen binnen hun micro-omgeving. De zachte agartest daarentegen is anders dan 2D-kweeksystemen omdat het de tumorigeniteit kwantificeert door de mogelijkheid van een cel te meten om te prolifereren en kolonies te vormen in suspensie binnen een semi-solide agarosegel¹. In deze omgeving zijn niet-getransformeerde cellen niet in staat om snel te propageren bij afwezigheid van verankering aan de extracellulaire matrix (ECM) en ondergaan apoptose, een proces dat bekend staat als anoikis. Daarentegen verliezen cellen die een kwaadaardige transformatie hebben ondergaan hun verankeringsafhankelijkheid door activering van signaalroutes zoals fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt en Rac/Cdc42/PAK. Daarom zijn deze cellen in staat om te groeien en kolonies te vormen binnen de semi-solide zachte agarmatrix².

Een veelvoorkomend gebruik van de zachte agartest is om te testen of specifieke verbindingen, zoals PADI-remmers, in staat zijn om tumorgroei in vitro te onderdrukken. In het algemeen zijn kolonietelling of koloniegroottes kwantitatieve uitkomsten van de test die vergeleken kunnen worden tussen controle- en behandelingsgroepen om verschillen in cellulaire tumorigeniteit te beoordelen. Daarom kan er, als men vaststelt dat kolonievorming omgekeerd gecorreleerd is met een toenemende drugconcentratie, de conclusie worden getrokken dat de drug een effectieve remmer van tumorigeniteit in vitro is. Aan de andere kant, als de drug geen invloed heeft op de kolonievorming, dan is de drug ofwel niet in de juiste dosering ofwel is het geen effectieve tumorigene remmer. Afgezien van het gebruik van een zachte agartest om het anti-tumoreffect van een drug te testen, kan deze test ook worden gebruikt om de relatie tussen een specifiek gen en tumorigenese te onderzoeken. Bijvoorbeeld, het effect van het onderdrukken van PADI2-expressie op tumorigeniteit kan worden aangepakt door PADI2-specifieke siRNA-behandeling.

PADI's zijn calciumafhankelijke enzymen die eiwitten post-translationeel wijzigen door positief geladen arginineresiduen om te zetten in neutraal geladen citrulline in een proces dat bekend staat als citrullinering of deiminatie^3-5. We hebben onlangs ontdekt dat peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) mogelijk functioneert als een nieuwe borstkanker-biomarker en dat PADI-remmers kandidaat-therapieën vertegenwoordigen voor vroegstadium borstkanker⁶. Bijvoorbeeld, we hebben eerder aangetoond dat een 'pan-PADI'-remmer, Cl-amidine, de proliferatie van borstkankercellen onderdrukt met behulp van 2D-monolagen en dat de remmer de groei van 3D-tumorsferoïden onderdrukt⁶. In dit rapport breiden we deze studies uit, en benadrukken we het nut van de zachte agartest, door de werkzaamheid van een nieuwe PADI-remmer, BB-CLA, te testen bij het onderdrukken van de groei van MCF10DCIS-borstkankerkolonies⁷. We merken op dat we MCF10DCIS-cellen hebben gebruikt voor dit experiment omdat ze oncogeen zijn afgeleidingen van niet-getransformeerde humane MCF10A-cellen en omdat ze hoge steady state-niveaus van PADI2-eiwit bevatten⁸. We veronderstellen dat PADI2-enzymatische activiteit een sleutelrol speelt in de tumorigeniteit van deze cellijn en dat BB-CLA-gemedieerde remming van PADI2-activiteit kankerprogressie zal onderdrukken.

Protocol

1. Bereiding van 3% 2-hydroxyethyl Agarose

1. In een schone, droge 100 ml glazen fles, voeg 0,9 g 2-hydroxyethyl agarose (Agarose VII), gevolgd door 30 ml gedestilleerd water.
2. Magnetron het mengsel gedurende 15 sec en zachtjes wervelen. Herhaal deze stap ten minste nog drie keer tot de agarose poeder volledig oplost.
3. Autoclaaf de oplossing bevattende fles voor 15 min.
4. Laat de agarose oplossing afkoelen tot kamertemperatuur vóór verder gebruik. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.

2. Bereiding van de onderste laag: 0,6% agarosegel

1. Pre-warm verscheidene 5 ml en 10 ml pipetten in een 37 ° C incubator om te voorkomen dat de agarose stollen in de pipet bij het hanteren.
2. Gedeeltelijk draai de fles deksel en een magnetron de vooraf gemaakte 3% 2-hydroxyethyl agarose oplossing voor 15 sec. Vervolgens voorzichtig zwenken de oplossing en magnetron nog eens 15 sec. LET OP: Wees voorzichtig bij het wervelende de agarose oplossing omdat de oplossing stijgt bij blootstelling aan lucht en kan overslaan.
3. Als er overblijvende vaste gel in de fles, magnetron gedurende enkele seconden.
4. Houd de fles met de agarose oplossing in een 45 ° C waterbad tijdens de volgende stappen om de agarose oplossing voorkomen stollen voortijdig.
5. Warm MCF10DCIS media in een 37 ° C waterbad. Opmerking: MCF10DCIS media bestaat uit DMEM / F12, 5% paardenserum, 5% penicilline streptomycine.
6. Overdracht 3 ml van 3% agarose-oplossing met de voorverwarmde pipetten in een steriele 50 ml conische buis.
7. Onmiddellijk toevoegen 12 ml warm MCF10DCIS media en voorzichtig omkeren van de conische buis om de agarose met de media te mengen. Probeer om geen luchtbellen te vormen zoals het zal interfereren met de kolonie later tellen.
8. Voeg voorzichtig 2 ml van dit mengsel in elk putje van een 6-well cultuur plaat zonder vormen eventuele luchtbellen.
9. Incubeer de 6-well cultuur plaat horizontally op een vlakke ondergrond bij 4 ° C gedurende 1 uur om het mengsel stollen.
10. Nadat het mengsel vast wordt, plaatst de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 30 minuten. De onderste laag is nu klaar voor gebruik.

3. Bereiding van de Cell-bevattende laag: 0,3% agarosegel

1. Trypsinize MCF10DCIS cellen en verdun ze een celconcentratie van 4 x 10 ⁴ / ml.
2. Neem 2 ml van 3% agarose behulp voorverwarmd pipetten en over in een steriele 50 ml conische buis.
3. Onmiddellijk toevoegen 8 ml MCF10DCIS media om de conische buis en voorzichtig omkeren aan de agarose met de media te mengen. Vermijd de vorming van eventuele luchtbellen.
4. Neem 2 ml van de MCF10DCIS cellen (4 x 10 ⁴ / ml) en behandel met BB-CLA (0 uM (DMSO) en 1 uM).
5. In een 1: 1 verdunning, meng de cellen met 0,6% agarose.
6. Neem 1 ml van de cel-agarose mengsel en voeg voorzichtig op de onderste laag van de 6-well kweek plate (2 x 10 ⁴ cellen / ml).
7. Plaats de 6-well kweekplaat horizontaal op een vlakke ondergrond bij 4 ° C gedurende ten minste 15 minuten om de toplaag te stollen.
8. Nadat het mengsel vast wordt, plaatst de plaat in een 37 ° C incubator gedurende een week vóór het toevoegen van de voeding laag.

4. Voorbereiding van de Feeder laag: 0,3% agarosegel

1. Magnetron de vooraf gemaakte 3% 2-hydroxyethyl agarose oplossing voor 15 sec. Zwenk de oplossing en een magnetron voor nog eens 15 sec.
2. Equilibreer de agarose oplossing fles in een 45 ° C waterbad.
3. Verwarm de MCF10DCIS media in een 37 ° C waterbad.
4. Meng 1 ml 3% agarose oplossing 9 ml warm MCF10DCIS media in een 50 ml conische buis en voorzichtig omkeren om de agarose met de media te mengen. Vermijd de vorming van luchtbellen.
5. Behandel het mengsel BB-CLA (0 uM (DMSO) of 1 uM).
6. Voeg voorzichtig 1 ml van dit mengsel (zonder voorming bellen) in elk putje van de 6-well kweekplaat die de bodem en zachte lagen.
7. Plaats de 6-well kweekplaat horizontaal op een vlakke ondergrond bij 4 ° C gedurende ten minste 15 minuten om het mengsel stollen.
8. Nadat de feeder layer stolt, plaats de plaat in een 37 ° C incubator.
9. Herhaal deze procedure voeren wekelijks door overlaying 1 ml 0,3% agarose / medium / behandeling oplossing op de bestaande feeder laag om de cellen te vullen met nieuwe media tot kolonievorming wordt waargenomen. Opmerking: Agar in de zachte feeder lagen is zeer zacht en daarom wordt de extra voedingsstoffen uit de voederlaag gemakkelijk diffunderen in de cel-bevattende laag op de cellen te bereiken.

5. Data Collection

1. Na 2,5 weken van celgroei in zachte agar, tel het aantal kolonies in elk putje met behulp van een lichtmicroscoop. Om kwantificering te vergemakkelijken, drukt u een raster op een transparantie en bevestig het rooster aan de6-putjesplaat te bepalen waar de cellen tijdens het tellen. Aangezien kolonie grootte (zoals gekwantificeerd door de diameter van elke kolonie) variëren, vooraf instellen verwijzing koloniegrootte te bepalen welke kolonies worden gescoord. Bijvoorbeeld omvatten kolonie groottes van 70 micrometer of groter de gegevensanalyse.
2. Bewaar de monsters bij 4 ° C tot verdere vorming kolonie toekomstige tellen te voorkomen. Sluit de 6-well kweekplaat met Parafilm te voorkomen dat de gel uitdroogt.

Resultaten

De zachte agar kolonievorming test kan worden gebruikt voor een groot aantal toepassingen documenteren van de tumorigeniciteit van kankercellen. Een groot voordeel van deze techniek is dat de halfvaste matrix selectief bevordert de groei van cellen die kunnen prolifereren in een verankering-onafhankelijke wijze. Deze eigenschap is vooral vertoond door kankercellen, maar niet normale cellen. We gebruiken voornamelijk deze techniek om de effectiviteit van tumorgroei inhibitie testen van drugs en testen op het effect van o...

Discussie

De mate van kolonievorming in zachte agar varieert afhankelijk van het celtype ^9. Daarom is het aantal cellen te beginnen moet worden geoptimaliseerd en aangepast. Voorgestelde start bereik ligt tussen 5 x ^02-01 oktober x 10 ⁴ cellen per putje met behulp van een 6-wells plaat. Bovendien varieert koloniegrootte afhankelijk van de groeisnelheid van elke cel. Daarom wordt een vooraf gedefinieerde een cut-off voor kolonie maat die u nodig individuele kolonies voor downstream kwantitatieve an...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1