Vasculaire celfunctie is afhankelijk van de activiteit van intracellulaire boodschappers. Hier wordt een ex vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die de meting van intracellulaire calcium- en stikstofmonoxideniveaus mogelijk maakt in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli in individuele endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde aorta.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Calcium is een belangrijke regulator van veel fysiologische processen in vasculaire weefsels. De meeste endotheel- en gladde spier functies sterk afhankelijk van veranderingen in intracellulair calcium ([Ca2 +] i) en stikstofoxide (NO). Om te begrijpen hoe de [Ca 2+] i, NO en downstream moleculen worden behandeld door een bloedvat in reactie op vasoconstrictoren en vaatverwijders, ontwikkelden we een nieuwe techniek dat calcium-etikettering van toepassing is (of NO-etikettering) kleurstoffen met twee foton microscopie calcium handling (of NO-productie) in geïsoleerde bloedvaten te meten. Hier beschreven is een stap-voor-stap procedure die laat zien hoe een aorta te isoleren uit een rat, label calcium of NO in het endotheel of gladde spiercellen, en het beeld calcium transiënten (of NO-productie) met behulp van een twee-foton microscoop volgende fysiologische of farmacologische stimuli. De voordelen van de werkwijze zijn multi-fold: 1) Het is mogelijk om gelijktijdigely meten calcium transiënten in zowel endotheelcellen en gladde spiercellen in reactie op verschillende stimuli; 2) Het maakt het mogelijk om beeld endotheelcellen en gladde spiercellen in hun natieve omgeving; 3) Deze methode is zeer gevoelig voor intracellulair calcium of NO veranderingen en genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen; en 4) beschreven benadering kan worden toegepast op de meting van andere moleculen, zoals reactieve zuurstofsoorten. Samengevat, de toepassing van twee foton laseremissie microscopie calcium transiënten en NO productie in de endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde bloedvat verschaft hoogwaardige kwantitatieve gegevens en bevorderd ons begrip van de mechanismen reguleren bloedvaten te controleren.
Inleiding
Calcium is een essentiële tweede messenger in vasculaire cellen zoals endotheelcellen en gladde spiercellen. Het is de primaire stimulus voor vasculaire contractie en speelt een belangrijke rol bij vaatverwijding, inclusief de effecten bij NO productie in het endotheel. Door de beperkingen van beeldvormende technieken, is het vrijwel onmogelijk om calcium handling te observeren binnen de intacte vat. De ontwikkeling van twee foton imaging systemen en de creatie van nieuwe calcium of NO etikettering kleurstoffen, maakt het mogelijk om de afbeelding op een voldoende diepte en resolutie om te beginnen met calcium dynamiek en NO productie in het vaatstelsel te begrijpen.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan het Medical College of Wisconsin en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren.
1. Isolatie van de Rat Aorta
- Verdoven ratten met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) of een andere IACUC goedgekeurde methode.
- Plaats de rat in een liggende positie. Om de buikorganen bloot een kleine ventrale middellijn incisie door de huid en het subcutane abdominale weefsel. Met gaasjes voorzichtig buigen de darmen om de aorta en ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de bijdrage van calcium vasculaire fysiologie (vasodilatatie en vasoconstrictie) nauwkeurig te beoordelen, werd een protocol ontwikkeld om calcium kleurstoffen laden in zowel endotheelcellen en gladde spiercellen in geïsoleerde intacte aorta. De algemene experimentele opstelling getoond in figuur 1, toont de basisstrategie voor isolatie en bereiding van het vaartuig voor de beeldvorming. Kort na isolering van de aorta van de rat, moet worden gereinigd van vet en bindweefsel en in langsrichting doorge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Experimentele Overzicht. Om beter inzicht in de bijdrage van calcium en NO om vasculaire fysiologie, werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het meten van [Ca 2+] i en NO binnen gladde spier en endotheelcellen van geïsoleerde intacte aorta. Samen Dit protocol omvat de volgende kritische stappen: 1) Mechanische isolatie en bereiding (niet enzymatische afbraak) van het vat. Het is belangrijk dat het weefsel gezond en intact zoveel mogelijk optimale fysiologische opname bekomen houden. 2) Inc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Dr. William Cashdollar en de Northwestern Mutual Foundation Imaging Center op het Bloed Research Institute of Wisconsin voor hulp met de imaging studies. We danken ook Dr. Daria Ilatovskaya voor kritische lezing van dit manuscript en behulpzaam discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies HL108880 (AS) en DP2-OD008396 (AMG).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:saffier laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 tot 540 nm |
| 25× water-immersion objectieflens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 en werkafstand 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Andere basisreagentia | Sigma-Aldrich |
Referenties
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
