Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52734

⸱

10 juni 2015

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Human and Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin, 3Cardiovascular Center, Medical College of Wisconsin, 4Blood Research Institute of Wisconsin

In dit artikel

Samenvatting

Vasculaire celfunctie is afhankelijk van de activiteit van intracellulaire boodschappers. Hier wordt een ex vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die de meting van intracellulaire calcium- en stikstofmonoxideniveaus mogelijk maakt in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli in individuele endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde aorta.

Samenvatting

Calcium is een belangrijke regulator van veel fysiologische processen in vasculaire weefsels. De meeste endotheel- en gladde spier functies sterk afhankelijk van veranderingen in intracellulair calcium ([Ca2 +] i) en stikstofoxide (NO). Om te begrijpen hoe de [Ca 2+] i, NO en downstream moleculen worden behandeld door een bloedvat in reactie op vasoconstrictoren en vaatverwijders, ontwikkelden we een nieuwe techniek dat calcium-etikettering van toepassing is (of NO-etikettering) kleurstoffen met twee foton microscopie calcium handling (of NO-productie) in geïsoleerde bloedvaten te meten. Hier beschreven is een stap-voor-stap procedure die laat zien hoe een aorta te isoleren uit een rat, label calcium of NO in het endotheel of gladde spiercellen, en het beeld calcium transiënten (of NO-productie) met behulp van een twee-foton microscoop volgende fysiologische of farmacologische stimuli. De voordelen van de werkwijze zijn multi-fold: 1) Het is mogelijk om gelijktijdigely meten calcium transiënten in zowel endotheelcellen en gladde spiercellen in reactie op verschillende stimuli; 2) Het maakt het mogelijk om beeld endotheelcellen en gladde spiercellen in hun natieve omgeving; 3) Deze methode is zeer gevoelig voor intracellulair calcium of NO veranderingen en genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen; en 4) beschreven benadering kan worden toegepast op de meting van andere moleculen, zoals reactieve zuurstofsoorten. Samengevat, de toepassing van twee foton laseremissie microscopie calcium transiënten en NO productie in de endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde bloedvat verschaft hoogwaardige kwantitatieve gegevens en bevorderd ons begrip van de mechanismen reguleren bloedvaten te controleren.

Inleiding

Calcium is een essentiële tweede messenger in vasculaire cellen zoals endotheelcellen en gladde spiercellen. Het is de primaire stimulus voor vasculaire contractie en speelt een belangrijke rol bij vaatverwijding, inclusief de effecten bij NO productie in het endotheel. Door de beperkingen van beeldvormende technieken, is het vrijwel onmogelijk om calcium handling te observeren binnen de intacte vat. De ontwikkeling van twee foton imaging systemen en de creatie van nieuwe calcium of NO etikettering kleurstoffen, maakt het mogelijk om de afbeelding op een voldoende diepte en resolutie om te beginnen met calcium dynamiek en NO productie in het vaatstelsel te begrijpen.

Twee foton microscopie is onlangs toegepast in weefsels, organen en zelfs hele dierstudies vanwege zijn superieure vermogen om diep weefsels met lage achtergrond fluorescentie en hoge signaal gevoeligheid. 1,2 De smalle spectrum van twee foton excitatie bij het ​​Illumination knooppunt en het gebruik van niet descanned detectors zijn de redenen waarom er twee foton microscopie superieur aan traditionele confocale microscopie. Confocale microscopie kan geen beelden van hoge kwaliteit op de nodige weefsel diepte te wijten aan de auto-fluorescentie en de verstrooiing van out-of-focus licht in de confocale pinhole. Daarom hebben we een methode waarbij twee foton microscoop te meten [Ca 2+] i signalerings- en NO productie in intacte individuele bloedvat cellen met een hoge resolutie en een lage signaal-ruisverhouding ontwikkeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan het Medical College of Wisconsin en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren.

1. Isolatie van de Rat Aorta

  1. Verdoven ratten met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) of een andere IACUC goedgekeurde methode.
  2. Plaats de rat in een liggende positie. Om de buikorganen bloot een kleine ventrale middellijn incisie door de huid en het subcutane abdominale weefsel. Met gaasjes voorzichtig buigen de darmen om de aorta en vena cava bloot te leggen zoals weergegeven in figuur 1.
  3. Kort Blunt ontleden de aorta van het bindweefsel en de vena cava. Met hechtmateriaal, afhechten de aorta zo dicht mogelijk bij de nieren. Ontleden ongeveer 1-2 cm van de aorta en plaats deze in een 15 ml conische tuworden met normale fysiologische zoutoplossing (PSS, in mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, 4,5 KCl, 6 glucose, 10 HEPES) op ijs.
  4. Zodra de aorta is geïsoleerd, euthanaseren van de dieren volgens de goedgekeurde IACUC protocollen. Bij de voltooiing van alle niet-survival procedures euthanaseren diep verdoofde dieren door thoracotomie inducerende pneumothorax aan de humane ondergang van het dier te waarborgen. 3
  5. Met behulp van een dissectie microscoop, fijne punt pincet en microscissors ontleden het vet en bindweefsel af van de aorta. Zodra de aorta is schoon, snijd de aorta in de lengte en plaats het in de PSS op ijs voor later.

2. Dye laden en Incubation

  1. Pipetteer 7 pi van 1 mM Fluo-04:00 kleurstof, die wordt geleverd in DMSO gebaseerde oplossing, in afzonderlijke buizen die 500 ul werden afgedekt met aluminiumfolie. Bewaar in de vriezer bij -20 ° C tot de kleurstof eigenschappen in de tijd behouden. Let op: dus deze gealiquoteerdsingen moet stabiel zijn gedurende tenminste zes maanden.
  2. Voor gebruik kan de kleurstof oplossing opwarmen tot KT alvorens te openen. Bereid werkende oplossingen direct voor het gebruik. Laat de verdunde reagens voor later gebruik opslaan.
  3. Voeg 7 ul-klare 1 mM Fluo-04:00 kleurstof opgelost in DMSO oplossing tot 450 ul van PSS die geen calcium. Voeg 40 ul van niet DMSO gebaseerde 10% Pluronic Acid oplossing voor het laden cocktail om verspreiding van de acetoxymethyl (AM) esters en verbeterd laden van de calcium kleurstof.
  4. Plaats de ontleed aorta in de 500 ul buizen met het laden cocktail (zoals beschreven in 2.3) gedurende 1 uur. Bedek alle buizen met folie en plaats op een draaiende schudder bij RT.
  5. NO productie in de bloedvaten te controleren, gebruiken DAF-FM diacetaat kleurstof. Incubeer de aorta in een oplossing die 450 ul PSS, 40 ui pluronzuur en 5 ui 10 mM DAF FM-diacetaat. Vergelijkbaar met de calcium incubatie protocol (in 2.3 beschreven), plaatst u de aortaper 500 pl buis met de NO-kleurstofoplossing bedekt met folie en plaats op een roterende schudder gedurende 30 minuten bij 4 ° C gevolgd door volgende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Wanneer NO productie wordt gemeten met de endotheliale NO synthase blocker, L-NAME, NO productie blokkeren als controle zoals getoond in figuur 4B. Voor die procedure, toe te voegen aan cocktail (zoals beschreven in 2.5) 100 nM L-naam voor de laatste 30 min incubatie (bij RT).

3. Laser Scanning Twee foton microscopie Protocol

  1. Na 1 uur incubatie, was de aorta 2-3 maal in schone PSS op extracellulaire kleurstof te verwijderen.
  2. Breng de aorta naar een gesiliconiseerd schaaltje met hetzij normale PSS of Ca2 + -vrije buffer (afhankelijk van het experimentele protocol). Pin de aorta beneden op de siliconenlaag de adventitia in contact met de silicone (bijv endotheliale lumen blootgesteld aan de schotel opening) middels μ-vormige pinnen. Als alternatief gebruik maken van een Slice Anchorraster of lijm aan het weefsel te herstellen.
    Opmerking: Om stress en mogelijke mechanische artefacten, de overdracht te verminderen en vast te aorta in Ca 2+ -vrije oplossing en wacht 5-10 minuten vóór het begin van het experiment.
  3. Sluit een peristaltische pomp of een injectiespuit naar de siliconen-gecoate plaat voor automatische of handmatige toepassing van geneesmiddelen of voor het veranderen van de extracellulaire oplossing.
  4. Zet de schaal onder de neus stuk van de rechtopstaande twee-foton microscoop en installeer en plaats een 25 × (NA 1,05 en werkafstand 2 mm) water-immersie objectief boven het monster. Opmerking: Als deze specifieke lens niet verkrijgbaar objectieve vervaardigd voor twee foton beeldvorming omdat het signaalresolutie drastisch vergeleken met een gewone doel kan verhogen.
  5. Activeer de twee foton laser met de software (de laser begint te pompen en branden). Stem de laser excitatie tot 820 nm.
  6. Met behulp van epifluorescentie, zoek de aorta en de focus van de doelstelling ophet endotheel oppervlak met grove afstelling.
  7. Schakel de microscoop in twee foton laser scanning modus, zodat de excitatie laser geblokkeerde modus, de niet descanned detectors zijn ingeschakeld en de emissiefilters geschikt is voor de verwachte emissiespectra geïnstalleerd. Opmerking: Hier, de FV10-MRL / R (495-540 nM) gebruikt.
  8. Start levende scannen met ongeveer 5% laservermogen en fijn richten van de doelstelling om de endotheelcellen zichtbaar.
    Opmerking: de endotheelcellen zal een sterke fluorescerende signaal vertonen bij incubatie in normale PSS. Dit zal merkbaar zwakker zijn wanneer de schepen worden geïncubeerd in calcium-vrije buffer. De endotheelcellen aanwezig bovenop de geopende aorta en de gladde spiercellen te zien net onder de endotheelcellen (zie figuur 2) zijn. Doordat bloedvaten niet glad en zelfs, zullen er plaatsen waar zowel gladde spiercellen en endotheelcellen aanwezig zijn.
  9. Zodra de cellen zijn in focus, het programma van de microscoop software om opeenvolgende beelden in snelle scan mode (rasterscan, 512 x 512 pixel scherm met een frame collectie frequentie van 1,1 s) te verzamelen. Parallel met Fluo-04:00 fluorescentie, verzamel overgedragen lichtbeelden om veranderingen in vat krimp op te sporen en beter te visualiseren de experimentele condities.
  10. Na het verzamelen van de baseline signaal beelden, veranderen de Ca 2+ ion-concentratie in de externe oplossing of langzaam farmacologische stimulus agenten passen met behulp van de peristaltische pomp, terwijl beeldvorming. Let op de fluorescerende toename signaal binnen de beladen cellen.
    Opmerking: Endotheelcellen reageren op veranderingen in stroom, waardoor het aanbeveling lage laminaire toepassingen en testen voertuig te gebruiken voor het aanbrengen van farmacologische activators Ca2 + of NO signalering. Intracellulaire calcium aan nM concentratie waarden opnieuw te berekenen in schepen geladen met Fluo-4 (dissociatieconstante voor Fluo-4 is 345 nm), kan fluorescentie-intensiteit worden vastgelegd bij aanvang en na toevoeging van ionomycine en MnCl2. 4

4. Beeldverwerking en Berekeningen

  1. Download en installeer Fiji beeldverwerking pakket.
  2. Open het beeldbestand in Fiji. Bij het importeren van het bestand, splitsen de kanalen (doorgelaten licht en fluorescerende signaal) wanneer daarom wordt gevraagd. Uitsluitend het fluorescentiesignaal van de gegevensanalyse.
  3. Binnen de Fiji-programma, klikt u op het tabblad te analyseren en scroll naar beneden om de optie gereedschappen. Onder de optie gereedschappen, vindt het tabblad ROI manager zegt en klik op het; Een nieuw venster verschijnt.
  4. Na deze, klikt u op de set metingen onder het tabblad te analyseren. Selecteer de specifieke metingen van belang. Voor de calcium voorbijgaande metingen, gebruik maken van de grijze waarde optie gemiddelde.
  5. Met de ronde trace tool, beginnen aan de regio's van belang (ROI) te traceren en klik op "add" op de ROI manager scherm voor elke ROI. Zodra alle cellen van belang zijn getraceerd, in de ROI manager venster selecteert Multi Measure onder de "meer" tab. Vergeet niet om ofwel sla de metingen direct of kopiëren en plakken van al deze metingen in een spreadsheet.
  6. Open * .txt bestand of Excel spreadsheet van Fiji en de overdracht van de nummers naar een nieuwe Origin werkblad. Let op: U kunt ook gebruik maken van een programma zoals Sigma Plot of Prism voor verdere analyse.
  7. Binnen het programma Origin gebruiken Plot → Line + Symbol menu voor een overzicht van alle voorbijgaande reacties te observeren. Schakel het reageert cellen.
  8. Herberekenen trace nummer om tijdschaal (X-as), gebruik Column → Stel Kolom Waarden en vermenigvuldig de kolom trace nummer om de afbeelding collectie frequentie (in ons geval 1.1s).
  9. Gebruik Analyse → Statistieken over Rijen voor alle geselecteerde opnames te berekenen Mean (Y-as) en Standard Error trace. Plot laatste grafiek voor de huidige groep cellen Plot → Line + Symbol.
  10. Het mean calcium transient berekening wordt beschreven als volgt.
    1. Voor de totale calcium vrijlating binnen de Origin-programma, klik op Grafiek, gebruik dan het menu Analyse → Calculus → integreren. Totaal integraal van oppervlakte onder curve verschijnt in Resultaat Log.
    2. Voor voorbijgaande kinetiek, klik op Grafiek, gebruik dan het menu: Analyse → Niet-lineaire Curve Fit → Select Data Set (kies een X-as variëren van maximaal tot het einde van voorbijgaande reactie). Start Fitting → Select Function → exponentiële Decay 1 → Gereed.
      Opmerking: exponentiële montage verschijnt in Graph raam en Resultaat Log. Verkregen gegevens (waarden) vertegenwoordigen in totaal hoeveelheid calcium vrijgegeven, en kinetiek van de kanalen bemiddelde de voorbijgaande reactie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de bijdrage van calcium vasculaire fysiologie (vasodilatatie en vasoconstrictie) nauwkeurig te beoordelen, werd een protocol ontwikkeld om calcium kleurstoffen laden in zowel endotheelcellen en gladde spiercellen in geïsoleerde intacte aorta. De algemene experimentele opstelling getoond in figuur 1, toont de basisstrategie voor isolatie en bereiding van het vaartuig voor de beeldvorming. Kort na isolering van de aorta van de rat, moet worden gereinigd van vet en bindweefsel en in langsrichting doorge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Experimentele Overzicht. Om beter inzicht in de bijdrage van calcium en NO om vasculaire fysiologie, werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het meten van [Ca 2+] i en NO binnen gladde spier en endotheelcellen van geïsoleerde intacte aorta. Samen Dit protocol omvat de volgende kritische stappen: 1) Mechanische isolatie en bereiding (niet enzymatische afbraak) van het vat. Het is belangrijk dat het weefsel gezond en intact zoveel mogelijk optimale fysiologische opname bekomen houden. 2) Inc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. William Cashdollar en de Northwestern Mutual Foundation Imaging Center op het Bloed Research Institute of Wisconsin voor hulp met de imaging studies. We danken ook Dr. Daria Ilatovskaya voor kritische lezing van dit manuscript en behulpzaam discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies HL108880 (AS) en DP2-OD008396 (AMG).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DAF-FMLife TechnologiesD-23842
Fluo-4 AMLife TechnologiesF14217500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solutionSigma-AldrichP5556
L-NAMETocris0665
Olympus upright microscopeOlympusFluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL Spectra PhysicsTi:saffier laser 690nm — 1040nm
FiltersOlympusFV10-MRL/R 495 tot 540 nm 
25× water-immersion objectieflensOlympusXLPL25XWMPN.A. 1.05 en werkafstand 2 mm
Slice Anchor grid Warner Instrument SHD-27LH
Andere basisreagentia Sigma-Aldrich

Referenties

  1. Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
  2. Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
  3. Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
  4. Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
  5. Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
  6. Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
  7. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
  8. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
  9. Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
  10. Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
  11. Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
  12. Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
  13. Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
  14. Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
  15. Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
  16. Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
  17. Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Tweefotonmicroscopiecalciumimagingendotheelcellenfluorescerende kleurstoffenfluorescentie imagingbeeldbewerkingvasculaire functie
Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.