Methodenartikel

Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen

DOI:

10.3791/52741

⸱

13 juni 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Alberta, 2Montreal Neurological Institute and Hospital, McGill University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een geoptimaliseerde, goedkope en betrouwbare negatieve geotaxistest in Drosophila melanogaster als model voor neurodegeneratieve aandoeningen. Omdat deze test gevoeliger is voor lichte locomotieve defecten, zal deze helpen bij het screenen op mogelijke genetische interacties en doelwitten voor geneesmiddelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Locomotief defecten als gevolg van neurodegeneratieve aandoeningen kan een late onset symptoom van de ziekte zijn, na jaren van subklinische degeneratie, en dus de huidige therapeutische behandeling strategieën zijn niet curatief. Door het gebruik van exoom sequencing, een groeiend aantal genen geïdentificeerd die een rol spelen bij menselijke voortbeweging. Ondanks de identificatie van deze genen, is het niet bekend hoe deze genen cruciaal zijn voor normale werking loc. Daarom is een betrouwbare test, die modelorganismen gebruikt om de rol van deze genen te helderen om nieuwe targets te identificeren van therapeutisch belang, is meer dan ooit nodig. We hebben een gesensibiliseerd versie van de negatieve geotaxis test die het mogelijk maakt voor de detectie van mildere gebreken eerder en heeft de mogelijkheid om deze gebreken te evalueren in de tijd gemaakt. De test wordt uitgevoerd in een glazen maatcilinder, die is afgedicht met een was barrièrefilm. Door het verhogen van de drempel afstand te klom naar 17,5 cm en het verhogen van de duur van het experiment tot 2 min hebben we een grotere gevoeligheid bij het opsporen van milde disfuncties mobiliteit waargenomen. De test is kostenbesparend en vereist geen uitgebreide training op zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Dit maakt het een uitstekende techniek voor het screenen van kandidaat-medicijnen in Drosophila mutanten met motoriek gebreken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verwoestende neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofe laterale sclerose, en erfelijke spastische paraplegie worden steeds meer erkend. Helaas zijn de meeste van deze neurodegeneratieve aandoeningen nog steeds geen behandeling. Het wijdverspreide klinische toepassing van genoom-brede, onpartijdige genetische tests zoals exoom sequencing heeft geleid tot een toenemend aantal genen spelen een rol in humane reumatische ziektes. Ondanks deze vooruitgang, de pathologische voortgang van vroeg tot laat stadium, blijft ongrijpbaar in deze aandoeningen. Drosophila biedt een met de genetische tools voor het bestuderen van gen vereiste in een gecontroleerde ruimtelijke en temporele manier. Daarnaast heeft Drosophila nuttig bij het ​​screenen van drugs voor neurologische aandoeningen zoals Parkinson 1, Alzheimer 2, verstandelijke beperking 3,4- en 5,6 epilepsie oa bewezen. Ons doel was om een ​​rendabele ontwikkelingen betrouwbare test die zou hoge doorvoer analyse die nog steeds gevoelig genoeg is om kleine veranderingen in de motorische prestaties op te sporen zou zijn mogelijk te maken.

Er zijn verschillende assays gebruikt om de effecten van genetische mutatie en / of milieu vast op Drosophila klimgedrag kwantificeren. Het merendeel van de testen te profiteren van de natuurlijke neiging van vliegen te beklimmen, die bekend staat als negatief geotaxis, of het klimmen test. Benzer 7 voorgesteld in 1967 dat de tegenstroom apparaat voor de studie van phototaxis ook kan worden gebruikt om gravitaxis bestuderen. Sindsdien Ganetsky 8 en vele anderen 9 -12 hebben gebouwd op de eerste test. Het principe is om een ​​bekend aantal vliegen te plaatsen in een flesje en tik het flesje sterk tegen een hard oppervlak, waardoor de vliegen naar de bodem van de flacon te vallen. Aangezien het een aangeboren gedrag, zal de vliegen proberen te klimmen naar de top van de flacon, tegen de zwaartekracht. Deze test is kwantitatief en measures hoeveel vliegen hebben beklommen langs een marker op de flacon tijdens een toegewezen periode. Meting van de snelheid in plaats van het totale aantal vliegen klimmen is een betrouwbare parameter en getoond defecten wanneer het aantal vliegen criteria was niet significant 13.

The climbing assay is nuttig gebleken bij het ​​bestuderen van vele neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson 14. Echter, we opgemerkt dat locomotief gebreken niet detecteerbaar kan worden op tijd waar neurodegeneratie al wordt gezien in pathologische studies 14. Aldus kan het gebruik van de traditionele test de mogelijkheid om de vroege stadia van pathogenese te bestuderen beperken. Het uiterlijk van de locomotief defecten tijdens de latere stadia van de pathologie kan een ziekte waarvan de progressie is te geavanceerd voor volledige redding weerspiegelen.

Dit brengt het probleem met de gevoeligheid van de traditionele klimmen assay. De potentiële onvermogen van de tranele klimmen assay milde loc defecten detecteren te wijten aan de hoogte waarop de vliegen moeten klimmen. De traditionele assay 15,16 meet het aantal vliegen met succes klimmen over een hoogte van 2-5 cm in 10-20 sec.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek naar Drosophila melanogaster in overeenstemming was met de Universiteit van Alberta onderzoek richtlijnen.

1. Fly Collection

  1. Verzamel 20 vliegen met behulp van CO 2 (g) verdoving en plaats in een 25 mm x 95 mm verzameling flacon met voedsel.
  2. Store flesjes met vliegt horizontaal om te voorkomen dat het vangen van vliegen in alle vloeistoffen die kunnen zich ophopen in de bodem van de flacon.
  3. Incubeer vliegen gedurende ten minste 21 uur bij 22 ° C bij 45% vochtigheid in een incubator gedurende ongeveer 15 uur. Stel de incubator met een 12 uur licht: donker cyclus.

2. Climbing Assay

  1. De volgende ochtend, transfer 20 vliegt van één ampul in een 250 ml glazen maatcilinder. Markeer de positie van de cilinder te houden constant dagelijks. Gebruik een glazen cilinder per genotype om kruisbesmetting tussen de genotypen voorkomen. Wassen bij elke proef en rotate hen tussen genotypen.
    1. Het gedrag van de experimenten in omgevingslicht (of rood licht als er een potentieel defect in zicht) bij een temperatuur en vochtigheid van 22 ° C en 40% respectievelijk. Circadiane ritme verwarren voorkomen, altijd experimenten uit te voeren op hetzelfde tijdstip.
  2. Dicht de bovenste cilinder met een barrièrefilm (waslaag) om het ontsnappen van vliegen te voorkomen (Figuur 2).
  3. Stel de video camera op een statief. Focus camera op de 190 ml regel van de 250 ml maatcilinder (17,5 cm).
  4. Tel het aantal dode vliegen op de bodem van de cilinder en in het voedsel flesjes. Noteer dit nummer als de sterfte.
  5. Zeer licht tik op de cilinder tegen een gesloten cel foam pad herhaaldelijk met genoeg kracht om de vliegen te verplaatsen naar het binnenste onderste oppervlak. Tik 5-10 keer terwijl met de andere hand te drukken record op de camera.
  6. Druk op de "Record" knop op de camera.
  7. Start de video camera opnemen en tik op de cilinder zes keer in een uitgesproken niet-ritmisch patroon.
  8. Voer elke proef gedurende 2 minuten vanaf het moment dat de laatste vliegen worden afgetapt en registreer het aantal vliegen die de hoogte van 17,5 cm (190 ml) op elk tijdstip gekozen (kwantificeren iedere 10 sec). Opmerking: Het ml merkteken op de cilinder varieert van één cilinder model naar het andere afhankelijk van de diameter. Om fouten te voorkomen, meet de hoogte op elke cilinder gebruikt.
  9. Nadat de proef is beëindigd, gooi vliegen in 95% ethanol.
  10. Herhaal stap 2,1-2,9 totdat alle replicaten werden getest met verse vliegen elke keer.
    Noot: Hoewel 5 replicaten genoeg met een mutatie die een sterk effect op beweging kan zijn, 10 biologische replicaten van 20 vliegen (200 vliegen) aanbevolen om kleinere verschillen te detecteren.
  11. Na voltooiing van het experiment, was de cilinders in het lab vaatwasser en droge O / N te worden hergebruikt.

3. Analyse

  1. AnalyZe video's van elk vliegen proef. Elke 10 sec, nemen het totale aantal vliegen dat de doellijn passeert.
    1. Als een vlieg klimt terug naar beneden of daalt, record dat vliegen als -1 en tel de volgende vlieg op de doellijn te steken als het hetzelfde nummer als de vlieg die weer naar beneden geklommen of gedaald. Als bijvoorbeeld de 15 ste fly beneden de doellijn, de volgende vliegen de lijn (de 16 ste fly) wordt beschouwd als de 15 ste vliegen en niet de 16 ste steken.
  2. Trek de sterfte van het totale aantal vliegen (20) om het aantal vliegen die nog in het proces te verkrijgen. Op elk tijdstip, verkrijgen de fractie vliegen boven de doellijn.
  3. Plot elk percentage op elk tijdstip (zie figuur 3).
  4. Analyseer de prestaties op de 120 sec gegevenspunt en het uitvoeren student t-test bij 2 groepen aanwezig zijn of ANOVA en post-test voor meervoudige vergelijkingen (met Bonferroni aanpassing van geplande en ongeplande Tukey comparisons). De Kolmogorov-Smirnov test 17 ​​wordt ook uitgevoerd om normaliteit en gelijke verdeling bepalen maar ook om de verdelingen van de mutant groep te vergelijken met de controle.
  5. Om data over veroudering presenteren plot het percentage vliegen klimmen bij 120 sec met vliegen van verschillende leeftijden (2 dagen, 1 week, 2 weken) om te zien of er een progressieve tekort (figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klimmen is een sterke en reproduceerbaar gedrag. Inderdaad, een dag oud wild-type vliegt bereikt de doelgroep afstand klimmen prestaties snel (25 - 30 sec). Mutant vliegen presenteren een reeks van prestaties van mild (of vertraagd) onvermogen te klimmen naar het doel te voltooien. We illustreren dit hier met twee verschillende mutante allelen. De eerste is een ernstig allel van het gen spastin veroorzaakt door een deletie van het volledige spastin gen (spa 5,75) 18. In deze lijn (spas 5.75 met TM6...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila reeds bewezen een uitstekend model van de ziekte 14 en andere neurodegeneratieve aandoeningen Parkinson 1,2 zijn. Naast de genetische gereedschap in Drosophila, is het genoom in hoge mate geconserveerde genen die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen 19. De komst van genoomwijde genetische screening methoden (met inbegrip van exoom sequencing) is waarschijnlijk blijven een grotere lijst van kandidaat-genen geassocieerd met menselijke bewegingsstoornis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door een Team Grant van het Canadian Health Research Institute (CIHR) aan Dr. Bolduc (co-PI) en Dr. Guy Rouleau (PI). We willen Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, de leden van de University of Alberta fly club en Dr. Clayton Dickson bedanken voor hun hulp bij de ontwikkeling van de methode en statistische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Drosophila stocksDe stocks worden geselecteerd afhankelijk van de experimenten. De temperatuur en luchtvochtigheid in de kamer en in de incubator moeten worden gecontroleerd en consistent zijn om te voorkomen dat de vliegen te statisch of te nat zijn.
VideocameraElke digitale camcorder is voldoende. Zorg ervoor dat ze zich kunnen richten op nabije objecten.
Gradueerde cilinderKimble20028WVerschillende modellen van een gradueercilinder kunnen een andere diameter hebben. Het is daarom belangrijk om de hoogte te meten.
ComputerElk model is voldoende. We gebruikten de computer om het klimmen van de vliegen te monitoren en het aantal vliegen op elk tijdstip vast te leggen.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
  3. Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
  4. McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
  5. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. 187, 523-534 (2011).
  6. Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
  7. Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
  8. Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  10. Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
  11. Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
  12. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  13. Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
  14. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  15. Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799(2011).
  16. Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
  17. Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , 1st edn, Springer. (2006).
  18. Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429(2004).
  19. Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Genetics. 166, 835-881 (2004).
  20. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Genetics. 161, 1197-1208 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Climbing AssayDrosophila ModelNeurodegenerative DisordersNegative GeotaxisVideo AnalysisGlass Graduated CylinderWax Barrier FilmFly MortalityTime Point RecordingCandidate Drug Screening

Gerelateerde artikelen