Methodenartikel

Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen

DOI:

10.3791/52753

⸱

27 mei 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode voor het genereren van in vitro afgeleide mestcellen, hun engraftment in mastceldeficiënte muizen, en de analyse van het fenotype, aantallen en distributie van geïgrafeerde mestcellen op verschillende anatomische locaties. Dit protocol kan worden gebruikt om de functies van mestcellen in vivote beoordelen .

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mastcellen (MC's) zijn hematopoëtische cellen die zich in verschillende weefsels bevinden en vooral overvloedig aanwezig zijn op plaatsen die zijn blootgesteld aan de externe omgeving, zoals huid, luchtwegen en maagdarmkanaal. Vooral bekend om hun schadelijke rol in IgE-afhankelijke allergische reacties, zijn MC's ook naar voren gekomen als belangrijke spelers in gastheerverdediging tegen gif en binnendringende bacteriën en parasieten. MC-fenotype en -functie kunnen worden beïnvloed door micromilieufactoren die kunnen verschillen afhankelijk van de anatomische locatie en/of op basis van het type of stadium van ontwikkeling van immuunresponsen. Om deze reden hebben wij en anderen de voorkeur gegeven aan in vivo benaderingen boven in vitro methoden om inzicht te krijgen in MC-functies. Hier beschrijven we methoden voor het genereren van van beenmerg afgeleide gekweekte MC's (BMCMCs), hun adoptieve overdracht in genetisch MC-deficiënte muizen en de analyse van de aantallen en distributie van adoptief overgedragen MC's op verschillende anatomische locaties. Deze methode, genaamd de'mast cell knock-in'-benadering, is de afgelopen 30 jaar veel gebruikt om de functies van MC's en MC-afgeleide producten in vivote beoordelen . We bespreken de voordelen en beperkingen van deze methode, in het licht van alternatieve benaderingen die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mastcellen (MC's) zijn hematopoëtische cellen die ontstaan uit pluripotente beenmergfgenitatoren1-3. Na uitzetting van het beenmerg migreren MCs-voorlopers naar verschillende weefsels waar ze zich ontwikkelen tot volwassen MC's onder invloed van lokale groeifactoren1-3. Tissue-resident MC's bevinden zich strategisch op host-omgeving interfaces, zoals de huid, de luchtwegen en het maagdarmkanaal, waar ze zich gedragen als een eerste verdedigingslinie tegen externe beledigingen3-6. MC's worden vaak subgeklasseerd op basis van hun "baseline" fenotypische kenmerken en hun anatomische locaties. Bij muizen zijn twee soorten MC's beschreven: "bindweefsel-type" MC's (CTMCs) en mucosale MC's (MMC's)1-3,7,8. CTMCs bevinden zich vaak rond venules en in de buurt van zenuwvezels en bevinden zich in serosale holtes, terwijl MMC's intra-epitheliale locaties in de darm en het ademhalingsslijmvlies1-3bezetten.

Talrijke methoden zijn toegepast om biologische functies van MC 's9-13te bestuderen . Veel groepen hebben zich gericht op in vitro benaderingen met behulp van cellijnen (zoals de menselijke MC-lijnen HMC114 of LAD215,16),in vitro afgeleide MC's (zoals menselijke perifere bloedafname MC's17, of muis beenmerg-afgeleide gekweekte MC's [BMCMCs]18, foetale huid-afgeleide gekweekte MC's [FSCMC's]19 en peritoneale cel-afgeleide MC's [PCMC's] Al deze modellen worden veel gebruikt om moleculaire details van MC-biologie te bestuderen, zoals signaleringsroutes die betrokken zijn bij MC-activering. Een belangrijk aspect van de MCs-biologie is echter dat hun fenotypische en functionele kenmerken (bijv.cytoplasmatisch granulaat proteasegehalte of reactie op verschillende stimuli) kunnen worden gemoduleerd door anatomische locatie en micromilieu2,7. Aangezien de exacte mix van dergelijke factoren die in vivo worden aangetroffen moeilijk in vitrokan worden gereproduceerd , geven wij de voorkeur aan het gebruik van in vivo benaderingen om inzicht te krijgen in MC-functies9.

Er bestaan verschillende muizenstammen met genetisch MC-deficiëntie, zoals de veel gebruikte WBB6F1-Kit W/W-v of C57BL/6-Kit W-sh/W-sh muizen. Deze muizen missen expressie en/of activiteit van KIT (CD117), de receptor voor de belangrijkste MC groeifactor stamcelfactor (SCF)21,22. Als gevolg hiervan hebben deze muizen een ernstig MC-tekort, maar hebben ze ook extra fenotypische afwijkingen die verband houden met hunc-kitmutaties (in de WBB6F1-Kit W/W-v muizen) of met de effecten van de grote chromosomale inversie die resulteert in verminderde c-kit expressie (in de C57BL/6-Kit W-sh/W-sh muizen)9,10,12,23. Meer recentelijk zijn verschillende muizenstammen metc-kit-onafhankelijke constitutieve MC-deficiëntie gemeld24-26. Al deze muizen en enkele extra nieuwe soorten inductieve MC-deficiënte muizen zijn onlangs in detail beoordeeld9,10,13.

Hier beschrijven we methoden voor het genereren van van beenmerg afgeleide gekweekte MC's (BMCMCs), hun adoptieve overdracht in MC-deficiënte muizen en de analyse van de aantallen en distributie van adoptief overgedragen MC's op verschillende anatomische locaties. Deze zogenaamde "mast cell knock-in"-methode kan worden gebruikt om de functies van MC's en MC-afgeleide producten in vivote beoordelen . We bespreken de voordelen en beperkingen van deze methode, in het licht van alternatieve benaderingen die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en met de specifieke goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van Stanford University.

1. Generatie en karakterisering van van beenmerg afgeleide gekweekte mestcellen (BMCMCs).

Opmerking: Donor BMCMCs moeten worden gegenereerd uit beenmergcellen met dezelfde genetische achtergrond als de ontvangende MC-deficiënte muizen. Mannelijke donor BMCMCs zijn niet geschikt voor engraftment van vrouwelijke muizen. Vrouwelijke donor BMCMCs zullen met succes in zowel mannelijke als vrouwelijke ontvangers worden gesengrafeerd.

  1. Beenmergextractie.
    1. Giet steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in 6 putkweekplaat (1 put per muis) en leg op ijs.
    2. Week de dissectie-instrumenten in 70% ethanol voor sterilisatie.
    3. Euthanaseer donormuizen door inademing van kooldioxide (CO2),gevolgd door cervicale dislocatie, en besproei de muizen vervolgens met 70% ethanol op de plaatsen van manipulatie.
    4. Gebruik steriele dissectie-instrumenten om de botten van het dijbeen, het scheenbeen en het kuitbeen te extraheren zonder botepifysen te snijden.
    5. Terwijl u de botten met een tang vastzetten, schraapt u al het weefsel van de botten af (en gooit u kuitbeen weg) met een steriele schaar (of scalpelbladen). Leg de botten in PBS op ijs totdat alle botten zijn verzameld.
    6. Voer alle resterende stappen uit in de steriele weefselkweekkap. Met behulp van steriele instrumenten, beveilig botten met een tang en snijd beide epifysen af om de medullaire holte bloot te leggen.
    7. Gebruik 3 ml spuiten en 30 G naalden en koud spoelmiddel (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] aangevuld met 10% foetale kalfsserum [FCS, warmte-geactiveerd], 2 mM L-glutamine, 1% antibiotica-antimycotische oplossing, 50 μM Β-mercaptoethanol), spoel het rode beenmerg in een Petrischaal.
    8. Gebruik dezelfde spuit om doorgespoelde beenmergcelclusters te ontkoppelen door herhaalde zachte aspiratie en ejectie.
    9. Pool femur en tibiaal beenmerg van elke muis in één centrifugebuis van 15 ml. Vul de buis met koud spoelmiddel om beenmergcellen te wassen en centrifugeer op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
  2. BMCMCs Cultuur.
    1. Verwijder supernatant en herstel geplet beenmergcellen in 10 ml kweekmedium (DMEM aangevuld met 10% foetale kalfsserum [FCS, warmte-inactivated], 2 mM L-glutamine, 1% antibioticum-antimycotische oplossing, 50 μM Β-mercaptoethanol en 20% WEHI-3 celgeconditioneerd medium [als bron van IL-3; of gebruik recombinant IL-3].
    2. Plaats cellen in weefselkweekkolf van de juiste grootte(bijv.T25 voor 1 muis, T75 voor 2 muizen, enz.).
    3. Breng 1-2 dagen na het plateren van cellen medium- en suspensiecellen (waardoor vuil en aanhangende cellen aan de bodem van de kolf blijven plakken) over naar een nieuwe kolf en voeg vers kweekmedium (10 ml/muis) toe.
    4. Voer in de volgende weken elke 3-4 dagen cellen (voeg 10 ml kweekmedium per muis toe). Houd de celdichtheid tussen 2,5 x 105-1 x 106 cellen/ml. Breng niet-aanhechtende cellen eenmaal per week over in een nieuwe kolf totdat er geen aanhangcellen in de kweekkolf aanwezig zijn. Test de rijpheid van cellen (zie hieronder) voor gebruik voor in vitro tests of engraftment bij MC-deficiënte muizen.
      OPMERKING: Volledige differentiatie van BMCMCs duurt 4-6 weken.
  3. Beoordeling van de volwassenheid van bmcmc.
    1. Met behulp van flow cytometrie.
      1. Was cellen (5 x 104-5 x 105 cellen/conditie) met ijskoude FACS buffer (PBS, 0,5% FCS) in 5 ml polystyreen ronde bodembuis. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Aspireer supernatant.
      2. Verdun antimuis CD16/32 (kloon 93 of 2,4G2) monoklonale antilichamen 1:200 (2,5 μg/ml) in FACS-buffer. Voeg 10 μl toe aan elke pellet en resuspend door korte vortexing. Incubeer 5 minuten op ijs om fc binding te blokkeren.
        OPMERKING: Bescherm monsters tegen direct licht voor alle resterende stappen.
      3. Verdun fycoerythrine (PE) geconjugeerde antimuis Fc εRI α (kloon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) en fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerde antimuisKIT (CD117; kloon 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("kleuringsoplossing"), of de respectievelijke gelabelde isotypecontrole.
      4. Splits de helft van de geblokkeerde cellen van stap 1.3.1.2) in een extra polystyreen ronde bodembuis en voeg 20 μl "kleuroplossing" toe in één buis en 20 μl "isotypecontroleoplossing" in de andere buis. Incubeer 30 minuten op ijs.
      5. Voeg 3 ml ijskoude FACS-buffer toe en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi supernatant weg en resuspend de pellet in 300 μl FACS-buffer met 1 μg/ml propidiumjodide (PI, voor identificatie van dode cellen). Ga verder met de analyse van de stromingscytometrie (zie figuur 2A).
    2. Met behulp van toluidine blauwe kleuring.
      1. Was eenmaal 1 x10 5 cellen met PBS door centrifugeren op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en aspireer en resuspend cellen in 200 μl PBS.
      2. Breng de celsuspensie over in een voorbereid cytofunnel bevestigd aan een microscoopschuif en ga verder met cytocentrifugatie met behulp van een cytocentrifuge (40 x g gedurende 5 min).
      3. Droog aan de lucht gedurende 10 minuten en teken een wascirkel rond cellen met behulp van een PAP-pen. Voeg 0,1% Toluidine blauwe oplossing toe om de cellen te bedekken. Incubeer gedurende 1 min. Was dia's in stromend leidingwater gedurende 1 min en droog vervolgens 10 min.
      4. Coverslip cellen met behulp van montagemedium. Ga verder met lichtmicroscoopanalyse (zie figuur 2B)

2. Engraftment van Mast Cell-deficiënte Muizen met BMCMCs.

  1. Oor engraftment door intradermale (i.d.) injectie.
    OPMERKING: Voor de adoptieoverdracht van BMCMC's in de oorpinnae van MC-deficiënte muizen, raden we aan om twee injecties van elk 1 x10 6 cellen (voor een totaal van 2 x 106 cellen) per oorpinna uit te voeren. Intradermale engraftment van BMCMCs in de oorpinnae van MC-deficiënte muizen is door veel onderzoekers gebruikt in verschillende modellen, waaronder modellen van passieve cutane anafylaxie (PCA)24,27, gastheerverdediging tegen gif28, en chronische overgevoeligheid (CHS) reacties29,30.
    1. Tel en resuspend cellen bij 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/25 μl) in koude DMEM. Breng bmcmc's-oplossing over in een spuit van 1 ml die is uitgerust met een naald van 30 G. Blijf op ijs tot injectie.
    2. Verdoof 4-6 weken oude MC-deficiënte muizen met isofluraan (2,5% v/v). Controleer de diepte van de anesthesie door teenknijpen, pas isofluraan aan indien geïndiceerd en blijf de ademhaling en de knijprespons van de teen gedurende de hele procedure controleren. Breng oogzalf aan met een Q-tip om uitdroging van de ogen te voorkomen.
    3. Creëer met de wijsvinger verticale druk op het dorsale gezicht van de oorpinna om het ventrale gezicht bloot te leggen en uit te rekken.
    4. Voer twee 25 μl i.d. injecties van BMCMC-oplossing uit op twee verschillende plaatsen van het ventrale vlak van de oorpinna, de eerste injectie in het midden van het oor en de tweede injectie in de richting van de punt van de oorpinna. Wacht 4-6 weken na i.d. engraftment voordat u in vivo experimenten uitvoert.
      Opmerking: Onze ervaring is dat tegen die tijd het aantal MC's/mm2 dermis in het centrale deel van de oorpinna over het algemeen vergelijkbaar is met dat op de overeenkomstige locatie bij muizen van het wilde type, terwijl het aantal MC's/mm2 in de periferie van de oorpinnae doorgaans aanzienlijk lager is dan dat in de overeenkomstige wilde muizen27,28. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het ontwerpen van experimenten met dergelijke MC-engrafted muizen(bijv.middelen met mogelijke effecten op de MC-functie moeten in het centrale deel van de oorpinnae worden geïnjecteerd, en de analyse van de effecten van dergelijke behandelingen moet zich ook op dat gebied richten).
  2. Peritoneale holte engraftment door intraperitoneale (i.p.) injectie.
    OPMERKING: Adoptieve overdracht van BMCMCs in de peritoneale holte van MC-deficiënte muizen vereist één injectie van 2 x 106 cellen per muis. Dergelijke i.p. injecties van BMCMCs in MC-deficiënte muizen zijn door veel groepen gebruikt om de rollen van peritoneale MC's in verschillende modellen te bestuderen, waaronder modellen van gastheerverdediging tegen gif31 of bacteriële sepsis32,33.
    1. Tel het juiste aantal cellen en resuspend bij 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/200 μl) in koude DMEM. Breng bmcmc's-oplossing over in een spuit van 1 ml die is uitgerust met een naald van 25 G. Blijf op ijs tot injectie.
    2. Voer 1 injectie van 200 μl BMCMCs-oplossing uit in de peritoneale holte van 4-6 weken oude MC-deficiënte muizen. Wacht 4-6 weken na i.p. engraftment voordat u in vivo experimenten uitvoert.
  3. Engraftment door intraveneuze (i.v.) injectie.
    OPMERKING: Adoptieve overdracht van BMCMCs door i.v. injectie in MC-deficiënte muizen vereist één injectie van 5 x 106 cellen per muis. Intraveneuze (i.v.) injecties van BMCMCs in MC-deficiënte muizen zijn door veel groepen gebruikt om de rol van MC's in verschillende ziektemodellen te bestuderen, waaronder modellen van blaasontsteking34, astma35, longfibrose36en antilichaamgemedieerde artritis37.
    1. Tel het juiste aantal cellen en resuspend bij 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) in koude DMEM. Breng bmcmc's-oplossing over in een spuit van 1 ml die is uitgerust met een naald van 30 G. Blijf op ijs tot injectie.
    2. Verdoof 4-6 weken oude MC-deficiënte muizen met isofluraan (2,5% v/v). Controleer de diepte van de anesthesie door teenknijpen, pas isofluraan aan indien geïndiceerd en blijf de ademhaling en de knijprespons van de teen gedurende de hele procedure controleren. Breng oogzalf aan met een Q-tip om uitdroging van de ogen te voorkomen.
    3. Voer één injectie van 200 μl BMCMC-oplossing uit in de staartader (of, als alternatief, de retro-orbitale ader) van een MC-deficiënte muis. Wacht 12 weken na i.v. engraftment voordat u in vivo experimenten uitvoert.

3. Analyse van engrafted mastceldeficiënte muizen.

  1. Oor engraftment analyse.
    1. Aan het einde van het experiment euthanaseert u muizen door CO2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie.
    2. Isoleer de oorpinnae en fixeer in 10% (vol/vol) gebufferd formaline 's nachts bij 4 °C. Sluit vaste oorpinnae in paraffine, snijd 4 μm delen oorpinnae en monteer op glazen dia's.
    3. Bevlek de dia's met een 0,1% Toluidine blauwe oplossing gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Was dia's 1 minuut in kraanwater en droog de dia's vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur.
    4. Coverslip dia's met behulp van montagemedium, tel vervolgens het aantal gegrafeerde MC's per pinnae-secties met behulp van een lichtmicroscoop. Evalueer de engraftmentefficiëntie door het percentage en de verdeling van MC's in de oorhuid van gegrafeerde muizen te vergelijken met wilde muizen.
  2. Peritoneale holte engraftment analyse.
    1. Evaluatie van het aantal mestcellen in de buikholte.
      1. Aan het einde van het experiment euthanaseert u muizen door CO2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. Verwijder voorzichtig de ventrale huid van de muizen zonder de peritoneale holte te breken.
      2. Injecteer 5 ml PBS op koude of kamertemperatuur in de buikholte met een spuit van 5 ml die is uitgerust met een naald van 25 G. Gebruik koude PBS om het risico op het activeren van peritoneale cellen te verminderen (dit is erg belangrijk bij het evalueren van peritoneale MC-degranulatie of niveaus van sommige MC-afgeleide producten in de peritoneale lavagevloeistof). Voer een massage van de buik gedurende 20 seconden uit om peritoneale cellen te oogsten.
      3. Aspireer langzaam de peritoneale lavage met behulp van een spuit van 5 ml die is uitgerust met een naald van 22 G. Registreer het volume van de aangezogen lavage (verwacht tot 80% van het geïnjecteerde volume te herstellen).
      4. Breng peritoneale lavagevloeistof over in een ronde bodembuis van 5 ml polystyreen en centrifugeer gedurende 5 min bij 4 °C op 4°C. Aspireer supernatant. Herstel de pellet in 400 μl koude PBS.
      5. Tel het totale aantal peritoneale cellen met behulp van een hemocytometerkamer. Gebruik de helft van de celsuspensie voor een flowcytometrieanalyse (zoals beschreven in stap 1.3.1), om het percentage en de markerexpressie van gegrafeerde MC's in de peritoneale holte te evalueren. Vermenigvuldig het totale aantal peritoneale cellen met het percentage MC's om het absolute aantal peritoneale MC's te verkrijgen.
      6. Voer een cytocentrifugatie uit met de resterende cellen zoals beschreven in stap 1.3.2.2. Droog aan de lucht gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en teken een wascirkel rond cellen met behulp van een PAP-pen.
      7. Bedek cellen met onverdunde May-Grünwald Kleuroplossing gedurende 5 minuten, gevolgd door 5 minuten wassen in PBS, beide op kamertemperatuur. Bedek cellen met Giemsa-vlek verdund 1:20 met gedeï gedeïdentealiseerd water en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur. Was dia's 2 keer in kraanwater gedurende 1 minuut en droog vervolgens de glijbanen aan de lucht.
      8. Bedekt cellen met behulp van montagemedium en bereken het percentage gegrafeerde MC's met behulp van een lichtmicroscoop (door ten minste 400 totale cellen te tellen). Evalueer de engraftment-efficiëntie door het percentage MC's in de peritoneale lavage van gegrafeerde muizen te vergelijken met wilde muizen.
    2. Evaluatie van mestcellen in de mesenterische ramen.
      1. Na de peritoneale lavage beschreven in stap 3.2.1, snijdt u het peritoneale membraan open om het darmkanaal van de muizen bloot te leggen. Plaats 4 tot 5 mesenterische vensters per muis op een dia.
      2. Bevestig de dia's gedurende 1 uur in Carnoy-oplossing (3:2:1 vol/vol/vol ethanol, chloroform en ijsazijnzuur) bij kamertemperatuur. Luchtdroge dia's en verwijder de darm (de vaste mesenterische ramen blijven aan de dia's bevestigd).
      3. Beits de preparaten gedurende 20 minuten op kamertemperatuur met Csaba (Alcian blue/Safranin O) kleuroplossing.
        1. Om 500 ml Csaba-vlek te maken, bereidt u 500 ml acetaatbuffer door 100 ml 1 M natriumacetaatoplossing te mengen met 120 ml 1 M HCl. Maak tot 500 ml met gedeioneerd water en stel de pH in op 1,42. Los vervolgens 90 mg Safranin [identificeert 'volwassen MC's' in rood], 1,8 g Alcisch blauw [identificeert 'onrijpe MC's' in blauw] en 2,4 g ijzer ammoniumsulfaat NH4Fe(SO4)2 in 500 ml acetaatbuffer.
      4. Coverslip dia's met behulp van montagemedium, tel vervolgens het aantal geïmgrafeerde MC's per mesenterisch venster met behulp van een lichtmicroscoop. Evalueer de engraftmentefficiëntie door het percentage en de verdeling van MC's in de mesenterische vensters van geïmgrafeerde muizen te vergelijken met wilde muizen.
  3. I.v. engraftment analyse.
    1. Aan het einde van het experiment euthanaseer muizen door CO2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie, en oogst weefsel van belang(bijv. long, huid of milt) en fixeer 's nachts in 10% (vol / vol) gebufferd formaline bij 4 °C.
    2. Sluit vaste weefsels in paraffine in, snijd 4 μm secties en monteer op glazen dia's. Bevlek de dia's met een 0,1% Toluidine blauwe oplossing gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Was dia's 1 minuut in kraanwater en droog vervolgens 10 minuten aan de lucht.
    3. Coverslip dia's met behulp van montagemedium en evalueren het aantal en de verdeling van gegrafeerde MC's per weefselsectie met behulp van een lichtmicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een overzicht van de 'mastcel knock-in' benadering is weergegeven in figuur 1, en omvat de generatie van BMCMCs, het aantal cellen dat i.p., i.d. of i.v. moet worden gegrafeerd in MC-deficiënte muizen (het aantal kan worden gevarieerd indien aangegeven op basis van het experimentele ontwerp) en het interval tussen engraftment en experiment afhankelijk van de injectieplaats (dit interval kan ook variëren, indien aangegeven; b.v., neemt het gehalte aan opgeslagen mediatoren in MC cytoplas...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bijna 30 jaar na de oorspronkelijke beschrijving38blijft de'mast cell knock-in '-benaderingwaardevolle informatie verschaffen over wat MC 's wel of niet in vivokunnen doen . Lang werd gedacht dat de functies van MC's beperkt waren tot hun rol bij allergie. Gegevens die zijn gegenereerd met behulp van de'mast cell knock-in'-benaderinghebben deze visie veranderd, door bewijs te leveren dat MC's onder andere een cruciale rol kunnen spelen in de verdediging van de gastheer tegen bepaalde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.G. is de ontvanger van beurzen van de Franse "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" en de Philipp Foundation; R.S. wordt ondersteund door de Lucile Packard Foundation for Children's Health en het Stanford NIH/NCRR CTSA award nummer UL1 RR025744; P.S. wordt ondersteund door een Max Kade Fellowship van de Max Kade Foundation en de Austrian Academy of Sciences en een Schroedinger Fellowship van het Austrian Science Fund (FWF): J3399-B21; S.J.G. erkent steun van National Institutes of Health grants U19 AI104209, NS 080062 en van Tobacco-Related Disease Research Program aan de Universiteit van Californië; L.L.R. erkent steun van de Arthritis National Research Foundation (ANRF) en National Institutes of Health grant K99AI110645.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1% Antibiotic-Antimycotic SolutionCorning cellgro30-004-Cl
3 ml SyringeFalcon309656
35 mm x 10 mm DishCorning cellgro430588
5 ml Polystyrene Round Bottom TubeFalcon352058
Acetic Acid GlacialFisher ScientificA35-500
Alcian Blue 8GXRowley Biochemical Danver33864-99-2
Allegra 6R CentrifugeBeckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) PurifiedeBioscience14-0161-81
2-MercaptoethanolSigma AldrichM7522
BD 1 ml TB SyringeBD Syringe309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) NeedlesBD Precision Glide Needle205155
BD 25 G 5/8 NeedlesBD Syringe305122
BD 30 G x 1/2 NeedlesBD Precision Glide305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical TubeFalcon352097
ChloroformFisher ScientificC298-500
Cytoseal 60 Mounting MediumRichard-Allan Scientific8310-4
Cytospin3ShandonNA
DakoCytomation penDakoS2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1xCorning cellgro15-013-CM
EthanolSigma AldrichE 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat InactivatedSigma AldrichF4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype ControleBioscience14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)eBioscience11-1171-82
FormaldehydeFisher ScientificF79-500
Giemsa Stain ModifiedSigma AldrichGS-1L
IsothesiaHenry Schein Animal Health29405
May-Grunwald StainSigma AldrichMG-1L
Multiwell 6 well platesFalcon35 3046
Olympus BX60 MicroscopeOlympusNA
Paraplast Plus Tissue Embedding MediumFisher Brand23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype ControleBioscience12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1xCorning cellgro21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)eBioscience12-5898-82
Propidium Iodide Staining SolutioneBioscience00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3Peprotech213-13
Safranin-o CertifiedSigma AldrichS8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2Beckton Dickinson353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2Beckton Dickinson353110
Toluidine Blue 1% AqueousLabChem-IncLC26165-2
Recombinant Mouse SCFPeprotech250-03

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Uit het beenmerg afgeleide gekweekte mastcellenadoptieve transfermastceldefici nte muizenflowcytometrieimmunohistochemische analyseintradermale transplantatieintraperitoneale transplantatieintraveneuze transplantatie

Gerelateerde artikelen