Het doel van dit protocol is om een effectieve techniek te laten zien om een volledige, intacte vitreuze kern en cortex van post mortem geënucleeerde varkensogen te isoleren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hele glasvocht Dissection voor Vitreodynamic Analyse
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De auteurs stellen een effectieve techniek voor om het hele, intacte glasvochtkern en de cortex te isoleren uit post mortem geënuleerde varkensogen. Terwijl eerdere onderzoeken de resultaten van dergelijke dissecties hebben laten zien, zijn de gedetailleerde stappen niet beschreven, waardoor onderzoekers buiten het veld niet in staat zijn om hun methoden te repliceren. Andere onderzoeken verzamelen glasvocht hetzij door middel van aspiratie, wat de anatomie van de glasvochtstructuur niet behoudt, of door gedeeltelijke dissectie, wat alleen de glasvochtkern isoleert. De voorgestelde methode isoleert het hele glasvochtlichaam, met de glasvochtkern en cortex intact, terwijl de anatomie en structurele integriteit van het glasvocht worden behouden. In deze methode wordt eerst een scleraal flap van volledige dikte in een geënuleerd varkensoog gemaakt en hierdoor kan het choroïdeweefsel worden gescheiden van de sclera. De scleraal flap wordt vervolgens uitgebreid en de choroïde wordt volledig gescheiden van de sclera. Ten slotte wordt het choroïde-retinaweefsel van het glasvocht afgepeld om een geïsoleerd intact glasvochtlichaam achter te laten. De voorgestelde glasvochtdissectietechniek kan worden gebruikt om fysische eigenschappen van het glasvocht te bestuderen. In het bijzonder heeft deze methode betekenis voor experimentele studies met betrekking tot geneesmiddelafgifte, vitreoretinale zuurstoftransport en intraoculaire convectie.
Inleiding
Het doel van deze methode is het detail een techniek om geheel intact glaslichaam te isoleren, met het glaslichaam kern en cortex intact, van een kadaver oog, met het oog op vitreodynamic analyse. Aangezien het gebied glasachtig fysiologie gegroeid, multidisciplinaire onderzoekers, zoals vloeistofmechanica onderzoekers onderzoeken de fysische en biomechanische eigenschappen van het glasachtige lichaam 1. Hiertoe is het noodzakelijk om detail een techniek om het gehele, intacte glaslichaam isoleren multidisciplinaire onderzoekers bevorderen.
Sebag et al. 2 ea 3 uitgevoerd elegant geheel glasachtige ontledingen menselijke kadaver ogen en vertoonde afbeeldingen van de resultaten. Echter, de techniek niet in detail en leken beschreven niet kunnen de werkwijze zelfstandig repliceren. Andere studies hebben glasvocht van kadaver ogen met eenvoudigere methoden zoals aspiratie of gedeeltelijke dissectie geoogst,beide niet leiden tot een geheel, intact glaslichaam. Gisladottis et al. 4 en Xu et al. 5 onderzoeken permeabiliteit in glasvocht geoogst kadaver ogen. Aangezien echter geen werkwijze voor het glasachtige extractie werd beschreven, werd aangenomen dat zij aangezogen het glasvocht met een spuit. Watts et al. 6 ging nog een stap verder door het beschrijven van een methode voor het isoleren van konijn glasvocht met een chirurgische techniek. Echter, deze werkwijze resulteert in een isolatie van enkel het glasvocht kern en niet het glasvocht cortex. Skeie et al. 7 later organiseerde het glasvocht in 4 unieke regio en elegant beschreven een methode te ontleden uit elk onderdeel voor analyse. Deze techniek echter niet tot een intacte glaslichaam als geheel.
De huidige techniek werd ontwikkeld biofysische experimenten die momenteel alleen worden uitgevoerd kadaver ogen vergemakkelijken. Vorige werkwijzen, zoals beschreven eenbove worden beperkt doordat 1) er geen volledig isoleren van de gehele glaslichaam, 2) geoogst glasachtige kern cortex gehomogeniseerd, 3) glasachtige anatomische structuur niet behouden blijft, of 4) dissectie technieken niet voldoende gedetailleerd voor replicatie door onderzoekers in andere gebieden . Bovendien, vanwege de ondoorzichtigheid van sclera en choroidea, visualisatie van het glasachtige lichaam is beperkt in de intacte oogbol. Dit beperkt de nauwkeurigheid en haalbaarheid van metingen die worden uitgevoerd in het gehele oog. Bovendien kan de anatomische structuren rond het glasachtige de studie van biochemische en fysische eigenschappen van het glasachtige lichaam verwarren.
In de afgelopen jaren heeft het lichaam van glasvocht wetenschap enorm gegroeid en er is reden om te geloven dat het hele glasachtig lichaam heeft andere eigenschappen dan de afzonderlijke delen. Er is een groeiende interesse in het onderzoek naar de fysieke, biomechanische en chemische eigenschappen van het glasvocht van vitreodynamics research, welke toepassingen in de klinische geneeskunde, zoals drug delivery, intravitreale zuurstofvoorziening 8 en vitrectomie heeft. Farmacologische vitreodynamics, die farmacologische middelen gebruikt om het glaslichaam te manipuleren, kan worden gebruikt vitrectomie resultaten 9 verbeteren. Biomechanische eigenschappen worden gebruikt om in glasachtige fluïdumstroming, die kan worden gebruikt om intravitreale technologieën voor medicijnafgifte 10-12 verbeteren. Fysische eigenschappen van verschillende segmenten van het glasachtige cruciaal voor vitreo-retinale zuurstoftransport 13 begrepen. De voorgestelde glasvocht dissectie techniek kan worden gebruikt om verschillende eigenschappen van het intacte glasvocht bestuderen. Het maakt bench-top experimenten worden gedaan op de hele, intacte glasachtig lichaam met een betere visualisatie.
Samenvattend, de huidige werkwijzen voor onderzoek van het glasachtige lichaam ofwel niet voldoende beschreven, of leiden tot een onvolledige isolatie het glasachtige kern en cortex. Daarom is er behoefte aan e voerenxperiments transparante oogmodel met behoud van de anatomie van het glasvocht die bestaat in het kadaver oog.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle enucleated ogen werden verkregen van een slachthuis en alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele bioveiligheid wetten.
- Secure verwijderde oog neer op een oppervlak. Doe dit door het plaatsen van het weefsel pennen door het overtollige weefsel rond de ogen en het veiligstellen van het neer in een piepschuim bord.
- Ontleden en los perilimbal bindvlies van het oog.
- Gebruik fijn pincet (0,3 tang) en microscissors (Westcott schaar) om het bindvlies incise aan de limbus en botweg ontleden het van de sclera. Knip de conjunctiva aan de limbus de stompe dissectie door naar verdere dissectie staan.
- Verwijder conjunctiva helemaal rond het oog (360 graden) zoveel sclera mogelijk bloot.
OPMERKING: Het is nuttig om een kleine hoeveelheid bindvlies te verlaten om te vergemakkelijken fixeren van het oog met de chirurgische pennen of een pincet in de rest van de procedure.
- Maak een volledige dikte oogvliesflap langs éénzijde van het oog (scalpel 69).
- Wordt ~ 5 mm sclerale incisie parallel aan de limbus en 3 mm achter de limbus door voorzichtig snijden in de sclera van een scalpel (scalpel 11) tot donkergekleurde choroid zichtbaar. Wees voorzichtig het vaatvlies zelf niet insnijden.
- Zorgvuldig ontleden langs het vlak tussen de sclera en choroidea, hetzij met een schaar (met stompe dissectie) of de scalpel, totdat het mogelijk te vergroten mogelijke ruimte tussen deze weefsels door op de choroidea voorzichtig naar binnen.
- Voeg een sclerale incisie loodrecht op de eerste sclerale incisie met scherpe microscissors, waardoor een T-vormige insnijding.
- Dan blijven bot ontleden in een omtreksrichting wijze als de sclerale weefsel van het onderliggende choroidea verwijderen en duw choroid weg van de sclera zoals hierboven vermeld.
- Vergroot de oogvliesflap als nodig is.
- Voorzichtig blunt ontleden het vaatvlies weg van de sclerahet gehele proces.
- Vergroot de klep tot de incisie gemaakt loodrecht op de limbus bereikt de oogzenuw en incisie gemaakt evenwijdig aan de limbus ten minste een derde van het oog omtrek (45 °).
- Gebruik de oogvliesflap als een bron van hefboomwerking voor het manipuleren van het oog tijdens stompe dissectie. De teller-grip op de flap vergemakkelijkt het stompe dissectie.
- Herhaal de vorige stap anderzijds sclerale flap.
- Knip de sclerale flappen om een groot gebied van choroidea bloot.
- Blijven de incisie gemaakt in stap 3 rond het oog omtrek (360 graden).
- Verwijder het resterende choroid-retina tissue.
- Binnen het blootgestelde gebied, gebruik dan een katoenen-tip zachtjes borstel uit de choroid-retina weefsel overgebleven. Als alternatief, voorzichtig pak het weefsel met een tang en afschilferen van de onderliggende glasachtig lichaam.
- Indien nodig maakt een incisie in de choroid stArting van de oogzenuw. Dan afpellen het vaatvlies voorzichtig aan het netvlies en het glasvocht cortex bloot.
- Verder stompe ontleden choroid weg van de sclera en dan afpellen het vaatvlies aan het geheel, intact glasachtige verkrijgen.
- Gebruik de sclerale rand bevestigd aan de cornea om de hele glaslichaam op de gewenste plaats te positioneren. Op dit punt wordt het glasachtig lichaam aan het voorste sclera en bevestigde lens.
- Stompe ontleden het glasvocht van het inwendige van de sclera rond de lens en het verwijderen van sclera.
- Gebruik een stomp gereedschap om uit de buurt van het glasvocht schep de lens indien nodig. Gebruik het monster voor verschillende vitreodynamic experimenten.
- Leg het monster in een bekerglas met een bekende oppervlakte blootgesteld aan de lucht. Plaats zuurstofgevoelige probe aan de rand van het monster. Gebruik van een micro-manipulator om de sonde naar een bekende afstand (r) in het monster.
- Gebruik Wet van Fick aan de theoretische diffusievergelijking verkrijgen. Met de data verzameld in stap 10.1, het verkrijgen van de experimentele diffusiecoëfficiënt / reactie term etc.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na het protocol tot een goed glasachtige dissectie met de kern en cortex (figuur 3) intact. Dit blijkt uit de resterende delen van het netvlies gehecht aan het glasvocht cortex. Intact hele glasachtig lichaam kan worden gebruikt op verschillende manieren bepaald vitreodynamic experimenten. In ons geval, de diffusiesnelheid van zuurstof in intacte glasvocht en het bijbehorende tijdsconstante onderzocht (Figuur 2). Glasachtig die werd ontleed (kern en cortex) in onze methode werd in een g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn twee belangrijke stappen die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd tijdens glasachtige dissectie. Stap 3, waardoor een volledige dikte sclerale flap, is cruciaal voor het gehele dissectie. Zorg moet worden genomen om niet tot plaatjes choroid bij het maken van de volledige dikte sclerale flap. De andere belangrijke stap is het ontleden weg de sclera van het vaatvlies. Deze stap moet zorgvuldig worden gedaan om te voorkomen dat het creëren van meerdere gaten in het vaatvlies van waaruit het glasvocht kunnen morsen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen, Whittier Foundation, Harrington Foundation, National Institutes of Health en Research to Prevent Blindness.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.3 forceps | Storz Opthalmics | E1793 | |
| Westcott Tenotomy Scissors Curved Right | Storz Opthalmics | E3320 R | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Scalpel Blade, #11, for #3 Handle | VWR | 470174-844 |
Referenties
- Siggers, J. H., Ethier, C. R. Fluid Mechanics of the Eye. Annual Review of Fluid Mechanics. 44 (1), 347-372 (2012).
- Sebag, J. Age-related changes in human vitreous structure. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 225 (2), 89-93 (1987).
- Grignolo, A. Fibrous components of the vitreous body. AMA Arch Ophthalmol. 47 (6), 760-774 (1952).
- Gisladottir, S., Loftsson, T., Stefansson, E. Diffusion characteristics of vitreous humour and saline solution follow the Stokes Einstein equation. G Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247 (12), 1677-1684 (2009).
- Xu, J., Heys, J. J., Barocas, V. H., Randolph, T. W. Permeability and diffusion in vitreous humor: implications for drug delivery. Pharm Res. 17 (6), 664-669 (2000).
- Watts, F., Tan, L. E., Wilson, C. G., Girkin, J. M., Tassieri, M., Wright, A. J. Investigating the micro-rheology of the vitreous humor using an optically trapped local probe. Journal of Optics. 16 (1), 015301(2014).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), e2455(2011).
- Abdallah, W., Ameri, H., et al. Vitreal oxygenation in retinal ischemia reperfusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 1035-1042 (2011).
- Goldenberg, D., Trese, M. Pharmacologic vitreodynamics: what is it? Why is it important. Expert Review of Ophthalmology. 3 (3), 273-277 (2008).
- Choonara, Y. E., Pillay, V., Danckwerts, M. P., Carmichael, T. R., du Toit, L. C. A review of implantable intravitreal drug delivery technologies for the treatment of posterior segment eye diseases. J Pharm Sci. 99 (5), 2219-2239 (2010).
- Balachandran, R. K., Barocas, V. H. Computer modeling of drug delivery to the posterior eye: effect of active transport and loss to choroidal blood flow. Pharm Res. 25 (11), 2685-2696 (2008).
- Smith, C. a, Newson, T. a, et al. A framework for modeling ocular drug transport and flow through the eye using micro-CT. Phys Med Biol. 57 (19), 6295-6307 (2012).
- Quiram, P. A., Leverenz, V. R., Baker, R. M., Dang, L., Giblin, F. J., Trese, M. T. Microplasmin-induced posterior vitreous detachment affects vitreous oxygen levels. Retina. 27 (8), 1090-1096 (2007).
- Shui, Y., Holekamp, N. The gel state of the vitreous and ascorbate-dependent oxygen consumption: relationship to the etiology of nuclear cataracts. Arch Ophthalmol. 127 (4), 475-482 (2009).
- Burk, S. E., Da Mata, A. P., Snyder, M. E., Schneider, S., Osher, R. H., Cionni, R. J. Visualizing vitreous using kenalog suspension. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 645-651 (2003).
- Spaide, R. Visualization of the Posterior Vitreous with Dynamic Focusing and Windowed Averaging Swept Source Optical Coherence Tomography. Am J Ophthalmol. S0002-9394 (14), 00537-00536 (2014).
- Domalpally, A., Gangaputra, S., Danis, R. P. Diseases of the Vitreo-Macular Interface. 21, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. 21-27 (2014).
- Stocchino, R., Repetto, A., Cafferata, C. Experimental investigation of vitreous humour motion within a human eye model. Phys Med Biol. 50 (19), 4729-4743 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
