Onderzoek naar vroege migratie van endotheelcellen (EEC) is belangrijk om de pathofysiologie van bepaalde ziekten te begrijpen en om mogelijk nieuwe strategieën voor therapeutische interventie te identificeren. Het volgende protocol beschrijft technieken om celmigratie te beoordelen die zijn aangepast voor het onderzoek van EEC.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van endotheelcelmigratie na blootstelling aan giftige chemische stoffen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Blootstelling aan chemische stoffen (met inbegrip van alkylerende chemische strijdmiddelen zoals zwavel en stikstof mosterd) veroorzaken een overvloed aan klinische symptomen, waaronder wondgenezing stoornis. De fysiologische proces van wondgenezing is zeer complex. De vorming van granulatieweefsel is een belangrijke stap in dit proces resulteert in een eerste wondsluiting en leveren van een netwerk van nieuwe capillaire bloedvaatjes - hetzij door vasculogenese (novel vorming) of angiogenese (ontspruiten van bestaande schepen). Zowel vasculo- en angiogenese vereisen een functionele, geregisseerd migratie van endotheelcellen. Aldus onderzoek vroege endotheelcellen (EEG) migratie van belang de pathofysiologie van chemische geïnduceerde aandoeningen wondgenezende begrijpen en om potentieel nieuwe strategieën te identificeren voor therapeutische interventie.
We beoordeeld verstoorde wondgenezing na alkylerende blootstelling middel en getest potentiële kandidaat-verbindingen voor treatment. We gebruikten een reeks technieken die in dit protocol. Een gewijzigde Boyden kamer om kwantitatief onderzoek chemokinesis van EEG wordt beschreven. Bovendien wordt het gebruik van de wondgenezende assay in combinatie met track analyse kwalitatieve evaluatie migratie toegelicht. Tenslotte tonen we het gebruik van de fluorescente kleurstof TMRM voor het onderzoeken van mitochondriale membraanpotentiaal onderliggende mechanismen van verstoorde celmigratie identificeren. Het volgende protocol beschrijft de basistechnieken die zijn aangepast voor het onderzoek van de EEG.
Inleiding
Celmigratie is belangrijk in vele fysiologische en pathofysiologische processen zoals ontwikkeling, verschillende ziekten, en wondheling bij huidletsel.
Na de huid letsel, ontsteking verwijdert beschadigd of necrotische weefsel en granulatie drives voorlopige wond sluiting en maakt de vorming van een netwerk van nieuwe haarvaten door middel vasculogenese (roman vorming) of angiogenese (kiemen van bestaande blaasjes) 1-3. Zowel vasculo- en angiogenese vereisen migratie van endotheelcellen. De groeiende netwerk van bloedvaten is essentieel om zuurstof en voedingsstoffen transporteren naar prolifererende keratinocyten die uiteindelijk ondergaan keratinisatie, vormen een nieuw epitheel en bieden wondsluiting.
Verminderde migratie van endotheliale cellen is een onderliggende oorzaak van wondgenezende stoornis 4,5. Aldus methoden te beoordelen migratie van endotheelcellen vroege moeten de pathophysiol verkennengie van celmigratie aandoeningen en om nieuwe strategieën te identificeren voor therapeutische interventie.
Dermale blootstelling aan alkylerende middelen (bijvoorbeeld zwavel en stikstof mosterds) veroorzaakt wondgenezende aandoening 6. Dergelijke verbindingen werden gebruikt als chemische oorlogsvoering agenten in verschillende conflicten in de 20e eeuw en blijft reden voor grote bezorgdheid als gevolg van de bestaande voorraden in politiek instabiele regio's en de relatief eenvoudige synthese. Hoewel zwavelmosterd eerst werd gesynthetiseerd in 1822, is de moleculaire en klinische pathologie van SM blootstelling niet begrepen in detail en geen antidotum voor SM blootstelling is geïdentificeerd.
Verschillende studies zijn uitgevoerd om te begrijpen en te modelleren vertraagde wondgenezing na blootstelling SM en te testen op potentiële kandidaat-verbindingen kunnen reserveren daartoe. Schmidt et al. (2009) het effect van chloorambucil, een alkyleringsverbinding met eigenschappen vergelijkbaar met SM in mou getestse embryoid body modellen en vond een dramatische, soms meer dan 99% verlaging van vat 7. Dit nadelige effect is het meest uitgesproken in een ontwikkelingsstadium dat onder fysiologische omstandigheden wordt gedomineerd door de proliferatie en migratie van vasculaire endotheliale voorlopercellen. Aldus werden deze cellen geïdentificeerd bijzonder gevoelig alkyleringsmiddelen zijn. Steinritz et al. (2010) testte vangers van reactieve zuurstof species (ROS), in het bijzonder N-acetylcysteïne (NAC) en alfa-linoleenzuur (ALA) op hun vermogen SM toxiciteit verminderen muizen embryoiden lichaam modellen en met name herstellen bloedvatvorming 8. Tijdelijke beschermende effecten werden waargenomen, wat aangeeft dat overmatige ROS formatie kunnen bijdragen tot de nadelige effecten van SM op wondgenezing. Deze effecten waren niet permanent en de twee kandidaat-verbindingen niet kunnen herstellen vat en wondgenezing op lange termijn 8 zijn. However, die experimenten werden uitgevoerd in een complexe 3D model dat toeliet onderzoeken celmigratie. Zo hebben we vervolgens getest NAC en ALA voor gunstige effecten op celmigratie van EEG die een belangrijke rol in het proces van het vat 9 heeft.
Bovendien zijn er aanwijzingen dat celpolariteit nodig is voor celmigratie. Mitochondriale dysfunctie wat leidt tot de vorming van ROS werd aangetoond dat celpolariteit schaden en kan dus nadelig beïnvloeden celmigratie. Daarom live cell imaging wat mitochondriale functie werd uitgevoerd en de effecten van ROS scavengers onderzocht. Het volgende protocol beschrijft de algemene eisen voor de teelt van de EEG, de Boyden kamer assay, de wondgenezing assay waaronder cell tracking-analyse en het gebruik van TMRM voor de beoordeling van de mitochondriale functie in detail. Belangrijke aspecten van de experimentele protocollen voor EEG teelt en migratie worden gemarkeerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het volgende protocol beschrijft technieken voor het onderzoeken van vroege endotheliale celmigratie. De juiste kweken van vasculaire endotheelcellen vereist pre-coating van celkweekkolven met gelatine juiste proliferatie en instandhouding van een endotheliaal fenotype waarborgen.
1. Pre-coating van celkweekkolven
- Los gelatine in 0,1 M PBS tot een eindconcentratie van 0,1%.
- Autoclaaf de oplossing met parameters voor vloeibare autoclaaf (voor details zie de handleiding van de specifieke autoclaaf).
- Voeg voldoende hoeveelheid van de geautoclaveerde gelatine oplossing voor een steriele celkweekkolf (bijvoorbeeld ten minste 5 ml voor een T25 celkweek kolf).
- Breng de kolven in een incubator (37 ° C, is 5% CO 2 niet vereist, maar heeft geen invloed) gedurende ten minste 30 min.
- Verwijder het resterende gelatineoplossing. Gebruik de pre-coated flesjes vervolgens (zie cel kweek) of sscheurde onder steriele omstandigheden tot gebruik.
2. Cell Teelt van Early endotheelcellen
Opmerking: Embryonale stamcellen afgeleide vroege endotheelcellen (EEG) werden op basis van afzonderlijke muizen embryoïde lichamen verkregen door magnetische-geactiveerde celsortering van PECAM-1 positieve celfractie zoals eerder beschreven 10,11.
- Culture EEG-gelatine beklede celcultuurschalen in DMEM gesupplementeerd met 15% FCS, 50 U / ml penicilline, 50 U / ml streptomycine, 200 uM L-glutamine, 100 uM ß-mercaptoethanol en 1% niet-essentiële aminozuren. Behandel cellen onder steriele omstandigheden. Cultiveren van de cellen met 5% CO2 bij 37 ° C en 95% luchtvochtigheid tot sub-confluentie (max. 80%).
- Bij bijna-confluentie splitsing van de cellen bij een 1: 5 verhouding. Opmerking: Onthechting van endotheelcellen is een cruciale stap.
- Oogst de cellen met RT Accutase. Verwijder de media, spoelen met PBS en voeg 1 ml Accutase per 25 cm 2.
- Incubeer de kolf bij kamertemperatuur gedurende 2-10 min totdat de cellen losgemaakt. De verspreiding van de cellen en overbrengen naar de gewenste toepassing. Opmerking: Een chemische neutralisatie van het Accutase is niet vereist als het plaatsvindt wanneer de geënte cellen opgeslagen in de incubator bij 37 ° C. Echter, Accutase activiteit ook worden verminderd door toevoeging van DMEM bevattende FCS.
3. Boyden Kamer
Opmerking: Boyden kamer assays worden uitgevoerd met behulp van licht ondoorlaatbare polyethyleentereftalaat insert systemen 8 urn poriegrootte.
- Pre-coat de filterelementen (die passen in celkweek putjes zodat een Boyden-kamer) Door toevoeging van 500 gl 0,1% gelatine, opgelost in 0,1 M PBS gedurende ten minste 30 min.
- Wanneer cellen worden blootgesteld aan toxische chemicaliën blootstellen volgens de specifieke experimentele opzet voor verzamelen van cellen. Opmerking: De cellen werden blootgesteld aan 12,5 ug chloorambucil / ml DMEMgedurende 24 uur. Wat de specifieke experimentele opzet, kunnen instructies variëren.
- Harvest EEG en bepalen het aantal cellen met behulp van een telling cel kamer. Opmerking: Het automatische tellen apparaten kunnen worden gebruikt, maar moet met voorzichtigheid worden gebruikt: handmatig cel tellen is nauwkeuriger en wordt sterk aanbevolen.
- Voeg 500 ul celkweek medium in de onderste kamer compartiment van de Boyden kamer.
- Voeg exact 10 4 EEG in 500 pi celkweekmedium per filter insert in de bovenste kamer compartiment. Elimineer bubbels.
- Incubeer de filter inserts in de incubator voor precies 8 uur.
- Spoelen met PBS eens en vervang het medium met 0,5 ml 4% paraformaldehyde in beide vakken voor 25 min voor mobiele fixatie. Was het filter uitgebreid maar minstens 3 maal met 0,1 M PBS.
- Uitsnijden van de membranen met een scalpel.
- Monteer het membraan tussen twee glazen dekglaasjes met montage medium met DAPI voor nucleaire staining. Besteed aandacht aan de oriëntatie. Zorg ervoor dat alleen cellen die zijn gemigreerd naar het onderste compartiment van het membraan geteld.
- Tellen cellen die gemigreerd naar het onderste compartiment van het membraan met een fluorescentiemicroscoop bij 400x vergroting. Niet te verwarren membraanporiën met gemigreerde cellen (Figuur 1A, 1B). Onderzoek een redelijk aantal biologische herhalingen (minstens 3 biologische herhalingen per conditie).
4. Wound Healing Assay
- Afhankelijk van de beschikbare apparatuur, zorgvuldig kiezen van de celcultuur gerechten of platen: Bij het gebruik van DIC microscopie, vermijd plastic oppervlak gebaseerde cultuur gerechten of goed platen maar gebruik glas gebaseerde apparaten plaats.
Opmerking: Bij gebruik fasecontrast microscopie, kan kunststofbasis schotels worden gebruikt. - Cultiveren EEG in een geschikte celcultuur (bijv, 4 cm glazen bodem petrischaal geschikt voor live-cell imaging) Tot 80% confluentie. Belangrijk: de cellen niet te cultiveren om samenloop voltooien.
- Kras aan de monolagen met steriele 10 ul pipet tips. Druk de tip zachtjes zonder al te veel druk op de schotel oppervlak en bewegen in een rechte lijn soepel van de ene kant naar de other.Wash de cellen tweemaal met 0,1 M PBS tot vrijstaande cellen te verwijderen.
- Voeg een voldoende hoeveelheid van middel aan de kweekschaal. Eventueel voegen verbindingen die onderzocht moeten worden.
Opmerking: 1,5 ml medium bevattende 15 ng / ml alfa-linoleenzuur werd toegevoegd. - Monteer de cultuur schotel onder een microscoop in staat live cell imaging. Verzeker 5% CO 2, 37 ° C en een vochtige atmosfeer.
Opmerking: bevochtiging is vooral belangrijk om middelgrote verdamping te voorkomen. - Acquire time-lapse beelden van meer dan 24 uur bij 10 min intervallen. Plan voor grote bestanden. Opmerking: Een resolutie van 512 x 512 pixels is meestal voldoende; Toch raden we het gebruik van beelden van ten minste 1.024 x 1,024.
- Meet de spleetbreedte op t = 0 uur en op t = 24 uur met behulp van de lengte instrument van de software die bij de microscoop of gebruik van open-source software (bijvoorbeeld ImageJ). Opmerking: In het algemeen specifiek beeld acquisitie en analyse software wordt geleverd door de fabrikant. Daarom is voor de technische details met betrekking tot het gebruik van de software, raadpleegt u de handleiding.
5. Cell Tracking
- Afhankelijk van de beschikbare apparatuur, zorgvuldig kiezen van de celcultuur gerechten of platen: Bij het gebruik van DIC microscopie, vermijd plastic oppervlak gebaseerde cultuur gerechten of goed platen maar gebruik glas gebaseerde apparaten plaats.
Opmerking: Bij gebruik fasecontrast microscopie, kan kunststofbasis schotels worden gebruikt. - Seed 5 x 10 4 EEG aangevuld DMEM in een geschikte celcultuur inrichting (bijvoorbeeld 24-multi-putjesplaat) en cultiveren van de cellen met 5% CO2 bij 37 ° C en 95% vochtigheid gedurende 1-2 dagen.
- Wanneer cellen zijn opgegroeid met een 80% Confluentie, verwijdert het medium en kweek van de cellen met nieuwe media in aanwezigheid van de desbetreffende teststoffen (bijvoorbeeld 12,5 ug chloorambucil / ml DMEM). Vermeld altijd controlecellen (behandeld met het oplosmiddel, bijvoorbeeld ethanol) bij 37 ° C gedurende een bepaalde tijd (24 uur, afhankelijk van het individu testsysteem).
- Monteer de kweekschaal onder een microscoop die live cell imaging (37 ° C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid). Acquire time-lapse beelden van meer dan 24 uur op vooraf bepaalde tijdstippen. Acquire beelden op 10 min met tussenpozen.
- Voer handmatig bijhouden van de EEG door het gebruik van de ImageJ plugin MTrackJ. Kies 10 cellen willekeurig uit het gezichtsveld en volgen hun bewegingen door het toevoegen van een data punt per punt in de tijd met behulp van de "toevoegen" bevel van MTrackJ.
Opmerking: MTrackJ is gratis beschikbaar op en ImageJ is availab [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le op [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Een uitgebreide handleiding over de MTrackJ plugin is beschikbaar op "http://www.imagescience.org".
6. live cell imaging / Beoordeling van de mitochondriale membraan Potentiële
- Cultiveren EEG in een geschikte celcultuur (bijv, 4 cm glazen bodem petrischaal geschikt voor live-cell imaging) tot 80% samenvloeiing.
Belangrijk: de cellen niet te cultiveren om samenloop voltooien. - Indien van toepassing, de cellen bloot aan chemicaliën. Opmerking: De cellen werden blootgesteld aan 12,5 ug / ml voor chloorambucil 24 uur. Wat de specifieke experimentele opzet, kunnen instructies variëren.
- Bereid een 10 mM voorraad oplossing van tetramethylrhodamine (TMRM) in DMSO. Beschermen tegen licht. Opmerking: De voorraadoplossing kan bij -20 ° C worden bewaard.
- Verdun de voorraadoplossing in celkweekmedium naar de oplossing met een concentratie van 10 pM (1: 1000 verdunning). Beschermen tegen lichten gebruik zo spoedig mogelijk. Opmerking: De werkende oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard gedurende enige tijd (> 1 uur), echter de bereiding van een verse werkoplossing wordt sterk aanbevolen.
- Voeg 2 ul van de werkoplossing 1 ml vers celkweekmedium (beladingsoplossing).
- Laad de cellen door vervangen van het celkweekmedium met de beladingsoplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2 en bevochtigde atmosfeer (incubator). Let op: Bijna alle fluorescentie-indicatoren worden geëxporteerd door levende cellen in de tijd; daarom niet te lang laden of vertraagde analyse.
- Zonder wassen, plaats de schotel onder een microscoop geschikt voor live-cell imaging. Belangrijk: fluorescentie-indicatoren zijn zeer gevoelig voor licht, dus onnodige blootstelling aan licht.
- Acquire beelden zonder dat de acquisitie parameters om de vergelijkbaarheid tussen de verschillende beelden te garanderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dermale blootstelling aan alkylerende agentia veroorzaakt erytheem, blaarvorming en huidzweren die is gekoppeld aan een wondgenezende stoornis. Wondgenezing vereist angio en vasculogenese die zijn gebaseerd op de migratie van endotheelcellen. Kwantitatieve migratie kan worden beoordeeld door het gebruik van de Boyden kamer assay. Zoals getoond in figuur 1C blootstelling van EEG de alkyleringsmiddel chloorambucil resulteerde in een significante afname van celmigratie 9. Toevoeging van de ROS s...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dermale blootstelling aan giftige chemische stoffen resulteert vaak in ernstige wondgenezing stoornis. De onderliggende mechanismen zijn grotendeels onbekend. Wondgenezing is een complex proces dat uit verschillende fasen (hemostase, inflammatie, proliferatie en hermodellering). Celmigratie is betrokken bij elke fase, is het echter van het grootste belang voor de vorming van granulatieweefsel. Hier worden nieuwe bloedvaten ofwel gevormd door angio of vasculogenese.
Beide werkwijzen vereisen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door het Duitse Ministerie van Defensie (subsidienummer M-SAB1-6-A009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (voor gebruik met Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Duitsland | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Duitsland | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland | # G2500-100G |
Referenties
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
