Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Summary

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Abstract

Pancreatische ductale adenocarcinoma (PDAC) een subset van uitsluitend tumorigene kanker stamcellen (CSC), waarvan is aangetoond dat ze tumor initiatie, metastase en resistentie tegen radio- en chemotherapie rijden. Hier beschrijven we een specifieke methode voor het kweken van primaire menselijke pancreas CSCs als tumor bollen in verankering-onafhankelijke omstandigheden. Cellen worden gekweekt in serumvrij, niet hechtende voorwaarden om te verrijken CSCs terwijl de meer gedifferentieerde nakomelingen niet overleven en prolifereren gedurende de eerste tijd na zaaien van enkele cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het schatten van het percentage CSCs in een populatie van tumorcellen. Zowel size (die kan variëren 35-250 micrometer) en aantal tumor bolletjes gevormd vertegenwoordigt CSC activiteit geherbergd in beide bulk populaties van gekweekte kankercellen of vers geoogst en gedigereerd tumors ^1,2. Met behulp van deze test, we onlangs bleek dat metformine selectief ablateert pancreatic CSCs; een bevinding die vervolgens verder werd bevestigd door aan te tonen verminderde expressie van pluripotency geassocieerde genen / oppervlak markers en verminderde in vivo tumorigeniciteit van metformine behandelde cellen. Als laatste stap voor preklinische ontwikkeling we behandelde muizen met gevestigde tumoren met metformine en vond aanzienlijk verlengde overleving. Klinische studies testen het gebruik van metformine bij patiënten met PDAC zijn nog gaande (bv NCT01210911, NCT01167738 en NCT01488552). Mechanistisch, vonden we dat metformine veroorzaakt een fatale energiecrisis in CSCs door verbetering van reactieve zuurstof species (ROS) productie en reducerende mitochondriale transmembraanpotentiaal. Daarentegen werden niet-CSC niet geëlimineerd door behandeling met metformine, maar onderging omkeerbare celcyclus. Daarom onze studie dient als geslaagd voorbeeld van het potentieel van in vitro gebied formatie als screeningsmethode om verbindingen die potentieel doelwit CSC identificerens, maar deze techniek verder in vitro en in vivo geldig worden om valse ontdekkingen elimineren.

Introduction

Pancreatische ductale adenocarcinoma (PDAC) is een van de meest agressieve vaste tumoren. Het is momenteel de ^4e meest voorkomende kanker-gerelateerde dood in de westerse samenleving en zal naar verwachting stijgen naar de ^2e meest voorkomende oorzaak in de komende tien jaar (~ 400.000 sterfgevallen per jaar wereldwijd) ³ .Op moment van de diagnose 90% van de patiënten aanwezig met gevorderde ziekte, waarbij een 5-jaars overleving van minder dan 5% heeft. Deze overlevingskans is teleurstellend gebleven ondanks steeds intensief onderzoek activiteiten ⁴ in de afgelopen 50 jaar onveranderd. Van de resterende 10% van de patiënten die in potentie 'genezen' ziekte door chirurgische resectie, wordt 80% sterven aan herhaling binnen 5 jaar. Al vele jaren de standaard van zorg voor gevorderde ziekte is geweest gemcitabine monotherapie, maar dit geeft slechts een marginale overlevingsvoordeel ^5. Kleine verbeteringen op korte termijn overleven zijn bereikt door de toevoegingvan erlotinib ⁶ of capecitabine ^7, maar de overlevingsvoordeel in de orde van weken de mediane algehele overleving nog ~ 6 maanden. Onlangs hebben meer bemoedigende resultaten naar voren gekomen voor gemcitabine / NAB -paclitaxel ⁸ en de FOLFIRINOX combinatie regime ^9,10. Deze therapieën verbeteren mediane overleving met bescheiden 2 en 4 maanden respectievelijk, maar zijn zeer giftig en lange termijn overlevenden steeds hoge uitzondering. Hoewel de behandeling biedt het potentieel voor verbetering, deze zijn giftig regimes waar veel patiënten niet reageren of alleen tonen incrementele verbetering in de algemene overleving. Als gevolg daarvan, is er een dringende noodzaak om de huidige therapieën aan te vullen en om nieuwe, waarschijnlijk multimodale therapeutische benaderingen te ontwikkelen.

Tumor Heterogeniteit

Het wordt steeds duidelijker dat kanker heterogeniteit is niet alleen beperkt tot verschillende evolutionaire subklonen within elke tumor ^11, maar ook gedreven door fenotypische en functionele heterogeniteit en plasticiteit binnen elke subkloon ^12. Zogenaamde kanker stamcellen (CSC) of tumor bevorderen cellen zijn verantwoordelijk voor intraclonal heterogeniteit ^13-16. Concreet CSCs vormen een subset van kankercel, waarvoor wij en anderen overtuigend bewijs heeft geleverd, tot aan de enkele cel, die zij vertegenwoordigen de wortel van de ziekte door die aanleiding geven tot alle gedifferentieerde nakomelingen binnen elke kanker subkloon ^17. Wat nog belangrijker is, deze cellen zijn essentieel voor metastatisch gedrag en tevens een belangrijke bron voor terugval van ziekte na behandeling, zelfs bij relatief doeltreffend drugs kan induceren initiële tumorregressie (bijv nab -paclitaxel) ^15,18-20. Het is belangrijk op te merken dat CSCs niet noodzakelijkerwijs bona fide stamcellen, noch ze ontstaan ​​uit weefsel stamcellen in vele gevallen, maar ze hebben acquired bepaalde functies van stamcellen. De meeste hiervan zijn functioneel vermeld, bijvoorbeeld CSCs zijn uitgerust met een onbepaalde zelfvernieuwingscapaciteit waardoor ze resistent zijn tegen conventionele chemotherapie, en vertonen verhoogde invasiviteit die metastatische activiteit bevordert.

Functionele Cancer Stem Cell Fenotypes

De functionele fenotype van CSCs is gebaseerd op hun vermogen om zichzelf te vernieuwen, dat kan in vitro worden getest met behulp van seriële bol vorming en de vorming van kolonies assays respectievelijk. Nog belangrijker, CSCs staat zelfvernieuwing beer in vivo tumorgeniciteitsonderzoek die kan worden getest door beperkende verdunning in vivo assays als de uiteindelijke functionele uitlezing voorkeur tijdens seriële transplantatie indicatief exclusieve langlopende tumorigeniciteit. Bovendien is er heterogeniteit in de CSC compartiment met een duidelijke subpopulatie van CSCs met het exclusieve mogelijkheid om aanleiding te geven tot metastasen die niet alleen eendirect gevolg van hun exclusieve in vivo tumorgeniciteit. Inderdaad, metastastitic CSCs verwerven het vermogen om de primaire tumor te ontwijken, overleven anoikis en uiteindelijk translocatie en zaden secundaire plaatsen. Deze geavanceerde functionele vermogens kunnen worden getest in vitro gebruik van gewijzigd invasie assays en in vivo assays gebruikt metastase.

Targeting kankerstamcellen

Wij en anderen hebben overtuigend bewijs dat behandelingen gericht op de grootste tumor van gedifferentieerde PDAC cellen, zelfs in combinatie met stroma targeting agents voorzien, niet een grote invloed op de progressie van de tumor en de daaropvolgende resultaat niet hebben, tenzij in combinatie met een CSC-targeting strategie ^{21, 22.} Aldus, gebaseerd op de cruciale functies van CSCs in ziekteprogressie en resistentie tegen therapie, die cellen zou een essentiële component voor elke nieuwe behandeling ^18,20 betekenen, maar een veel beter begrip o vereisenf van de regelgeving machinerie van CSCs. Hoewel CSCs en hun meer gedifferentieerde nakomelingen dragen identieke genetische grond staten met betrekking tot genetische veranderingen, CSCs vertonen onderscheiden en dus epigenetisch vastberaden genexpressie profielen die modules delen met pluripotente stamcellen. De meeste genen die betrokken zijn bij het genereren geïnduceerde pluripotente stamcellen (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) zijn niet alleen gekoppeld aan kanker, maar hun expressie wordt meestal beperkt tot de CSCs compartiment. Bovendien is de functionele relevantie van CSCs door het verlies-van-functie experimenten met genetische instrumenten voor het richten CSCs zijn nu stevig gevestigd de CSC concept voor verschillende soorten kanker ^23-25. Terwijl de meeste van deze benaderingen zijn gebaseerd op muismodellen en zijn dus niet gemakkelijk overdraagbaar in de kliniek, ze bieden proof-of-concept voor de potentiële klinische relevantie van targeting CSCs in combinatie met bulk tumorcellen.

Studeren kankerstamcellen In Vitro naar hun Achilles 'Heel Identificeer

Om nieuwe en klinisch toepasbare manieren identificeren voor het richten CSCs, worden de functies geregeld bestudeerd in vitro en bol vorming op grote schaal gebruikt in deze context. Oorspronkelijk ontwikkeld voor het bestuderen van normale stamcellen biologie, waaronder zelfvernieuwing en differentiatie capaciteit, was dit assay later aangepast CSCs in vitro onderzoeken en is gebruikt voor het onderzoeken CSCs geïsoleerd uit PDAC ^20. We hebben ontdekt dat tumor bollen gevormd uit primaire menselijke PDAC cellen dragen alle duidelijke kenmerken van CSCs, hetgeen wijst zij bona fide pancreas CSCs ²¹ bevatten. Zo is de tumor bol assay is een krachtig hulpmiddel voor het screenen op effectievere behandelingen in vitro, maar de resultaten verder moeten worden geëvalueerd bij strengere in vivo assays. Inderdaad, moeten de gegevens gegenereerd met deze in vitro test worden behandeld met grote voorzichtigheid als the test kan onderhevig zijn aan fouten. Zeer gestandaardiseerde protocollen, waaronder geautomatiseerde telling van gevormde bolletjes, moeten worden vastgesteld om ervoor te zorgen reproduceerbare en voorspellende data.

In deze context, recent gebruikte we deze test pancreas CSCs afgeleid van een diverse set van primaire humane PDACs screenen en toonde aan dat deze cellen zeer gevoelig voor metabole herprogrammering door anti-diabetische verbinding metformine. Eerder had metformine is aangetoond dat kankercellen expansie door indirecte activering van AMP-geactiveerd proteïnekinase (AMPK) signalering en daaropvolgende remming van mTOR ²⁶ uit waardoor eiwitsynthese en celproliferatie ²⁷ remmen. Naast deze effecten op de tumor bulk populatie, hebben wij en anderen vonden dat metformine kan richten en zelfs elimineren de CSC subpopulatie in een aantal vaste tumoren zoals borstkanker, slokdarmkanker, glioblastoma en pancreaskanker ^{28-31 <}/ Sup>. Zo metformine vertegenwoordigt een veelbelovende en veilige nieuwe therapeutische strategie voor de verschillende vormen van kanker met momenteel onvervulde medische noodzaak. Bovendien gebruiken bol vorming als een manier om verrijken CSCs we aangetoond dat primaire effecten van metformine op pancreas CSCs was onafhankelijk van AMPK activering en meestal gebruikt zijn bescheiden mitochondriale toxiciteit (via remming van complex I), die blijkbaar was letaal voor de subset van CSCs alleen. Voor deze laatste konden we hun cellulaire zuurstofconsumptie en mitochondriale ROS productie beoordeelt indicatoren van de toxiciteit van het geneesmiddel op cellulair niveau. Vervolgens kunnen deze in vitro gegevens worden gevalideerd in preklinische muismodellen en zelfs in significant verlengde overleving ^31. De hier gepresenteerde methode zorgt voor de snelle generatie drug gevoeligheid profielen voor CSCs, met inbegrip van studies over de effecten ervan op CSC metabolisme. We bieden nu uitgebreid experimentele details over de gebruikte comcomplementaire in vitro en in vivo procedures.

Protocol

Human PDAC tumoren werden verkregen met schriftelijke toestemming (Comunidad de Madrid, Spanje (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) Implantatie van de menselijke pancreas tumoren in immunodeficiënte muizen behoeft de goedkeuring van Institutional Review Board, alsook institutionele . Animal Care en gebruik Comite (IACUC) De procedures van de pancreas tumor xenograft muismodellen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale regelgeving (hier ethische commissie van het Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanje; Protocol PA 34_2012).

1. Cultuur Media

1. Bereid compleet medium.
   1. Aangevuld RPMI-medium met 10% FBS, 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine. 500 ml RPMI voeg 55 ml hitte geïnactiveerd FBS en 6 ml penicilline / streptomycine (10.000 U / ml, 100X).
   2. Bewaar de compleet medium bij 4 ° C.
2. Bereid CSCs Medium.
   1. Vul het serumvrije DMEM / F12 medium met 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine en 2 mM glutamine.
   2. Bewaar de CSC medium bij 4 ° C. B27 (01:50) en 20 ng / ml bFGF zijn onlangs toegevoegd aan het medium vóór elk experiment.
      Opmerking: De toevoeging van B27 is aangetoond dat de tumor bol vorming vergroten en verscheidene passages van bol culturen ³² ondersteunen. De samenstelling van het medium is een cruciale stap en worden getest voor elk celtype in kweek. We raden het testen zelf-vernieuwing en differentiatie capaciteit van bollen en expressie van CSC markers door flowcytometrie analyseren (dwz CD133 + en CD44 +).
3. Bereid Extracellulair Flux Assay Medium.
   1. Dit specifiek medium is basaal DMEM 5030 met vitaminen, aminozuren en andere supplementen, maar ontbreekt glutamine, glucose, pyruvaat en bicarbonaat.
   2. Voor de actuele test vult deze medium met 2 mM glutamine, 8 mM glucose en 2 mM natrium- pyruvaat om een ​​volledige mitochondriale metabolische activiteit.
      Opmerking: De afwezigheid van natriumbicarbonaat essentieel om extracellulaire verzuring van groeiende cellen in kweek nauwkeurig te meten, omdat regelmatig medium bevattende bicarbonaat buffer pH variaties tijdens de assay. Bovendien is het gebruik van een basaal medium kan een strakke regeling van de concentratie van L-glutamine (L-alanyl-glutamine) glucose of natriumpyruvaat noodzakelijk voor verschillende assay omstandigheden en / of toepassingen.

2. Sphere vormen Assay en Analyse

LET OP: Alle weefselkweek protocollen en manipulaties moeten worden uitgevoerd met steriele technieken met grote aandacht met schone, wasmiddel zonder, steriel glaswerk. Voor het gebruik, pre-warm alle middelgrote en oplossing in een 37 ° C waterbad (als alternatief kunt u gebruik maken van medium en oplossingen voorverwarmd bij RT). Verkrijgen Human PDAC tumoren zoals eerder beschreven ^21.

1. Isolatie van CSCs van Human PDAC (Figuur1)
   1. In een steriele bioveiligheid kast overdragen humane PDAC weefsel om een ​​60 x 15 mm kweekschaal met 1 ml steriel 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Hak de tumor in kleine stukjes (1-5 mm) met een steriele scalpel en pincet.
   2. Voeg 1 ml steriel 1X PBS aan de kweekschaal en herhaal tritureren stap totdat het weefsel volledig gedissocieerd regelmatig vergt 3-4 ronden. Breng de weefselsuspensie (top tot een eindvolume van 5 ml met 1 x PBS) in een steriele buis en mechanisch homogeniseren met een dissociator zoals gentleMACS.
   3. Incubeer het gehomogeniseerde weefsel met collagenase (gebruik 2,5 mg / ml collagenase in 1X PBS) gedurende 60 min bij 37 ° C en centrifugeer 5 min bij 900 x g. Decanteer het supernatant en resuspendeer de celpellets in 10 ml compleet medium. Filter de celsuspensie door een 40 urn zeef en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 900 x g.
   4. Giet het supernatant en resuspendeer depellet met 5 ml van rode bloedcellen lysis buffer (ammonium-chloride-kalium, ACK) en incubeer de
   5. Resuspendeer de pellet in CSCs medium plaat op een met gelatine beklede schotel en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Deze stap zal er gewoonlijk fibroblastcellen die snel hechten aan de plaat te verwijderen.
   6. Verwijder de plaat uit de incubator en zorgvuldig te herstellen cel schorsing en kwantificeren van het aantal levensvatbare (trypan blauw-negatief) cellen met behulp van een hemocytometer. Daartoe meng de suspensie en pipet 20 ul van de suspensie in een Eppendorf buis. Voeg 20 pl (1: 1 verhouding) van trypan blauw om de cellen in de microcentrifugebuis en meng. Pipetteer ongeveer 10 gl van het mengsel op de hemocytometer.
   7. Tel alle duidelijke cellen binnen de vier kwadranten hoek van de telkamer voor levensvatbare celgetal. Opmerking: De levensvatbaarheid en de opbrengst aan cellen aanzienlijk kan variëren tussen tumormonsters. Voor PDAC monsters levensvatbaarheid varieert regelmatig between 45-70%, en weefsel stukken uit microscopische tumor monster met een diameter van 3-5 mm moet wijken voor ongeveer 5x10 ⁶ levensvatbare cellen.
2. Sphere Formation Assay en behandeling met metformine
   1. Neem het vereiste aantal cellen en voeg de juiste hoeveelheid CSCs medium tot een celconcentratie van 2000 cellen / ml te bereiden. Laat de celsuspensie niet te houden op het ijs niet langer dan 1 uur en goed gemengd voorafgaand aan de beplating.
   2. Voeg 500 pi 1X PBS aan de eerste en de laatste rij van een 24-wells plaat bevochtiging om te helpen minimaliseren medium verdamping. Zaad de cellen in ultra-low attachment cellen platen bij een dichtheid van 2000 cellen per putje in 1 ml tumor sphere medium (2.000 cellen / ml).
      Opmerking: Het aantal cellen voor tumor bol vorming assays kunnen variëren tussen tumortypes.
   3. Behandel minstens 4 putten met het voertuig (negatieve controle) en 4 putten bij elke toegewezen behandeling, bijv., 3 mM van metformine. Place de cellen in een incubator ingesteld op 37 ° C en leveren de cellen met 5% _CO2 gedurende één week.
      OPMERKING: De drager dient niet om de ongestoorde vorming van tumor bolletjes mogelijk worden gewijzigd, maar kan worden aangevuld met groeifactoren dagelijks omdat ze niet stabiel in kweekmedium.
   4. Om de dag toe te behandelen, bijv., 3 mM metformine of voertuig aan elk van de wells. Beoordelen van het aantal gevormde tumor bolletjes na 5 en / of 7 dagen door toepassing van een geautomatiseerde celtelinrichting die zorgt voor het tellen van grotere structuren (Figuur 2).
      OPMERKING: alleen tumor gebieden met ten minste 40 urn worden beschouwd en kunnen worden gecategoriseerd als klein (40-80 urn) of grote (80-120 pm), respectievelijk. De resultaten zijn weergegeven als het percentage tumor bollen gedeeld door het aanvankelijke aantal cellen gezaaid (bijvoorbeeld 2000 cellen).
3. Serial passage van de Eerste Generatie Tumor Spheres
   1. Na 7 dagen incubatie oogsten de tumor bolletjes met een 40 um cel zeef en centrifugeer ze gedurende 5 min bij 900 x g bij kamertemperatuur.
   2. Distantiëren de pellet van tumor sferen enkele cellen met behulp van trypsine, en opnieuw vouw de verkregen cel celsuspensie nog eens 7 dagen, zoals hierboven is beschreven (zie 2.2).

3. Metabolisme Analyse (ROS productie en Oxygen Consumption)

1. ROS productie
   1. In dit protocol hebben we carboxy-DCFDA als voorbeeld gebruikt om ROS productie te meten, omdat het is een betaalbare, snelle en meest gebruikte probe voor ROS detectie. Er zijn echter diverse andere sensoren en methoden die kunnen worden gebruikt voor deze test.
   2. Behandel tumor gebieden met metformine zoals beschreven in 2.2 Voor de toegewezen tijd. Aan het einde van de behandeling, oogst tumor bolletjes met een 40 urn zeef cel, centrifuge de cellen bij 900 g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 1 ml trypsin. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
   3. Zodra cellen singularized, centrifugeer bij 900 xg en resuspendeer de cellen in HBSS dat 2,5 uM carboxy-DCFDA. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C in het donker.
   4. Voorafgaand aan Flowcytometrieanalyse beschermen gekleurde cellen van licht als carboxy-DCFDA foto-geoxideerd geven van vals-positieve resultaten kunnen worden. Plaats de buizen op ijs tot analyse.
      OPMERKING: carboxy-DCFDA fluorescerend na reactie met een verscheidenheid van reactieve zuurstof en stikstof species, gedetecteerd in FL1 (ex 488nm, em 520 nm..).
2. Zuurstof Verbruik Measurement
   1. Voor dit protocol, zullen we de extracellulaire Flux Analyzer systeem van Seahorse Biosciences, als voorbeeld. Coat de gewenste celkweek plaat met een oplossing van 22,4 ug / ml van cellen en weefsels kleefstof voor 20 min bij kamertemperatuur. Spoel de putjes met water 2-3 maal voor de cellen te zaaien.
   2. Aan het einde van de behandeling, oogst tumor bollen met een 40 pm celzeef Centrifugeer de cellen bij 900 g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 1 ml trypsine. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
   3. Plaat singularized cellen in de celkweek plaat bij een dichtheid van 30.000 cellen / putje voor een 96 putjesplaat (eindvolume: 150 pi). Resuspendeer de cellen in Zuurstofverbruik assay medium bevattende 8 mM glucose en 2 mM natrium- pyruvaat.
   4. Centrifugeer de cellen op de bodem van de put door middel van spin centrifugeren van de putjes tot 100 xg bereikt is en laat de centrifuge stoppen met de rem uitgeschakeld. Keer de oriëntatie van de plaat en herhaal het proces. Breng de plaat tot een 37 ° C incubator zonder toevoeging van _CO2 gedurende 30 minuten.
   5. Ondertussen bereidt de cartridge voor de test. Elk goed heeft 4 verschillende injectoren te laden (25 ul / poort):
      1. Poort A: metformine. Tot een uiteindelijke concentratie van 3 mM te verkrijgen in de put, stelt een 8x oplossing (24 mM) en het uiteindelijke volume wordt 175ul na injectie van de haven A.
      2. Poort B: metformine. Om 3 mM voegen en het verkrijgen van een eindconcentratie van 6 mM in de put, stelt een 9x oplossing (27 mM) en het uiteindelijke volume 200 pl na injectie van port B.
      3. Port C: metformine. Om 3 mM voegen en een eindconcentratie van 9 mM verkrijgen in de put, stelt een 10x oplossing (30 mM) en het uiteindelijke volume wordt 225 gl na injectie van port C.
      4. Port D: rotenone 11 uM, 1 uM te verkrijgen als uiteindelijke concentratie in de put (11x). Opmerking: rotenone eventuele resterende mitochondriale activiteit volledig remt.
   6. Kalibreren van de cartridge en laadt de celkweek plaat. Voer de test met de standaard protocol van het mengen en meten.
   7. Bereken het percentage remming van de totale mitochondriale respiratie bereikt metformine als het percentage remming verkregen met rotenon (ingesteld op 100%).

4.Xenograft Model voor menselijk alvleesklier- in Immunogecompromitteerde Muizen

OPMERKING: Bestel voldoende aantallen vrouwelijke athymische naakt of andere, meer immunogecompromitteerde muismodellen zoals NOD-SCID, SCID-beige of NSG voor de experimenten ^33. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voor het experiment en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Voor subcutane tumoren gebruikten we minimaal 4 muizen per staat met een tumor per flank in totaal 8 tumors.

1. Xenograft Transplantatie
   1. Bereid tumor stukken uit de menselijke alvleesklier exemplaren kankerweefsel. Breng de tumor in een petrischaal en ontleden van het weefsel in kleine stukjes (2 mm in diameter, ~ 8 mm ³⁾ met een scalpel en pincet om het weefsel vast te houden. Dompel de verkregen stukjes in geleiachtige eiwitmengsel oplossing op ijs bewaard.
   2. Verdoven muizen met behulp van 1-3% isofluorane of andere inhalatieve of injecteerbare anesthetica.
      OPMERKING: Voordat u begint met een chirurgische procedure, ervoor te zorgen dat de muizen volledig zijn bewustzijn verloor door het stimuleren van de buikhuid of sleept met een paar splinter tang. Breng oogzalf tot droog voorkomen.
   3. Als de verdoving eenmaal in werking is getreden, veeg de achterkant van de muizen met-ethanol bevat huid antiseptische. Dien buprenorfine (0,05 mg / kg BW) vóór een chirurgische ingreep postoperatieve analgesie waarborgen.
   4. Til het rugvel met een tang, maak een 0,7-1,0 cm lange incisie met steriele micro schaar en vervolgens bot bereidt een subcutane pocket, waarbij een stuk van patiënt afgeleide pancreaskanker weefsel is geplaatst (~ 8 mm ^3).
   5. Sluit de wond met 1-2 huid nietjes. Verwijder ze na 7 dagen. Breng de muizen om hun kooien en bewaar ze op een verwarming pad of onder een warmtelamp totdat ze weer volledig actief.
   6. Na tumor implantatie, bewaken de muizen ten minste twee keer per week voor de groei van de tumor en de algemene tekenen van voortvloeiende morbiditeit zoals gegolfde bont, hunched houding en immobiliteit.
   7. Wanneer tumoren een gemiddelde grootte van 200 ^mm3 hebben bereikt, worden muizen gerandomiseerd respectievelijke behandelingen. Dien voertuig of metformine dagelijks via ip injecties (150 mg / kg BW) of via het drinkwater (150 mg / kg BW) met vergelijkbare effecten van de behandeling.
   8. Monitor tumorlast met een schuifmaat en bereken tumorvolume keer per week (meting van tumorvolume = 1/2 lengte x ademhaling x breedte).
   9. Offer de muizen eenmaal tumoren 1 cm in diameter hebben bereikt of muizen beginnen enige tekenen van ernstige pijn of ziekte zoals hierboven gespecificeerd.

Results

Metformine selectief richt Pancreatic CSCs

We hebben eerst de functionele effecten van metformine behandeling op de in vitro zelfvernieuwingscapaciteit van CSCs onderzocht. Hiertoe we bol vorming assays uitgevoerd met primaire humane pancreatische kankercellen geïsoleerd van PDAC weefsel resectie tijdens chirurgie. We zagen dat metformine sterk verminderde de grootte van gevormde bolletjes (Figuur 1A). Dit was waarschijnlijk door remming van de groei van de nakomelingen van de CSC, waaraan nog steeds het grootste deel van de cellen gevonden in gebieden zij alleen zijn verrijkt CSCs. Inderdaad, hoe langer bolletjes gekweekt zonder passage van hoe uitgebreider de expansie van meer gedifferentieerde nakomelingen zullen zijn. Zo vonden we metformin het aantal feitelijk gevormde bolletjes ongeacht hun grootte aanzienlijk dalen, die zich op een dosis-afhankelijke wijze suggereert sterke remming van de zelfvernieuwingscapaciteit van CSC's (data niet getoond). We vonden dat metformine bij 3 mM significant af van het aantal bolletjes gevormd (Figuur 1B). Om strengere studie van de lange-termijn effecten van metformine op de zelfvernieuwingscapaciteit van CSCs, we vervolgens gepasseerd het gevormde primaire werelden in secundaire en tertiaire sferen. Hoewel slechts primaire bolletjes werden behandeld met metformine, werd de vorming van gebieden in de tweede en derde doorgangen sterk toenemende mate verminderd, wat impliceert metformine inderdaad onomkeerbaar elimineerde de meeste CSCs (figuur 1C). Aldus onze gegevens toonden significante behandelingseffecten metformine op zelfvernieuwingscapaciteit primaire alvleesklier CSCs en dus moedigde ons verder mechanistische en in vivo studies uitgevoerd.

Metformine remt mitochondriale zuurstof consumptie en Induceert ROS productie

Sinds metformin bleek te fungeren als een mitochondriaal gif door gedeeltelijke remming van complex I activiteit we vervolgens de acute effecten van metformine op de cellulaire zuurstofverbruik in bol afgeleide cellen onderzocht. Hiervoor hebben we gekozen cellen afkomstig van twee representatieve PDAC primaire tumoren en mat het zuurstofverbruik in de tijd na achtereenvolgende injectie van 3 mM metformine (drie injecties) en 1 uM rotenon (één injectie). Zoals getoond in figuur 2A, metformine injectie induceerde een snelle en dosisafhankelijke afname in zuurstofverbruik, die aanzienlijk tussen de verschillende tumoren varieerde. We berekenden de residuele mitochondriale activiteit na behandeling met metformine door injectie rotenon, een krachtige remmer complex I, dat in staat is volledig remmen mitochondriale zuurstofverbruik. Gevoeligheid voor metformine qua mitochondriale zuurstofverbruik gecorreleerd met het vermogen om ROS productie gedefinieerd als een verplaatsing van het gemiddelde van het p inducerenning na behandeling met metformine (Figuur 2B, linker paneel), die gemakkelijk te kwantificeren (figuur 2B, rechter paneel). Zoals verwacht, de primaire cellen die het meest gevoelig voor remming van zuurstofconsumptie waren toonde ook de sterkste toename van ROS productie na behandeling met metformine. Aldus zijn deze metabolische in vitro experimenten demonstreren dat metformine targets CSCs door remming van hun afhankelijkheid van de mitochondriale functie, resulterend in een latere toename van mitochondriale ROS productie en eventueel inductie van apoptose.

Metformine Kraampjes PDAC Progression In Vivo

We eindelijk onderzocht de effecten van metformine in vivo met behulp van weefsel xenografts afgeleid van verschillende patiënten met PDAC. We namen een significante vermindering van tumorprogressie voor metformine behandelde muizen in vergelijking met de controlegroep, maar tumoren nooit volledig disappeared (Figuur 3). Vervolgens, tijdens lange-termijn follow-up van alle tumoren uiteindelijk recidief suggereert metformine weerstand van cellen overleven de vroege fase van de behandeling. Toch metformine behandeling, zelfs wanneer toegepast als monotherapie, aanzienlijk uitgebreid overleving in alle muizen.

Figuur 1. Metformine selectief richt de CSC. (A) Metformine verminderde de grootte van de bollen. Representatieve beelden van bolletjes verkregen na behandeling met de aangegeven doseringen van metformine gedurende 7 dagen (rechter paneel). Kwantificering van de bol grootte (n≥6) (linker paneel), de aangegeven nummers in abscissen as vertegenwoordigen individuele tumor. (B) Bol vorming capaciteit in aanwezigheid of afwezigheid van metformine gedurende 7 dagen (n≥6), de aangegeven nummers in abscisas vertegenwoordigen individuele tumor. (C) Vertegenwoordiger grafiek van CSC zelfvernieuwingscapaciteit in secundaire en tertiaire sferen van primaire alvleesklierkanker cellen. De bollen werden alleen behandeld tijdens de eerste generatie sfeer formatie voor een totaal van 7 dagen (n = 6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Metformine Behandeling Remt Zuurstof Verbruik en induceert ROS Production. (A) Metformine Bovendien remt zuurstofverbruik (OCR) van de bol afgeleide cellen. Twee verschillende PDAC secundaire bolletjes werden behandeld met metformine en OCR veranderingen werden gemeten door extracellulaire flux analyse. Rotenone injectie werd gebruikt als controle voor de totale mitochondriale OCR consumptie.X-as de zuurstof- verbruik in pmol zuurstof / hr genormaliseerd door het eiwitgehalte in elk putje. (B) PDAC gebieden in A werden gedurende 8 uur met metformine en ROS productie is beoordeeld door flow cytometrie middels carboxy-DCFDA. Links, vertegenwoordiger flowcytometrie percelen. Recht, samenvatting van de gegevens van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Metformine Kraampjes PDAC Progression In Vivo. Twee verschillende PDAC xenograft weefsels werden geïmplanteerd in immunogecompromitteerd muizen en behandeling werd toegekend na de eerste tumor take werd geverifieerd. Muizen werden behandeld met metformine (Met) toegevoegd aan het drinkwater (150 mg / kg body weight; gebaseerd op 5 ml van het waterverbruik per dag). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Met de opkomst en de daaropvolgende validatie van de CSC concept voor veel tumoren, is het gebied van de ontwikkeling van geneesmiddelen een nieuwe impuls gekregen, met het potentieel voor de ontwikkeling van efficiëntere behandelingen van kanker en vervolgens het verminderen van het risico voor de ziekte van recidive. Echter, het veld CSC is nog in een vroeg stadium en er moet meer in termen van begrip CSC oorsprong en voortplanting, en hun rol in het vormgeven van de tumor architectuur en het bevorderen van metastase te bereiken.

In deze context is het gebruik van reproduceerbare en betekenisvolle CSC assays en geïnformeerde interpretatie van verkregen data vormt een essentieel onderdeel van onze kennis van CSC biologie. Van vele biologische perspectieven, heeft bol vorming ontpopt als een zeer waardevolle test; Toch gebruikers moeten zich bewust zijn van de beperkingen om hun experimentele resultaten goed te interpreteren. Een belangrijk aspect om te overwegen nog voordat de evaluatie van de bol formatiegegevens is de oorsprong van het onderzochte monster, aangezien de verkregen uit verse patiënt afgeleide monsters leidt significant verschillend van die verkregen uit gevestigde kankercellijnen zijn.

Classic bol vorming assays omvatten enten cellen bij klonale dichtheid in ultralaag bevestigingsplaten en evalueren bol formatie in aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en / of basische fibroblastgroeifactor (b-FGF) verrijkt, maar serumvrij medium ^{21, 34.} Het kweekmedium samenstelling is ook een belangrijk punt van overweging. In onze ervaring ontdekten we dat DMEM / F12 aangevuld met B27, bFGF en glutamine in de afwezigheid van serum een ​​optimaal medium te groeien, uitbreiden en onderhouden van de CSC in ongedifferentieerde omstandigheden. We vonden dat in deze cultuur toestand (gemiddeld en ophanging) de cellen brengen grote hoeveelheden kanker stamcellen markers (inclusief CD133 +, CD44 + en CD24 +) en niet-differentiatie geassocieerde eiwitten niet uitdrukken (CK-20 En CK-19).

Een van de fundamentele uitgangspunten van deze assays is dat elke bol klonaal, dwz een bol gevolg van de groei van een stamcel. Echter, bollen zijn intrinsiek dynamische structuren die gevoelig zijn voor zelfs smelten bij lage dichtheid zaaien ³⁵ zijn. Plating cellen is een cruciale stap in het protocol en de dichtheid van een cel / put kan zeker de aggregatie probleem te omzeilen. Maar zelfs voor prospectief naargelang voorouders, dit regelmatig resulteert in een zeer lage vorming sfeer te wijten aan lage intrinsieke bol vorming activiteit en kan ook worden toegeschreven aan beperkt autocriene stimulatie als gevolg van verwatering effecten. In onze ervaring zagen we dat slechts 30% van de cellen uitgeplaat kunnen bolletjes vormen. We raden het gebruik van ten minste 100 cellen / putje om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.

Andere kweekmethoden groei CSC zijn gebaseerd op vaste of halfvaste 3D cultures (bijvoorbeeld op basis van matrigel, collageen of methylcellulose). Deze werkwijzen zijn gebruikt voor celbeweging en daaropvolgende celaggregatie ³⁶ beperken. Echter, elk van deze matrices beren hun eigen beperkingen. Bijvoorbeeld, matrigel een oplosbaar basale membraan geïsoleerd uit de Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumor en hoewel het extract lijkt de complexe extracellulaire tumoromgeving in veel weefsels, doet meerdere min of meer gedefinieerde groeifactoren die vaak maakt mechanistische bevatten studies regulerende elementen zeer moeilijk. Een ander punt van overweging is dat bol vormen capaciteit en stamcel functies niet uitwisselbaar termen ^34. Hoewel bepaalde stamcellen en voorlopercellen bleken te vertonen bol vormend vermogen ^37, niet bollen in vitro genereren niet in vivo stam / voorlopercellen functie uitgesloten. Bijvoorbeeld kan rustende stamcellen eenvoudigweg niet reageert op extracellulaire signalen die degeselecteerd in vitro kweekomstandigheden. Zo is op lange termijn in vitro en in vivo zelfvernieuwingscapaciteit van gezuiverd celpopulaties, bij voorkeur tijdens de seriële passage, moeten worden beoordeeld om te bewijzen of te weerleggen stamcel functie. In dit verband heeft de mogelijkheid om prospectief gelijktijdig propageren diverse populaties van stamcellen en progenitorcellen is een cruciaal aspect van de bol vormende assay en maakt deze assay zeer waardevol voor het gebied CSC; zolang de beperkingen in het achterhoofd worden gehouden voor de interpretatie van de verkregen gegevens.

Sphere-vormende assays zijn op grote schaal gebruikt om achteraf te identificeren stamcellen op basis van hun vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie bij de enkele cel niveau in vitro. De ontdekking van merkers die de toekomstige isolering van stamcellen en hun nakomelingen toelaten uit hun in vivo niche kunnen de functionele eigenschappen van gezuiverde populaties te definiëren. De combination van bol formatie test en de FACS is een succesvolle strategie om cellen van vast weefsel isoleren of verrijken specifieke subpopulaties van PDAC in de cultuur. Zo gelijktijdige expressie van EpCAM, CD24 en CD44 definieert een subpopulatie van CSCs bijwerken zelfvernieuwing, differentiëren en start een tumor, die de heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor. Hermann et al. toonde aan dat CD133 + cellen bezaten verhoogd proliferatief vermogen en CSC voorzien ^15. Andere merkers zijn ook gebruikt voor de karakterisering van CSCs: ALDH- 1 (Aldehyde dehydrogenase-1) expressie is geassocieerd met zeer tumorigene cellen in pancreaskanker ^38; cellen kunnen het DNA kleurstof Hoechst 33342 uitsluiten, genaamd side population (SP) cellen, hebben bewezen vermogen om tumoren te ³⁹ initiëren. Recent toonden we aan dat een subcellulair autofluorescentie compartiment kenmerkt een duidelijke populatie van menselijke cellen met exclusieve CSC trekken over verschillende tumortypes^40. Hoewel geen van deze merkers blijkt een zuivere populatie van CSCs selectief karakteriseren steeds complexere combinaties van markers gebruikt moeten worden voor FACS zuiveren verfijnder celpopulaties.

Veel vragen nog steeds over de precieze rol van CSCs in de oorsprong, progressie en resistentie van tumoren. Bijvoorbeeld, een manier om de kwestie van klonale evolutie pakken te bepalen of en hoe een CSC initieert een tumor, kon de patiënt te analyseren in verschillende stadia van de ziekte, en in het bijzonder volgen de aantallen CSCs tijdens en na de behandeling. Door het beantwoorden van deze vragen, kunnen we betekenisvolle vooruitgang van onze kennis van CSCs in solide tumoren te maken en drug therapieën om uiteindelijk te voorkomen progressie van de tumor en terugval te ontwikkelen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Counting Chamber/Hemocytometer	Hausser Scientific Co	3200
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement	Roche Innovatis	AG CASY Model TTC 45,60,150 μm
GentleMACS Dissociator	Miltenyi Co	130-093-235
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Co	130-093-237
24-well Ultra-low Attachment Plates	Corning	3474
100-mm tissue culture dishes	BD Falcon	353803
Cell strainer	BD Falcon	352350
15-ml polypropylene conical tube	BD Falcon	352097
50-ml polypropylene conical tube	BD Falcon	352070
1.5 ml sterile tubes	Eppendorf	0030 120.086
50 ml centrifuge tubes	Corning	430828
Sterile petri dishes, 10 cm dishes	Corning	353003
26 G needles	BD Falcon	300600
100 ul Hamilton Syringe	Hamilton Syringe Co	81075
Collagenase type IV	Stem Cell Technologies	7909
RPMI Medium 1640	Life technologies	11875-085
Penicillin/Streptomycin solution, 100X	Life technologies	SV30010
Metformin	Sigma	D150959-5G
L-glutamine, 200 mM, 100X	Life technologies	25030-081
D-Glucose	Sigma	G8270
100mM Sodium Pyruvate solution	Life technologies	11360-070
Seahorse Assay medium	Seahorse Bioscience	100965-000
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive	BD Biosciences	354240
Trypsin solution, 0.05%	Life technologies	25300054
B27 Supplement 50x	Life technologies	17504-044
Basic Fibroblast Growth Factor	Sigma	F0291
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9576
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12	Sigma	D8437
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Trypan Blue	Life technologies	15250-061
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate)	Life technologies	C-369
Rotenone	Sigma	R8875
Ethanol 70% (vol/vol)	Sigma	459844
Isofluorane	IsoVet, Braun	571105.8
Matrigel	BD Biosciences	35620
Sterile Cotton tipped applicator	Puritan medical
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges	Seahorse Bioscience	102416-100
XF96e Extracellular Flux analyzer	Seahorse Bioscience
Incubator with CO2 input
Micro scissors
Curved forceps
Splinter forceps
Caliper