Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het inkapselen van katabolische cellen, die lipiden consumeren voor warmteproductie in intra-abdominaal vetweefsel en de energiedissipatie bij obese muizen verhogen.

Samenvatting

Celinkapselende werd ontwikkeld om levende cellen te vangen binnen semi-permeabele membranen. De geënte ingekapselde cellen kunnen laagmoleculaire metabolieten wisselen in weefsels van de behandelde gastheer voor overleving op lange termijn realiseren. Het halfdoorlaatbare membraan maakt geënt ingekapselde cellen om afstoting te voorkomen door het immuunsysteem. De inkapselingsprocedure is ontworpen om een ​​gecontroleerde afgifte van bioactieve stoffen, zoals insuline, andere hormonen en cytokinen mogelijk. Hier beschrijven we een werkwijze voor het inkapselen van katabole cellen, welke lipiden om warmte en energiedissipatie (thermogenese) in de intra-abdominale vetweefsel van obese muizen verbruikt. Inkapseling van thermogene katabole cellen kunnen eventueel van toepassing zijn op de preventie en behandeling van obesitas en type 2 diabetes. Een andere mogelijke toepassing van katabole cellen kunnen detoxificatie van alcoholen of andere toxische metabolieten en milieuverontreinigende stoffen.

Inleiding

Toenemend aantal chronische ziekten ¹ heeft studies gestimuleerde op transplantatie van de therapeutische celpopulaties ^2. Syngene of allogene stamcellen zijn de meest gebruikte celtypen voor deze toepassingen ^2. Echter, deze behandelingen geen controle van differentiatie en migratie van stamcellen na implantatie mogelijk te maken en zijn niet kostenefficiënt. Transplantatie van genetisch gemodificeerde cellen met voordelige functies anticipeert verbeteren van de behandeling van vele ziekten. Echter, genetische modificaties cel herkend door het immuunsysteem van de gastheer derhalve deze behandelingen vereisen immunosuppressie ^3. Het inkapselen van cellen die insuline is ontwikkeld door Dr. Chang ^4. De techniek is gebaseerd op het inkapselen van cellen in alginaat druppels die worden ondergedompeld in een calciumchlorideoplossing. Alginaat moleculen omvatten mannuronzuur (M) en guluronzuur (G) en kunnen worden verbonden door Ca ²⁺. Na gelering worden de korrels gesuspendeerd a poly-L-lysine (PLL) oplossing. Tijdens deze stap, PLL bindt aan G en M in het alginaat moleculen die het membraan van de capsule vaststelt. De porositeit van het membraan van de capsule kan worden gemoduleerd door het variëren van de M en PLL concentraties, de incubatietijd en temperatuur. De binding van de PLL ook afhankelijk van de soort en concentratie van alginaat. Alginaat matrices verknoopt met Ca2 ⁺ -ionen zijn instabiel bij fysiologische omgeving of gemeen bufferoplossingen met een hoge concentratie fosfaat en citraat-ionen. Deze buffers kunnen halen Ca ²⁺ van het alginaat en vloeibaar te maken de kern. Vloeibaar maken van het alginaat kern biedt ruimte binnen de capsules voor cellulaire beweging en groei. Cellen ingekapseld in polyanionische alginaat met polykation poly-L-lysine (APL) impermeabel voor immunoglobulinen maar instroom van nutriënten en efflux van toxines. Deze eigenschappen APL's mogelijk te maken op de lange termijn survival van ingekapselde cellen na transplantatie in genetisch verschillende hosts. Elliott et al. Beschreven de overleving functioneren ingekapselde varkens pancreas cellen in een menselijke patiënt negen jaar na implantatie ^5.

Inkapseling technieken kunnen worden ingedeeld in microinkapseling (3-800 urn) en macro-inkapseling (groter dan 1000 urn). Microcapsules zijn duurzamer dan macrocapsules ^6. Sinds de ontdekking door Dr. Chang en collega's in 1964, is mikroinkapseling wijd gebruikt voor het inkapselen van anabole cellen produceren insuline, andere hormonen, en bioactieve moleculen ^7. Deze behandelingen geconfronteerd met verschillende uitdagingen in de gastheerweefsel inclusief fibrose en immuunrespons ^8. Aanvankelijk zijn de bijwerkingen die verband houden met de kwaliteit van biopolymeren opgelost. Echter, transplantatie van anabole cellen initieert steeds neveneffecten, zoals fibrose ten gevolge van hormonale overproductie buiten een gespecialiseerde klier.

In de afgelopen decennia, obesitas en type 2 diabetes heeft epidemische proporties ⁹ bereikt. Meer dan 30% van de volwassen mensen wereldwijd zijn overgewicht en obesitas ^10. Toegenomen intra-abdominale (IAB) vetvorming verhoogt incidentie van chronische ontsteking en bevordert Type 2 diabetes, hart- en vaatziekten, bepaalde vormen van kanker en andere morbidities ^11-13. Verschillende lijnen van bewijs suggereerde dat pathogenese geassocieerd met IAB vet kan worden afgewend door specifieke adipocyten. Recente studies hebben aangetoond dat transplantatie van subcutane adipocyten in IAB gebied kan verbeteren metabolisme en obesitas en insulineresistentie afname van knaagdieren in vivo ^14. Effectieve vermindering van obesitas en insuline resistentie is geassocieerd met thermogene adipocyten energie kunnen absorberen in de vorm van warmte ^15,16. Thermogene modificatie van adipocyten kan worden bereikt door stabiele transfectiegenen die deelnemen aan de mitochondriële ontkoppeling proton, zoals ontkoppelingseiwit 1 (UCP1) of genen die expressie van UCP1 en andere thermogene genen ^15,16. Onze recente studies aangetoond dat tekort aan aldehyde dehydrogenase 1 a1 (Aldh1a1) tot een thermogene verbouwing van lab vet dat obesitas en insulineresistentie vermindert in deze muizen ^17,18. Met name, inkapseling van thermogene Aldh1a1 deficiënte (Aldh1a1 - / -) preadipocytes medieert hetzelfde therapeutisch effect bij IAB vet in obese wildtype muizen, wat suggereert nieuwe therapeutische mogelijkheden voor de behandeling van lab vet ^18. In experimentele instellingen ingekapselde cellen kunnen de onderzoekers effecten van specifieke celpopulaties te bestuderen op een kosteneffectieve wijze ^19. Hier bespreken we de methode van inkapseling van een thermogene katabole cellijn en zijn laboratorium en therapeutische toepassing in een muismodel van obesitas. Het protocol beschrijft trie fasen microcapsule productie (Figuur 1): de vorming van het alginaat microkorrels (figuur 1A), de vorming van polykation poly-L-lysine (PLL) membraan op het oppervlak van de microbolletjes (figuur 1B), en het verwijderen van de alginaat kernen (figuur 1C).

Protocol

Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Ohio State University ethische commissies. Dierproeven werden goedgekeurd door IACUC protocol. Alle procedures werden uitgevoerd onder het niveau 2 bioveiligheid kast met laminaire stroming. We volgden alle standaard veiligheidseisen en procedures. De micro-inkapseling techniek voor bereiding van microcapsules werd uitgevoerd zoals beschreven ^{17, 18.}

1. Voorbereidingen van Materialen

1. Maak 10 ml van 2% natriumalginaat-oplossing in een autoclaaf behandeld fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl in water). Bereid 0,05% PLL oplossing in fysiologische zoutoplossing. Bereid deze oplossingen de dag vóór en roer 's nachts. Filtreer de oplossing met 0,22 urn filter vóór gebruik.
2. Bereid 50 mM natriumcitraat en 100 mM CaCl ₂ in 0,9% NaCl oplossingen autoclaaf hen.
3. Autoclaaf alle oplossingen, naalden, elektroden, en bekers. Grondig schone naalden met draden om te voorkomen dat verstopping.
4. De geschikte hoeveelheid cellen te gebruiken voor de capsules (102 microcapsules zijn noodzakelijk voor elke cm ² goed en er ongeveer 500 cellen per capsule ^18). Gebruik 1 ml natrium alginaat per twee miljoen cellen.
5. Bereid een "Fibroblast Growth Medium" met 10% kalfsserum en 100 U / ml penicilline / streptomycine in een hoge glucose (4500 mg / l glucose) Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM).
   1. Bereid een 'differentiatiemedium I "met 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml insuline, 1 uM dexamethason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methyl- xanthine, en 100 U / ml penicilline / streptomycine in DMEM.
   2. Bereid een "differentiatiemedium II 'met 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml insuline en 100 U / ml penicilline / streptomycine in DMEM.
6. Bereid lysis buffer die een proteaseremmer tablet per 10 ml Radio-immunoprecipitatie assay buffer (RIPA buffer).

2. Alginaat Microbeads Voorbereiding (figuur 1A)

1. Verwijder oude medium uit celkweek kolf. Cellen spoelen met 10 ml PBS. Breng cellen in suspensie met 0,25% trypsine-EDTA (2 ml per één samenvloeiing T175 kolf).
2. Tellen cellen in celsuspensie met een hemocytometer. Gebruik 10 ml aliquot van de celsuspensie en tel cellen volgens instructies van de fabrikant. Centrifugeer de overige cellen in medium centrifugatie bij 480 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
3. Suspendeer de celpellet in natriumalginaat zoals beschreven in stap 1.4. Breng de natriumalginaat-celoplossing een 5 ml spuit.
4. Verwijder luchtbellen uit de oplossing, voeg een 23-gauge naald en keren de injectiespuit een 1 ml luchtzak creëren.
5. Plaats een kleine beker (180 ml) met 144 ml van 100 mM _CaCl2 oplossing onder de naald uitloop van de encapsulator. Bevestig de elektrode naar de encapsulator met de punt approximdellijk 2,5 cm boven het oppervlak van de 100 mM CaCl _2-oplossing.
6. Plaats stevig de spuit met het natriumalginaat-celoplossing in de injectiepomp. De rubberen buis de opening van de spuit. Duw de zuiger totdat de natriumalginaat-cel-oplossing komt halverwege de buis. Stel de spanning 5,4 kV. Stel de 12,06 mm diameter op de injectiepomp. Pas de snelheid tot 3 ml / uur. Start de pomp. Zet de encapsulator en de spanning te handhaven op 5,4 kV.
7. Sluit het venster van de motorkap en geen onnodige trillingen tot het einde van de vorming van de alginaat microbolletjes. Immers oplossing gaat door de naald, stollen de alginaat bolvormige microbolletjes in 100 mM CaCl _2-oplossing gedurende nog 20 min voor het bekleden met PLL.

3. Coating Microkralen met PLL (Figuur 1B)

1. Verwijder de beker die de natriumalginaat-cell bolvormige microbolletjes en breng deze microbEADS in een 50 ml centrifugebuis. Verwijder CaCl _2-oplossing uit de microkorrel pellet.
2. Was de alginaat-cell bolvormige microbolletjes door toevoeging van 30 ml 0,9% NaCl. Schud de buis met de hand voorzichtig. Verwijder 0,9% NaCl met 25 ml pipet nadat de microbolletjes hebben neergeslagen door zwaartekracht. Herhaal nog twee keer voor een totaal van 3 wasbehandelingen.
3. Gebruik 10 ml van 0,05% PLL oplossing voor elke 1 ml van natriumalginaat-oplossing. Voeg 0,05% PLL en vortex bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 10 min.
   Opmerking: Meestal 10 min is voldoende voor PLL coating.
4. Na PLL jas is gevormd, verwijdert u de PLL-oplossing en was de capsules 3 keer zoals beschreven in 3.2.

4. Verwijdering van Alginate Core (figuur 1C)

1. Voeg 30 ml van 50 mM natriumcitraat-oplossing. Wacht 5 minuten of totdat alle natriumalginaat opgelost. Was capsules driemaal zoals beschreven in stap 3.1.1.
2. Verwijder het 0,9% NaCl, voeg 20 ml kweekmedium aan de 50 ml buisgeheel overgaat capsules bevatten de cellen een celkweekkolf. Behandel ingekapselde cellen onder standaard celcultuur omstandigheden ^18.

5. In vitro toepassingen voor xenograft en gastheercel interactie of Kinetiek van Afbraakproduct Influx / Efflux tussen cellen te bestuderen (figuur 2)

1. Cultuur gastheercellen op 24 well plaat tot samenvloeiing voor co-culturen. Gebruik de 'Fibroblast Growth Medium' te kweken preadipocyten.
2. Transfer microcapsules in 24 wells plaat met confluent gastheercellen. Microcapsules met een monolaag te bereiken (102 microcapsules / ^cm2 goed) toe te voegen.
3. Opwekken pre-adipocytdifferentiatie met Differentiatie Medium I. Elke 48 uur, verandering media om Differentiatie Medium II voor zes dagen. Lyse cellen in RIPA-buffer. Gebruik 50 ug eiwit per voorwaarde om eiwitexpressie te analyseren met behulp van Western blot.

6. In vivo toepassing voor treatment of Obesity (figuur 3)

1. Meng 4% isofluraan met zuurstof voor anesthesie en 2% isofluraan met zuurstof onderhoud van anesthesie. Bevestig adequate verdoving diepte door teen knijpen.
   1. Breng anti-jeuk zalf op de ogen van de hoornvliezen beschermen tegen uitdrogen.
2. Gebruik ingekapselde cellen die permanent zijn gelabeld met kunstmatige fluorescentie-eiwit, zoals groene fluorescentie eiwit (GFP).
3. Gebruik een 3 ml spuit en een 20 gauge naald om ingekapselde cellen te injecteren.
   1. Injecteer 0,5 x 10 ⁶ cellen gesuspendeerd in 0,2 ml PBS in elk IAB depot vet dat zich in het gebied tussen een intraperitoneale gonaden en nieren zoals getoond in figuur 3. Met dit volume PBS en aantal cellen voor muizen met een gemiddeld gewicht van 40 g. Stel celaantal en het volume in muizen die een ander gewicht of voor de bepaling van de dosis-afhankelijke effecten.

Resultaten

Figuur 1 laat zien dat elke stap van microbeads productie onder de microscoop kan worden gecontroleerd. Figuur 2A laat zien hoe co-cultuur adipocyten met een monolaag van ingekapselde cellen. Figuur 2B is een representatief voorbeeld van een kwantitatief onderzoek met adipocyte / microcapsules co-culturen die werden in hoofdstuk 5. Lysaten beschreven van adipocyten werden geanalyseerd met behulp van Western blot. Ingekapselde cellen werden niet geanalyseerd in dit exper...

Discussie

Verschillende werkwijzen zijn gebruikt om cellen, met inbegrip van drogen, extrusie en emulsie ¹⁹ te kapselen. In deze werkwijze worden de alginaatparels geëxtrudeerd door een naald, vervolgens met PLL en het alginaat kern wordt ontbonden de inkapseling te voltooien. Hoewel deze methode is gebruikt voor jaren, de vorming van de bolletjes met de gewenste grootte en bolvorm blijft een uitdaging. De grootte van de capsules is sterk afhankelijk van de viscositeit van natriumalginaat-oplossing, de extruder diamete...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Encapsulation device (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	Geen
KD scientific spuitpomp	KD scientific	780100Y	Geen
Olympus microscoop	Olympus Optical	IX70-S8F2	Geen
Natriumalginaat	Sigma	MKBP8122V	Geen
Poly-L-lysine hydrobromide (PLL)	Sigma	020M5006V	Geen
Calciumchloride	Sigma	SLBJ2662V	Geen
Natriumcitraat tribasisch dihydraat	Sigma	030M0200	Geen
Natriumchloride	Sigma	SLBD2595V	Geen
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	Geen
ATGL primaire antilichaam (van konijn)	Cell Signaling	2138S	Geen
Secundair antilichaam (anti konijn)	LI-COR	926-68071	Geen
Radio-immunoprecipitatie assay (RIPA) buffer	Boston BioProducts	D25Y6Z	Geen
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Sigma	RNBD2893	Geen
Trypsine	Gibco	25200-056	Geen
Cortizone 10 anti-jeukzalf	Cortizone 10	C4029138	Geen
Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Geen
Serum van pasgeboren kalf (CS)	Sigma	N4762	Geen
Foetaal bovien serum (FBS)	Sigma	F4135	Geen
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I0516	Geen
Dexamethason	Sigma	D4902	Geen
Insulin (runder)	Sigma	I5879	Geen
Protease remmer cocktail tabletten	Roche	4693159001	Geen