Transfectie in de macrofagencellijn, RAW264.7, is moeilijk vanwege de natuurlijke reactie van de cel tegen vreemde materialen. We beschrijven hier een zachte maar robuuste procedure voor het transfecteren van luciferase-reportergenen in RAW264.7-cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Transfecteren RAW264.7 cellen met een luciferasereportergen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Transfectie van gewenste genetische materialen in cellen is een onvermijdelijke procedure in biomedische onderzoeksstudies. Hoewel er talrijke methoden zijn beschreven, zijn bepaalde celtypen resistent tegen veel van deze methoden en leveren een lage transfectie-efficiëntie1 op, wat mogelijk onderzoek bij die celtypen belemmert. In dit protocol presenteren we een geoptimaliseerde transfectieprocedure om luciferase reportergenen als een plasmide-DNA in de RAW264.7 macrofagencellijn te introduceren. Er worden twee verschillende soorten transfectie-reagentia beschreven (op lipiden gebaseerd en op polyaminen gebaseerd) en er worden belangrijke opmerkingen gedurende het hele protocol gegeven om ervoor te zorgen dat de RAW264.7 cellen minimaal worden gewijzigd door de transfectieprocedure en dat alle verkregen experimentele gegevens de directe resultaten zijn van de experimentele behandeling. Hoewel de transfectie-efficiëntie mogelijk niet hoger is in vergelijking met andere transfectiemethoden, is de beschreven procedure robuust genoeg om het luciferase-signaal in RAW264.7 te detecteren zonder de fysiologische reactie van de cellen op stimuli te veranderen.
Inleiding
Transfectie van nucleïnezuren in cellen heeft een gevarieerde toepassing in het wetenschappelijk onderzoek. Voorbeelden omvatten (1) reporter genen tot de rol van verschillende genen elementen in genexpressie te bestuderen, (2) proteïne-expressieplasmiden om het eiwit van interesse tot overexpressie, en (3) kleine interfererende RNA genexpressie te downreguleren. Door het manipuleren van de expressie van bepaalde genen en het meten van het differentiële effect van dergelijke manipulaties kunnen onderzoekers de genfuncties in het gekozen biologische systemen afleiden. Niet alle transfectie werkwijzen dezelfde transfectie efficiënties, en zelfs dezelfde transfectie methode niet gelijkmatig 1 transfecteren alle celtypes. Vandaar dat verschillende transfectie werkwijzen ontwikkeld zoals calciumfosfaat methode, DEAE dextran, kationisch lipide transfectie, kationische niet lipide polymeer transfectie, elektroporatie, en nucleofectie 2,3.
Transfectie in macrofagen is especieel moeilijk te wijten aan het feit dat macrofagen professionele fagocyten die zeer gevoelig zijn voor vreemde materialen waaronder bacteriën afgeleide (gemethyleerd) DNA 4. Inbrengen van vreemd DNA activeert de Toll-like receptor 9 (TLR9) traject leidt tot de productie van cytokines en stikstofoxide 5,6. Deze geactiveerde macrofagen kan dan minder te reageren op behandeling die de onderzoekers gaan onderzoeken.
Ons laboratorium routinematig transfects de RAW264.7 macrofaag cellijn met luciferase reporter genen, en we hebben een protocol dat is ongevoelig luciferase signaal significant hoger dan de achtergrond zijn ontwikkeld, maar ook zacht genoeg om macrofagen in de rust toestand blijven. Het gedrag van de getransfecteerde cellen werden beoordeeld door een vuurvlieg luciferase reporter gen herbergt het promotorgebied van IκBζ (pGL3 IκBζ). IκBζ expressie opgereguleerd door de bacteriële celwand component lipopolyssacharide (LPS) 7,8 en neerwaarts gereguleerd door de anti-inflammatoire cytokine, interleukine-10 (IL-10) 8. Om rekening te houden transfectie variatie tussen putten, we co-transfecteren een controle-plasmide dat het Renilla luciferasegen (bv phRL-TK) voor normalisatie doeleinden. De beschreven protocol wordt geoptimaliseerd na het testen van verscheidene parameters waaronder timing van transfectie type transfectie reagentia, hoeveelheden transfectie reagentia en plasmide-DNA, en verhouding van transfectiereagens tot DNA plasmide. De twee transfectie reagentia in dit protocol zijn (1) een lipide-gebaseerde transfectie reagens en (2) een eiwit / polyamine gebaseerde transfectie reagens.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Plasmide DNA Purification
- Extraheer plasmide-DNA met een maxiprep kit volgens het protocol van de fabrikant. Resuspendeer plasmide DNA in 500 pl TE buffer.
- Voer een fenol: chloroform: isoamylalcohol extractie en isopropanol precipitatie om resterende bacteriële verontreinigingen te verwijderen. De aanwezigheid van LPS verstoort transfectie 9.
- Voeg 500 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1, pH 8) met het plasmide-DNA en schud krachtig gedurende 15 seconden. Fenol veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en is een verdoving, zodat brandwonden worden niet altijd gevoeld totdat er zware schade. Voer fenol: chloroform: isoamyl extractie in de zuurkast en wees voorzichtig.
- Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Transfer 350 ul van de bovenste waterige fase in een nieuwe 1,5 ml collectie buis.
- Voeg 350 ui TE-buffer om de buis die de onderste organische fase bevat. Schud krachtig gedurende 15 sec. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Transfer 350 ul van de bovenste waterige fase naar dezelfde 1,5 ml collectie buis.
- Voeg 70 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en meng. Voeg 700 ul 100% isopropanol. Meng goed en incubeer 10 min bij RT. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 Minat 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Voeg 500 pl 75% ethanol aan de pellet. Vortex monsters te mengen en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. DNA in de pellet.
- Open de dop van de buis en de lucht droog de pellet bij kamertemperatuur 5-10 min. De pellet moet doorzichtig geworden. Voeg 500 ui TE-buffer om de DNA pellet te resuspenderen. Verhit bij 50 - 60 ° C gedurende 10 minuten om het DNA pellet lossen.
- Meet de absorptie bij 260 nm (A260) en 280 nm (A280) met een spectrometer. Bereken de concentratie van DNA door de A260 waarde te vermenigvuldigen met 50 ng / ul. Beoordelen van de kwaliteit van het DNA door calculating van de A260 / A280-verhouding. 2.0 - DNA met een hoge kwaliteit moet een A260 / A280-verhouding van 1,8 te geven.
2. Cel Kweken en zaaien
- Culture RAW264.7 cellen in DMEM aangevuld met 9% foetaal kalfsserum (DMEM / 9% FCS) in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Tijdens elke passage, los van de cellen van de plaat door het continu pipetteren met een Pasteur pipet. Passage van de cellen om de 2 dagen, en zaad 1,5-2.000.000 cellen op een 10 cm weefselkweek behandeld gerecht als de voorraad. Ontdooi een nieuwe voorraad van cellen elke 5 - 6 weken.
- Op de dag van transfectie zaad 200.000 cellen per putje in een 24-wells plaat in een volume van 500 pl DMEM / 9% FCS. Incubeer de cellen gedurende 4 uur in 37 ° C incubator.
- Transfecteren cellen hetzij de lipide gebaseerde reagens (stap 3,1) of het eiwit / polyamine gebaseerde reagens (stap 3.2).
3. Transfectie
- Lipide-gebaseerde transfectie:
- Warmen de transfectie reagent Rt in het donker. Opwarmen serumvrij medium en DMEM / 9% FCS tot 37 ° C.
- Voeg 0,5 ug plasmide DNA met 50 gl serumvrij medium in een 1,5 ml buis. Voeg 2 pl transfectie reagens met de pipetpunt onder het oppervlak van de vloeistof. Vortex voor 6 sec.
- Laat het reagens / DNA mengsel in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Tijdens de 30 minuten incubatie, verwijder de media uit de put en voeg 250 ul van verse DMEM / 9% FCS aan elk putje.
- Na 30 min, voeg 250 pl DMEM / 9% FCS aan het serum / DNA mengsel. Meng goed door en neer te pipetteren.
- Voeg 300 pi van het verdunde mengsel in elk putje. Incubeer 2-4 uur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Verwijder transfectie-oplossing en voeg 500 pl DMEM / 9% FCS. Incubeer gedurende 24 - 48 uur op 37 ° C, 5% CO 2 incubator voor celstimulatie.
- Protein / polyamine-gebaseerde transfectie:
- Warmen serumvrijmedium en DMEM / 9% FCS tot 37 ° C.
- Voeg 0,75 pl transfectie reagens 18,75 gl serumvrij medium. Vortex kort te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 0,5 ul van 1 ug / ul DNA in de getransfecteerde verdunde reagens. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Tijdens de 10 minuten incubatie, verwijder media uit elk putje van de 24-well plaat en voeg 250 ul vers DMEM / 9% FCS aan elk putje.
- Na 10 min, voeg 250 pl DMEM / 9% FCS in het reagens / DNA mengsel.
- Voeg 270 ul van de verdunde mengsel aan de put. Incubeer in een 37 ° C en 5% CO2 incubator gedurende 2-4 uur.
- Verwijder transfectie-oplossing en voeg 500 pl DMEM / 9% FCS. Incubeer gedurende 24 - 48 uur op 37 ° C, 5% CO2 incubator.
4. cel stimulatie en Luciferase Assay
- Vervang media in de put met 250 ul vers DMEM / 9% FCS.
- Voeg 50 ul van LPS of LPS + IL-10 Bij de gewenste concentraties aan de put. Zet de plaat om de 37 ° C, 5% CO2 incubator. Stimuleer voor 2-6 uur.
- Verwijder stimulatie oplossing door aspiratie, wassen met ijskoud PBS, en voeg 200 ul 1x Passive Lysis Buffer. Rock bij RT gedurende 30 min. Schraap af en breng het lysaat 1,5 ml buisjes en verwijderen celresten door centrifugeren bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Overdracht 40 ul geklaard lysaat (supernatans) om een witte, heldere bodem 96-well plaat voor de bepaling van luciferase signalen volgens protocol van de fabrikant.
- Lees de luciferase signaal met een luminometer in het gehele zichtbare lichtspectrum.
5. Data Analysis
- Bereken de vuurvlieg: Renilla verhouding door deling van de afzonderlijke waarden van vuurvlieg luciferase door de waarden van Renilla luciferase uit elk putje.
- Bereken de vouw verandering door de vuurvlieg te verdelen: Renilla verhouding van de goed behandeld doordat van de onbehandelde put.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 vergelijkt de transfectie-efficiëntie van de twee transfectie reagentia RAW264.7. De lipide-gebaseerde reagentia gaf typisch ongeveer 25% transfectie terwijl de eiwit / polyamine-gebaseerde transfectie resulteerde in ongeveer 5% efficiency (figuur 1A). Het verschil in transfectie-efficiëntie werd ook waargenomen in luciferase signalen in RAW264.7 cellen getransfecteerd met de pGL3-IκBζ promotor reporter (Figuur 1B). Toevoeging van LPS aan deze getransfecteerde ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol hier beschreven is niet alleen richten op transfectie-efficiëntie, maar streeft naar een balans tussen efficiëntie en het behoud van de fysiologische toestand van de cellen te slaan. Specifiek onze procedure slaagt het minimaliseren van de toxiciteit van transfectie reagens en het maximaliseren luciferase-signaal.
Een kritische stap in het protocol is de gezondheid van de cellen. Overwoekerd culturen niet geschikt voor transfectie hun fysiologie veranderingen en continu kweken v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door een subsidie van Canadian Institutes for Health Research (CIHR). STC ontvangt een doctoraatsonderzoeksbeurs van de CIHR en de Michael Smith Foundation. EYS ontvangt een CIHR-beurs. Het CIHR Transplantation Training Program heeft ook afgestudeerde beurzen verstrekt aan STC, EYS en SS.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Elk maxiprep-kit werkt |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Fenol is giftig, dus werk indien mogelijk in de afzuigpunt. Gebruik de onderste heldere organische laag als er twee vloeistoflagen in de container ontstaan. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Verwarm in een waterbad van 37 °C voor gebruik. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Geïnactiveerd in een waterbad van 56 °C gedurende 45 min voor gebruik. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Verwarm tot minimaal kamertemperatuur voor gebruik. |
| XtremeGene HP DBA-transfectie reagens | Roche | 6366236001 | Verwarm tot kamertemperatuur voor gebruik. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Verwarm tot kamertemperatuur voor gebruik. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is inbegrepen in het Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
Referenties
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336(2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
