Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52814

⸱

25 maart 2015

 , 
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.

Samenvatting

Vanwege hun modulariteit en het vermogen om opnieuw geprogrammeerd te worden om een breed scala aan DNA-sequenties te herkennen, zijn Cys2-His2 zink-vinger DNA-bindende domeinen opgekomen als nuttige hulpmiddelen voor gerichte genoom engineering. Net als veel andere DNA-bindende eiwitten, bezitten zink-vingers ook de aangeboren capaciteit om celmembranen te passeren. We hebben onlangs aangetoond dat deze intrinsieke celdoorlaatbaarheid kan worden benut voor intracellulaire eiwitlevering. Genetische fusie van zink-vinger motieven leidt tot efficiënte transport van eiwit- en enzymvracht in een breed scala van zoogdierceltypen. In tegenstelling tot andere eiwittransductietechnologieën, remt levering via zink-vingerdomeinen de enzymactiviteit niet en leidt tot hoge niveaus van cytosolische levering. Hier wordt een gedetailleerd stapsgewijs protocol gepresenteerd voor de implementatie van zink-vinger technologie voor eiwitlevering in zoogdiercellen. Belangrijke stappen voor het bereiken van hoge niveaus van intracellulaire zink-vinger-gemedieerde levering worden benadrukt en strategieën voor het maximaliseren van de prestaties van dit systeem worden besproken.

Inleiding

Zeer efficiënte en veelzijdige eiwit levering strategieën zijn van cruciaal belang voor veel fundamenteel onderzoek en therapeutische toepassingen. De directe afgifte van gezuiverde eiwitten in cellen vormt een van de veiligste en eenvoudigste methoden om dit. 1,2 Unlike strategieën afhankelijk genexpressie van nucleïnezuren, eiwitten 5/3 levering geen gevaar dat mutagenese, onafhankelijk van de cellulaire transcriptie / translatie machines en zorgt voor een onmiddellijk effect. Echter, het ontbreken van eenvoudige en generaliseerbaar methoden voor begiftigt celpenetrerende activiteit op eiwitten routinematig verwart hun directe binnenkomst in cellen. Huidige werkwijzen voor intracellulair eiwit levering faciliteren zijn gebaseerd op het gebruik van natuurlijk voorkomende 6-8 of gemaakt cel penetrerende peptiden 9-12 supercharged transductie domeinen 13,14 nanodeeltjes 15 en liposomen, 16 virusachtige partikels 17,18 en polymere microsfeer materialen. 19 Helaas zijn veel van deze benaderingen worden gehinderd door lage cellulaire opname prijzen, 20,21 slechte stabiliteit, 22 onbedoelde celtype specificiteit, 23 lage endosomale ontsnapping eigenschappen 24 en toxiciteit. 25 Bovendien zijn veel eiwitten transductie technologieën verminderen de biologische activiteit van de geleverde eiwitten. 14

Ons laboratorium eerder aangetoond dat zink-vinger nuclease (ZFN) eiwitten - chimeer beperking endonucleases bestaande uit een programmeerbare Cys 2 -Zijn 2 zinkvinger DNA-bindende eiwitten en de splitsing domein van de FokI restrictie endonuclease 26-28 - zijn inherent cel- doorlaatbaar. 29 Dit verrassende celpenetrerende activiteit werd aangetoond dat het een intrinsieke eigenschap van de op maat ontworpen zink-vinger domein van een DNA-bindende platform dat heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor gerichte genoom en zijngineering, 30-32 en als het resultaat van de constellatie van zes positief geladen resten op het eiwit oppervlak. Inderdaad hebben verscheidene DNA-bindende eiwitten, waaronder c-Jun en de N-DEK blijkt een aangeboren vermogen om celmembranen bezitten. 33 Recentelijk ons laboratorium breidde deze resultaten en toonde dat de cel penetrerende werking van zink vinger (ZIF) domeinen kunnen worden ingezet voor intracellulaire eiwit levering. Genetische fusie van enkelzijdige of vingers ZIF domeinen specifiek eiwit lading tot efficiëntie dat veel conventionele celpenetrerende peptide afgiftesystemen overschreden opname. 34 Met name Zif-gemedieerde aflevering niet de activiteit van gesmolten enzymatische lading beschadigen en vergemakkelijkt hoge cytosolische levering. Tezamen zijn deze bevindingen tonen het potentieel van de Zif domein die een efficiënte en gemakkelijke afgifte van eiwitten en mogelijk diverse soorten macromoleculen in cellen.

Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol over het implementeren van ZIF technologie voor proteïne levering in zoogdiercellen gepresenteerd. We hebben eerder geconstrueerd een reeks een-, twee-, drie-, vier-, vijf- en zes vingers ZIF domeinen die het vermogen om DNA te binden, door substitutie van elk van de α-helix DNA-bindende residuen missen, maar kunnen leveren eiwitten in cellen 34 (figuur 1). De productie en overdracht van Emerald GFP (EmGFP) in HeLa-cellen met behulp van een twee-vinger ZIF domein wordt beschreven. Dit protocol is uitbreidbaar tot bijna elk eiwit dat oplosbaar expressie in Escherichia coli en bijna elk zoogdier celtype. Verwachte resultaten worden verstrekt en strategieën voor het maximaliseren van de prestaties van dit systeem worden ook besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Klonen

  1. Verkrijgen-alanine vervangen met twee vingers ZIF domeinen die zijn sub-gekloond in de dierenwinkel-28 expressie vector systeem en zijn beschikbaar op aanvraag (PET-2F-ZIF) beschikbaar. 34
  2. PCR versterken EmGFP uit het plasmide Emerald-pBAD met de primers 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; XmaI site in vet) en 3 'Sacl-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; Sac I-plaats in vet).
    1. Gebruik 5 ng template DNA, 10 ui 10X polymerasebuffer, 1 Units (U) van Taq DNA-polymerase, 0,2 mM van elke dNTP en 0,2 uM van elke primer in 100 ul oplossing met de resterende hoeveelheid uit gedestilleerd / gedeïoniseerd water . Gebruik de cycling condities: 95 ° C gedurende 5 min; 30 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 min; 72 ° C gedurende 10 min. Zuiver het PCR product door gel extractiop en bepaal DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer meet Abs 260 x 50 pg / ml.
  3. Digest pET-2F-ZIF en het insert codeert EmGFP met de restrictie-enzymen Xmal en SacI in aangeraden buffer gedurende 3 uur bij 37 ° C met 10 U enzym per 1 ug DNA. Visualiseer DNA door agarose gelelektroforese met een fluorescerende intercalerende kleurstof zoals ethidiumbromide.
  4. Zuiver het gedigereerde DNA door gelextractiekit en bepaal DNA-concentratie door een spectrofotometer meet Abs 260 x 50 pg / ml.
  5. Afbinden de gezuiverde EmGFP coderende DNA in 50-100 ng pET-2F-ZIF met 1 U van T4 DNA Ligase gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur. Voor de beste resultaten, presteren de ligeringsreactie met een 6: 1 insert-to-vector molverhouding.
  6. Dooi 50 ul van een chemisch bevoegde XL-1 Blue Escherichia coli-cellen op ijs en meng voorzichtig met 10-20 ng geligeerd pET-2F-ZIF-EmGFP.
  7. Keep on ice voor 30 min. Heat shock het mengsel bij 42 ° C gedurende 90 sec en herstellen de cellen in 2 ml Super Optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) gedurende 1 uur bij 37 ° C onder schudden.
  8. Verdeel 100 ui herstel cultuur op lysogenie bouillon (LB) agar plaat met 50 ug / ml kanamycine en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
  9. De volgende dag, enten 6 ml Super Broth (SB) of LB kweek die 50 ug / ml kanamycine met een kolonie van de LB agar plaat en cultuur O / N bij 37 ° C.
    Opmerking: Kolonie PCR met de primers 5'-Xmal EmGFP en 3'SacI-EmGFP kan worden gebruikt om positieve klonen voor Miniprep identificeren.
  10. Zuiver pET-2F-Zif-EmGFP door miniprep en bevestig plasmide door DNA-sequentiebepaling met T7 promoter (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Expressie en zuivering

  1. Ontdooi 50 ui chemisch competente BL21 E. coli-cellen op ijs en meng voorzichtig met 100 ng PET-2F-ZIF-EmGFP plasmid. Transformeren zoals beschreven in de stappen 1,7-1,8.
  2. De volgende dag, enten 10 ml LB medium dat 50 ug / ml kanamycine met een enkele kolonie en kweken O / N bij 37 ° C onder schudden.
  3. De volgende dag Verdun 10 ml O / N kweek in 1 liter LB medium aangevuld met 50 ug / ml kanamycine, 0,2% glucose en 100 uM ZnCl2. Groeien de kweek bij 37 ° C onder schudden tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,8 en induceren eiwitexpressie met 2 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Na 6 uur groei bij 37 ° C, oogst cellen door centrifugatie bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    Opmerking: Inductie omstandigheden zeer variabel en afhankelijk van de stabiliteit van de eiwitten tot expressie. Controleer de OD 600 elke 30 minuten totdat een OD600 van 0,8 is bereikt.
  4. Resuspendeer de celpellet in 5 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 pM ZnCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM MgCl2, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 10 mM imidazool, pH 8,0). Lyse de cellen op ijs door sonicatie met de volgende instelling: 50% vermogen, 4 min proces tijd met 5 sec aan / 10 sec uit intervallen. Oververhitting van de oplossing.
  5. Centrifugeer het cellysaat bij 25.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en breng het supernatant naar een nieuwe verzamelbuis. Voor de beste resultaten, presteren alle volgende stappen bij 4 ° C.
  6. Voer de bovenstaande vloeistof op een kolom vooraf gepakt met 1 ml geëquilibreerd Ni-NTA slurry. Spoel de hars met 20 ml wasbuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 pM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 en 30 mM imidazool, pH 8,0).
  7. Elueer het eiwit met 5 ml elutiebuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 pM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 en 300 mM imidazool, pH 8,0).
  8. Bufferuitwisseling het geëlueerde eiwit met opslagbuffer (50 mMTris-HCl, 500 mM NaCl, 100 pM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 en 10% glycerol, pH 8,0) en concentreer het eiwit ten minste 40 uM met een spin concentrator door centrifugatie volgens de instructies van de fabrikant.
  9. Bepaal eiwitconcentratie door BCA of Bradford assay. Meng 2 pl gezuiverde eiwitten met 2 pl 2 x SDS-PAGE loading dye, kookt bij 95 ° C gedurende 10 min en vervolgens oplossen van 4% -20% Tris-Glycine SDS-PAGE eiwit zuiverheid (figuur 2) te evalueren.

3. Eiwit Opslag

  1. Aliquot de geconcentreerde proteïneoplossing, flash bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Voor EmGFP fusie-eiwitten omvatten de buis met aluminiumfolie om het eiwit te beschermen tegen licht.
  2. Vermijd herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van de eiwitoplossing. Opmerking: Zif-gefuseerde eiwitten onder deze omstandigheden stabiel gedurende ten minste 1 maand. Ongepaste of> 4 maanden opslag kan leidenom eiwitprecipitatie of fotobleking van EmGFP.

4. eiwittransductiedomein

  1. Handhaaf HeLa-cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycoticum bij 37 ° C in een volledig bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
    Opmerking: Cellen gepasseerd meer dan 30 keer worden niet aanbevolen voor eiwittransductiedomein.
  2. Pre-coat een 24-wells plaat met 500 ul van 50 ug / ml poly-lysine 30 tot 60 min bij 25 ° C. Zaad cellen op een 24-wells plaat met een dichtheid van 2 x 10 5 cellen per putje. Op 24 uur na het uitzaaien, of wanneer cellen 80% -90% confluent Verwijder media uit elk putje en wassen met 500 ul voorverwarmde serumvrij DMEM (SFM).
  3. Aan elke well 250 ul van SFM die 2 uM Ziv-EmGFP eiwit en 100 uM ZnCl2. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: ZIF domeinen te voeren cellen primarily door macropinocytose, 34 dat is een energie-afhankelijk mechanisme. Daarom moeten de cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C voor een efficiënte eiwit internalisatie.
  4. Verwijder media uit cellen en was driemaal met 500 ul van calcium- en magnesium vrij Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) aangevuld met 0,5 mg / ml heparine. Opmerking: Heparine moet oppervlak gebonden eiwit dat stroomafwaarts analyses kunnen compliceren verwijderen.
  5. (Optioneel) Herhaal behandelingen tot drie maal voor een betere levering.
  6. Isoleer behandelde cellen direct na heparine was door digestie met 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 2 min. Resuspendeer losgemaakte cellen in 0,5 ml DPBS aangevuld met 1% FBS.
  7. Meet de fluorescentie-intensiteit van elk monster door flowcytometrie 35 met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) kanaal (figuur 3). Pas de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) aan de bevolking van plaatsenrente op schaal, zodat populaties met verschillende eigenschappen worden opgelost van elkaar.
  8. Verzamel 10.000 live evenementen voor elk monster en de gegevens met behulp van flowcytometrie data-analyse software. 36 Normaliseren fluorescentie van HeLa-cellen behandeld met ZIF-EmGFP om die cellen alleen behandeld met SFM analyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Twee vingers Zif-EmGFP fusie-eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in E. coli met> 95% homogeniteit en hoge opbrengsten (> 25 mg / ml) (Figuur 2). In het algemeen één of twee vingers kan ZIF fusie-eiwitten worden geproduceerd in hoeveelheden die nagenoeg identiek aan die van wildtype ongemodificeerde proteïne. In sommige contexten, vijf- en zes vingers ZIF fusieproteïnen niet in opbrengsten hoog genoeg voor verdere toepassingen worden geproduceerd.

Rec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier is een stap-voor-stap protocol voor eiwit aflevering met behulp van cel-permeabele zinkvinger (ZIF) domeinen gepresenteerd. De ZIF domein niet de activiteit van gesmolten enzymatische lading 34 te verminderen; maakt de productie en zuivering van eiwitten in opbrengsten nagenoeg identiek aan die waargenomen met ongemodificeerde eiwit; en kunnen eiwitten en enzymen in diverse celtypen te transporteren met rendementen traditionele celpenetrerende peptide of eiwit transductie domein te boven gaat. Samen vorm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (DP1CA174426 naar Carlos F. Barbas) en ShanghaiTech University, Shanghai, China (naar JL). Moleculaire graphics werden gegenereerd met behulp van PyMol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
XmaINew England BiolabsR0180L
SacINew England BiolabsR0156L
Expand High Fidelity PCR systemRoche11759078001
dNTPsNew England BiolabsN0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wellsLife TechnologiesEC6028BOX
2x Laemmli Sample BufferBioRad161-0737
T4 DNA LigaseLife Technologies15224-017
BL21 (DE3) Competent E. coliNew England BiolabsC2527I
IPTGThermo ScientificR0391
Zinc ChlorideSigma-Aldrich208086-5G
Kanamycin SulfateFisher ScientificBP906-5
GlucoseSigma-AldrichG8270-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-25
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-25G
DTTFisher ScientificPR-V3151 
PMSFThermo Scientific36978
Ni-NTA Agarose ResinQIAGEN30210
GlycerolSigma-AldrichG5516-500ML
ImidazoleSigma-AldrichI5513-25G
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitsEMO MilliporeUFC900324
DMEMLife Technologies11966-025
Fetal Bovine SerumLife Technologies10437-028
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies15240-062
24-Well Flat Bottom PlateSigma-AldrichCLS3527-100EA
Poly-LysineSigma-AldrichP7280
DPBS, No Calcium, No MagnesiumLife Technologies21600010
Heparan SulfateSigma-AldrichH4777
TrypsinLife Technologies25300054
HeLa cellsATCCCCL-2
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704

Referenties

  1. Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
  2. Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
  3. Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
  4. Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
  5. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
  6. Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
  7. Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
  8. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
  9. Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
  10. Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
  11. Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
  12. Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
  13. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
  14. Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
  15. Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
  16. Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
  17. Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
  18. Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
  19. Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
  20. Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755(2014).
  21. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
  22. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
  23. Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
  24. Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
  25. Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
  26. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
  27. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
  28. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  29. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
  30. Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
  31. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  32. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
  33. Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
  34. Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
  35. Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
  36. Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
  37. Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Flowcytometrieeiwitzuiveringgenfusiebacteri le expressieceltransductiefluorescent eiwitcytosolische aflevering
Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.