Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vanwege hun modulariteit en het vermogen om opnieuw geprogrammeerd te worden om een breed scala aan DNA-sequenties te herkennen, zijn Cys2-His2 zink-vinger DNA-bindende domeinen opgekomen als nuttige hulpmiddelen voor gerichte genoom engineering. Net als veel andere DNA-bindende eiwitten, bezitten zink-vingers ook de aangeboren capaciteit om celmembranen te passeren. We hebben onlangs aangetoond dat deze intrinsieke celdoorlaatbaarheid kan worden benut voor intracellulaire eiwitlevering. Genetische fusie van zink-vinger motieven leidt tot efficiënte transport van eiwit- en enzymvracht in een breed scala van zoogdierceltypen. In tegenstelling tot andere eiwittransductietechnologieën, remt levering via zink-vingerdomeinen de enzymactiviteit niet en leidt tot hoge niveaus van cytosolische levering. Hier wordt een gedetailleerd stapsgewijs protocol gepresenteerd voor de implementatie van zink-vinger technologie voor eiwitlevering in zoogdiercellen. Belangrijke stappen voor het bereiken van hoge niveaus van intracellulaire zink-vinger-gemedieerde levering worden benadrukt en strategieën voor het maximaliseren van de prestaties van dit systeem worden besproken.
Inleiding
Zeer efficiënte en veelzijdige eiwit levering strategieën zijn van cruciaal belang voor veel fundamenteel onderzoek en therapeutische toepassingen. De directe afgifte van gezuiverde eiwitten in cellen vormt een van de veiligste en eenvoudigste methoden om dit. 1,2 Unlike strategieën afhankelijk genexpressie van nucleïnezuren, eiwitten 5/3 levering geen gevaar dat mutagenese, onafhankelijk van de cellulaire transcriptie / translatie machines en zorgt voor een onmiddellijk effect. Echter, het ontbreken van eenvoudige en generaliseerbaar methoden voor begiftigt celpenetrerende activiteit op eiwitten routinematig verwart hun directe binnenkomst in c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Klonen
- Verkrijgen-alanine vervangen met twee vingers ZIF domeinen die zijn sub-gekloond in de dierenwinkel-28 expressie vector systeem en zijn beschikbaar op aanvraag (PET-2F-ZIF) beschikbaar. 34
- PCR versterken EmGFP uit het plasmide Emerald-pBAD met de primers 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; XmaI site in vet) en 3 'Sacl-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; Sac I-plaats in vet).
- Gebruik 5 ng template DNA, 10 ui 10X polymerasebuffer, 1 Units (U) van Taq DNA-polymerase, 0,2 mM van elke dNTP en 0....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Twee vingers Zif-EmGFP fusie-eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in E. coli met> 95% homogeniteit en hoge opbrengsten (> 25 mg / ml) (Figuur 2). In het algemeen één of twee vingers kan ZIF fusie-eiwitten worden geproduceerd in hoeveelheden die nagenoeg identiek aan die van wildtype ongemodificeerde proteïne. In sommige contexten, vijf- en zes vingers ZIF fusieproteïnen niet in opbrengsten hoog genoeg voor verdere toepassingen worden geproduceerd.
Rec.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier is een stap-voor-stap protocol voor eiwit aflevering met behulp van cel-permeabele zinkvinger (ZIF) domeinen gepresenteerd. De ZIF domein niet de activiteit van gesmolten enzymatische lading 34 te verminderen; maakt de productie en zuivering van eiwitten in opbrengsten nagenoeg identiek aan die waargenomen met ongemodificeerde eiwit; en kunnen eiwitten en enzymen in diverse celtypen te transporteren met rendementen traditionele celpenetrerende peptide of eiwit transductie domein te boven gaat. Samen vorm.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (DP1CA174426 naar Carlos F. Barbas) en ShanghaiTech University, Shanghai, China (naar JL). Moleculaire graphics werden gegenereerd met behulp van PyMol.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
Referenties
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
