We hebben een methode ontwikkeld om pluripotente stamcellen (PS-cellen) in alginaathydrogeelkapsels te inkapselen met behulp van een coaxiale mondstuk. Dit voorkomt dat cellen zich overmatig bundelen en beperkt de schuifspanning die cellen in suspensiecultuur ervaren. De techniek is toepasbaar op de massaproductie van PS-cellen evenals op onderzoek naar stamcelniches.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pluripotente stamcellen (PS-cellen) zijn het onderwerp van intensief onderzoek vanwege hun rol in regeneratieve geneeskunde en medicijnscreening. Echter, de ontwikkeling van een massacultuursysteem zou nodig zijn voor het gebruik van PS-cellen in deze toepassingen. Suspensiecultuur is een veelbelovende kweekmethode voor de massaproductie van PS-cellen, hoewel sommige problemen zoals het beheersen van aggregatie en het beperken van schurende stress van het kweekmedium nog steeds onopgelost zijn. Om deze problemen op te lossen, ontwikkelden we een methode voor calciumalginaat (Alg-Ca) encapsulatie met behulp van een coaxiale sproeikop. Deze methode kan de grootte van de capsules gemakkelijk beheersen door N2 gas mee te laten stromen. De beheersbare capsulediameter moet groter zijn dan 500 µm omdat een te hoge stroomsnelheid van N2 gas de opsplitsing van druppels veroorzaakt en dus capsules van heterogene grootte. Bovendien veroorzaakt een lage concentratie van Alg-Na en CaCl2 niet-bolvormige capsules. Hoewel een Alg-Ca capsule zonder coating van Alg-PLL gemakkelijk oplost, waardoor cellen kunnen worden verzameld, kunnen ze ook potentieel lekken uit capsules zonder een Alg-PLL coating. Inderdaad, een alginaat-PLL coating kan cellulair lekken voorkomen, maar is ook moeilijk te breken. Deze technologie kan worden gebruikt voor onderzoek naar de stamcel-niche evenals de massaproductie van PS-cellen omdat encapsulatie het micro-omgeving rondom cellen kan wijzigen, inclusief de extracellulaire matrix en de concentratie van uitgescheiden factoren.
Inleiding
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) zijn momenteel de bron van intensief onderzoek vanwege hun rol in de regeneratieve geneeskunde. Echter, enorme hoeveelheden cellen zijn nodig voor weefselregeneratie. Bijvoorbeeld ongeveer een miljard pancreascellen die nodig zijn voor een type 1 diabetespatiënt1. Echter, conventionele schotelcultuur kan slechts 1 × 105 cellen/cm2 verkrijgen, waardoor 1 m2 kweekoppervlak nodig is om voldoende stamcel-afgeleide pancreascellen te verkrijgen om een type 1 diabetespatiënt te behandelen. De ontwikkeling van een systeem voor de massacultuur van pluripotente stamcellen, zoals microcarrier2 en suspensiecultuur, is daarom vereist voor regeneratieve geneeskunde. Suspensiecultuur vertegenwoordigt een veelbelovende methode voor massacultuur, maar het controleren van de aggregatie van cellen is uitdagend in directe suspensieculturen van menselijke iPS-cellen3. Inderdaad, gesuspendeerde cellen worden blootgesteld aan afschuifspanning, wat celbeschadiging3 of differentiatie4 veroorzaakt.
Onderzoek naar hydrogel-gebaseerde incapsulatie is uitgevoerd om problemen met suspensiecultuur op te lossen. In hydrogelcapsules worden cellen beschermd tegen de stroom van het medium. Eerdere rapporten hebben het gebruik van verschillende soorten hydrogel, waaronder agarose5, PEG6 en alginaat (Alg), voor cellulaire incapsulatie gedocumenteerd. Alg-Ca-hydrogel is een van de meest bruikbare hydrogels voor cellulaire incapsulatie omdat Alg-Ca-hydrogel onmiddellijk wordt gevormd na het druppelen van alginaatoplossing in een CaCl2-oplossing en ook gemakkelijk wordt verteerd door enzymen of chelerende reagentia.
Hier hebben we een stabiel alginaat-incapsulatieproces voor iPS-cellen opgesteld met behulp van een co-axiale spuit. Door N2-gasstroom te gebruiken voor het vormen van druppels, is het mogelijk om cellen in uniforme capsules te incapsuleren zonder de noodzaak van andere reagentia zoals olie. In deze methode zijn de stroomsnelheid van N2 en de concentratie van zowel CaCl2 als alginaat de belangrijkste operationele omstandigheden die de grootte, vorm en uniformiteit van capsules beïnvloeden. Dit rapport toont de optimalisatie van deze operationele omstandigheden aan door het gebruik van een hogesnelheidscamera en een microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding Materials
- Bereid 10 mM HEPES buffer. Stel de pH tot 7,0 bij RT en voeg NaCl tot 0,9%.
- Bereid 5% alginaatoplossing en 10 mM EDTA-oplossing door het mengen van HEPES-gebufferde zoutoplossing bereid in 1,1. Stel de pH op 7,0 bij kamertemperatuur.
- Autoclaaf reagentia (1.1, 1.2) gedurende 20 minuten bij 121 ° C.
- Bereid gelatine beklede 60 mm schalen gelaagd met 1,2-2,0 x 10 6 muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen, die als feeder-cellen worden behandeld door incubatie in DMEM dat 10% FBS ES-gekwalificeerd en 10 ug / ml mitomycine C gedurende 90 - 120 min.
- Handhaaf muis geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen op de schaal met de voedingscellen in de aanwezigheid van 5 ml DMEM hoog glucose met 20% van de ES-gekwalificeerde FBS, 50 uM 2-mercaptoethanol, niet-essentiële aminozuren en antibiotica ( 100 eenheden / ml penicilline G natrium, 100 ug / ml streptomycine sulfaat, en 250 ng / ml amphotericin B).
- Seed 4 x 10 5 iPS cellen op een met gelatine beklede 60 mm schaal en incubeer ze op 37 ° C en 5% CO 2. Verander het kweekmedium dagelijks tijdens incubatie. Na 3-4 dagen kweken trypsinize cellen gedurende 1 min aan 500 ui 0,05% Trypsine bevattende 0,02% EDTA bij 37 ° C en 5% CO 2. Na dat, los cellen door de cultuur schotel tien keer te tikken.
- Voeg 2,5 ml DMEM met 10% van de ES-gekwalificeerde FBS en antibiotica (na dissociatie muis iPS cellen in enkele cellen door pipetteren met 1000 pi micropipet drie keer) centrifuge celsuspensie bij 160 x g gedurende 3 minuten en verwijder supernatant en tel de cellen . Na celtelling, reseed de verzamelde cellen op een met gelatine beklede schaal en incubeer gedurende 30 minuten op de iPS cellen te isoleren van de MEF cellen. Na het tellen van de cellen (gewoonlijk 1-3 x 10 6 cellen / schaal kunnen worden verzameld), reseed 4 × 10 5 iPS cellen opde schotel.
2. Cell Encapsulation in Alginate Hydrogel Capsules
- Verzamel de cellen door hetzelfde in 1.5 en 1.6 beschreven werkwijze. Na centrifugeren bij 160 x g gedurende 3 minuten, was de iPS cel pellet met HEPES-gebufferde zoutoplossing driemaal. Na het opnieuw suspenderen van de cellen in HEPES-gebufferde zoutoplossing, filter de celsuspensie door een 40 um cel zeef om grote aggregaten, die anders het mondstuk zouden kunnen verstoppen.
- Meng 2 ml celsuspensie in HEPES-gebufferde zoutoplossing en 3 ml van 5% Alg-Na oplossing. Tenslotte 5 ml celsuspensie binnen 3% Alg-Na oplossing wordt verkregen. Celdichtheid voorkeur meer dan 10 6 cellen / ml.
- Na het verzamelen van de celsuspensie in een spuit 5 ml, installeert een coaxiale spuitmond (Figuur 1A, B) op de spuit en zet deze op injectiepomp. Zend N 2 gasstroom (minder dan 1 liter / min) door de buitenste naald van de coaxiale spuitmond enverdrijven de celsuspensie door het binnenste mondstuk.
- Verzamel druppels in 250 ml 0,5% CaCl2-oplossing en wacht 10-20 minuten voor geleren onder roeren bij 60-90 rpm.
3. Behandeling van Alginate capsules (optioneel)
- Incubeer Alg-Ca capsules in 0,05% (w / v) poly-l-lysine (PLL) oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Na wassen van de capsules met HEPES-gebufferde zoutoplossing, incubeer ze in DMEM met 10% FBS om neutraliseren de elektrische lading op het oppervlak. Ze gebruiken als gecoate capsules (figuur 1C).
- Incubeer de capsules in HEPES-gebufferde zoutoplossing bevattende 10 mM EDTA gedurende 5 min. De met EDTA behandelde capsules worden gebruikt als holle capsules (figuur 1C).
4. Cultuur en Verzamel cellen in Alginate Capsules
- Incubeer de ingekapselde cellen bij 75 rpm met schudden bij 37 ° C en 5% CO 2gedurende 10 dagen.
- Verzamelen en incubeer de capsules in 10 mM EDTA bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 10 minuten. Verzamel cellen van het alginaat capsules zonder PLL behandeling door centrifugatie bij 1000 x g gedurende 3 min.
- Wanneer alginaat capsules worden behandeld met PLL, breken de Alg-PLL membraan door en neer te pipetteren ongeveer tienmaal met een naald bevestigd aan een injectiespuit en Centrifugeer bij 1.000 - 5.000 x g gedurende 5 min. Naalddiameter moet lager zijn dan capsulegrootte en 25 G (260 um) naalden worden gebruikt in dit experiment (600 urn)
- Na centrifugeren, verzamel celpellet strikt uit gebroken Alg-PLL membranen als u wilt mRNA monsters te verzamelen van cellen. Resterende Alg-PLL membranen mogelijk te voorkomen mRNA zuivering.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bij protocol 2.5, de verdreven alginaatoplossing vormt een bolvorm onmiddellijk na uitzetting (Figuur 2A - H). Wanneer de suspensie wordt uitgestoten met een N2-stroom lager is dan 1 l / min, de grootte van de druppeltjes gelijkmatig (figuur 2i). Indien de stroom N2 groter is dan 1L / min, de druppel breekt (figuur 2G, witte arrowed) en de grootte van de druppeltjes heterogeen (Figuur 2J). Op grond hiervan is het moeilijk om druppe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Inkapseling cultuur kan worden vergeleken met directe suspensiecultures. Suspensiekweek is een eenvoudiger manier om grote hoeveelheden pluripotente stamcellen dan inkapseling methoden te verkrijgen. Echter, het regelen van de aggregatie van cellen in suspensiekweek blijft een uitdaging. In inkapselingsmethode wordt cellulaire aggregatie beperkt capsules en kan daarom goed worden gecontroleerd. Een eerdere publicatie bleek dat ingekapselde cellen gevormd aggregaten van uniforme grootte, terwijl grote cel klonten v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door het S-Innovation project van de Japan Science and Technology Agency (JST), het Graduate Program for Leaders in Life Innovation (GPLLI) van de Universiteit van Tokyo, en de Research Fellowship for Young Scientists van de Japan Society for the Promotion of Science. We danken nac Image Technology Inc. voor het maken van films met behulp van een hi-speed camera.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Muis embryo fibroblast | Cel Biolabs | SNL 76/7 | |
| Muis geïnduceerde pluripotente stamcel | RIKEN Bio resource centre | iPS-MEF-Ng-20D-17 | |
| DMEM hoog-glucose | GIBCO | 11995 | |
| ES gekwalificeerd FBS | GIBCO | 16141079 | |
| Antibacteriële antibiotica | GIBCO | 15240 | |
| Niet-essentiële aminozuur | GIBCO | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | GIBCO | 21985-023 | |
| ESGRO leukemie remmende factor | Merck Millipore | ESG1107 | |
| Trypsine/EDTA | GIBCO | 25300 | |
| 26 G/16 G naald | Hoshiseido | ||
| 10 ml Syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| Natrium Chloride | Wako | 191-01665 | |
| HEPES | SIGMA | H4034 | |
| Natrium Alginate | Wako | 194-09955 | |
| Calcium Chloride | Wako | 039-00475 | |
| Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) | SIGMA | P7890 | |
| EDTA | DOJINDO | 345-01865 | |
| Sylinge pomp | AS ONE | ||
| Microscoop | Olympus | IX71 | |
| Microscoop | Leica | DM IRB | |
| Hispeed camera | nac image technology | Memrecam HX-3 |
Referenties
- Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
- Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
- Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
- Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
- Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
- Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
- Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
- Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
- Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
- Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
