Methodenartikel

Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

DOI:

10.3791/52835

⸱

2 juli 2015

 , 
1Center for International Research on Integrative Biomedical System, Institute of Industrial Science, The University of Tokyo

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een methode ontwikkeld om pluripotente stamcellen (PS-cellen) in alginaathydrogeelkapsels te inkapselen met behulp van een coaxiale mondstuk. Dit voorkomt dat cellen zich overmatig bundelen en beperkt de schuifspanning die cellen in suspensiecultuur ervaren. De techniek is toepasbaar op de massaproductie van PS-cellen evenals op onderzoek naar stamcelniches.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotente stamcellen (PS-cellen) zijn het onderwerp van intensief onderzoek vanwege hun rol in regeneratieve geneeskunde en medicijnscreening. Echter, de ontwikkeling van een massacultuursysteem zou nodig zijn voor het gebruik van PS-cellen in deze toepassingen. Suspensiecultuur is een veelbelovende kweekmethode voor de massaproductie van PS-cellen, hoewel sommige problemen zoals het beheersen van aggregatie en het beperken van schurende stress van het kweekmedium nog steeds onopgelost zijn. Om deze problemen op te lossen, ontwikkelden we een methode voor calciumalginaat (Alg-Ca) encapsulatie met behulp van een coaxiale sproeikop. Deze methode kan de grootte van de capsules gemakkelijk beheersen door N2 gas mee te laten stromen. De beheersbare capsulediameter moet groter zijn dan 500 µm omdat een te hoge stroomsnelheid van N2 gas de opsplitsing van druppels veroorzaakt en dus capsules van heterogene grootte. Bovendien veroorzaakt een lage concentratie van Alg-Na en CaCl2 niet-bolvormige capsules. Hoewel een Alg-Ca capsule zonder coating van Alg-PLL gemakkelijk oplost, waardoor cellen kunnen worden verzameld, kunnen ze ook potentieel lekken uit capsules zonder een Alg-PLL coating. Inderdaad, een alginaat-PLL coating kan cellulair lekken voorkomen, maar is ook moeilijk te breken. Deze technologie kan worden gebruikt voor onderzoek naar de stamcel-niche evenals de massaproductie van PS-cellen omdat encapsulatie het micro-omgeving rondom cellen kan wijzigen, inclusief de extracellulaire matrix en de concentratie van uitgescheiden factoren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) zijn momenteel de bron van intensief onderzoek vanwege hun rol in de regeneratieve geneeskunde. Echter, enorme hoeveelheden cellen zijn nodig voor weefselregeneratie. Bijvoorbeeld ongeveer een miljard pancreascellen die nodig zijn voor een type 1 diabetespatiënt1. Echter, conventionele schotelcultuur kan slechts 1 × 105 cellen/cm2 verkrijgen, waardoor 1 m2 kweekoppervlak nodig is om voldoende stamcel-afgeleide pancreascellen te verkrijgen om een type 1 diabetespatiënt te behandelen. De ontwikkeling van een systeem voor de massacultuur van pluripotente stamcellen, zoals mi....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding Materials

  1. Bereid 10 mM HEPES buffer. Stel de pH tot 7,0 bij RT en voeg NaCl tot 0,9%.
  2. Bereid 5% alginaatoplossing en 10 mM EDTA-oplossing door het mengen van HEPES-gebufferde zoutoplossing bereid in 1,1. Stel de pH op 7,0 bij kamertemperatuur.
  3. Autoclaaf reagentia (1.1, 1.2) gedurende 20 minuten bij 121 ° C.
  4. Bereid gelatine beklede 60 mm schalen gelaagd met 1,2-2,0 x 10 6 muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen, die als feeder-cellen worden behandeld door incubatie in DMEM dat 10% FBS ES-gekwalificeerd en 10 ug / ml mitomycine C gedurende 90 - 120 min.
  5. Handhaaf muis geïnduceerde pluripote....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij protocol 2.5, de verdreven alginaatoplossing vormt een bolvorm onmiddellijk na uitzetting (Figuur 2A - H). Wanneer de suspensie wordt uitgestoten met een N2-stroom lager is dan 1 l / min, de grootte van de druppeltjes gelijkmatig (figuur 2i). Indien de stroom N2 groter is dan 1L / min, de druppel breekt (figuur 2G, witte arrowed) en de grootte van de druppeltjes heterogeen (Figuur 2J). Op grond hiervan is het moeilijk om druppe.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inkapseling cultuur kan worden vergeleken met directe suspensiecultures. Suspensiekweek is een eenvoudiger manier om grote hoeveelheden pluripotente stamcellen dan inkapseling methoden te verkrijgen. Echter, het regelen van de aggregatie van cellen in suspensiekweek blijft een uitdaging. In inkapselingsmethode wordt cellulaire aggregatie beperkt capsules en kan daarom goed worden gecontroleerd. Een eerdere publicatie bleek dat ingekapselde cellen gevormd aggregaten van uniforme grootte, terwijl grote cel klonten v.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door het S-Innovation project van de Japan Science and Technology Agency (JST), het Graduate Program for Leaders in Life Innovation (GPLLI) van de Universiteit van Tokyo, en de Research Fellowship for Young Scientists van de Japan Society for the Promotion of Science. We danken nac Image Technology Inc. voor het maken van films met behulp van een hi-speed camera.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Muis embryo fibroblastCel BiolabsSNL 76/7
Muis geïnduceerde pluripotente stamcelRIKEN Bio resource centreiPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM hoog-glucoseGIBCO11995
ES gekwalificeerd  FBSGIBCO16141079
Antibacteriële antibioticaGIBCO15240
Niet-essentiële aminozuurGIBCO11140
2-mercaptoethanolGIBCO21985-023
ESGRO leukemie remmende factorMerck MilliporeESG1107
Trypsine/EDTAGIBCO25300
26 G/16 G naaldHoshiseido
10 ml SyringeTERUMOSS-10ESZ
Natrium  ChlorideWako191-01665
HEPESSIGMAH4034
Natrium AlginateWako194-09955
Calcium ChlorideWako039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000)SIGMAP7890
EDTADOJINDO345-01865
Sylinge pompAS ONE
MicroscoopOlympusIX71
MicroscoopLeicaDM IRB
Hispeed cameranac image technologyMemrecam HX-3

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
  2. Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the exp....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CalciumalginaatcapsulesStikstofgasstroomPoly L lysinecoatingEDTA behandelingCelaggregatiecontroleVermindering van schuifspanningStamcelniche

Gerelateerde artikelen